The expert technical assistance of C&#233;line Gr&#252;ninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplin&#228;res Zentrum f&#252;r Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universit&#228;t Erlangen-N&#252;rnberg, and the University Library of Erlangen-N&#252;rnberg.

Xenopus의 난자 된 cRNA의 미세 주입 1. 격리 <ol><li> 성인 여성의는 Xenopus laevis의에서 난자를 얻습니다. 0.2 % MS222에있는 동물을 마취시키다, 작은 복부 절개를 통해 난소 엽 (叶)을 잘라 내다. </li><li> 칼슘 무료 OR2 용액 (표 1의 제조법)에 용해 클로스 트리 디움 histolyticum에서 2 형 콜라의 600 ~ 700 U / ㎖로 3 ~ 4 시간 동안 19 ° C에서 소화 효소에 의해 난소 로브에서 난자를 분리합니다. </li><li> 선택을위한 솔루션이 포함 된 높은 나트륨에 두눈 현미경 페트리 접시에 defolliculated 난자를 배치 (ND96를 : 레시피를 표 1). </li><li> 스테이지 V-VI 난자를 선택하고 파스퇴르 피펫을 가진 다른 배양 접시에 놓습니다. 참고 : 무뚝뚝한 파스퇴르 피펫을 난자의 손상을 방지하기 위해 불타는에 의해. </li><li> cRNA를 (예를 들어, 0.2 NG 당 αβγENaC 서브 유닛)와 난 모세포를 주입한다. RNase가없는 물에 cRNAs을 녹입니다. 참고 : 총각각의 난자에 주입 부피는 46 NL입니다. </li><li> (표 1에서 제조법 ND9) 판매자는 난자의 ​​나트륨 로딩을 방지하기 위해 낮은 나트륨 용액에 19 ° C에서 난 모세포를 주입했다. 박테리아의 성장을 방지하기 위해 100 U / ㎖ 페니실린 나트륨 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 설페이트 용액 보조 식품. 조심스럽게 손상되거나 죽은 난자의 양을 제한하고 cRNA를 주입 한 후 이틀 동안 목욕 솔루션으로 채워진 12 잘 플레이트의 우물에서 개별 소규모 그룹을 유지하기 위해 난자를 처리합니다. </li></ol> 2. 두 전극 전압 클램프 실험을 수행 <ol><li> 사후 2 일후 난자를 측정한다. </li><li> ND96 솔루션 중력 공급 살포 시스템과 아밀로 라이드 (2 μM)를 포함 ND96 솔루션을 다른 주사기 하나의 주사기를 채우십시오. 마운트 50cm 난자 목욕 챔버 위에 주사기. 참고 : ENAC 억제제 아밀로 라이드의 농도는 자사의 IC (50)보다 20 배 높은 것으로 선택되었다 </서브&gt; (100 NM). </li><li> 150 W의 할로겐 형광 근원을 켜고 쌍안 현미경으로 좋은 시각화를 허용하는 난자 목욕 챔버 위 10cm로 조정합니다. 그런 흡입 켜고 난자 욕 챔버의 단부에 흡입관을 조정한다. 튜브를 superfusion하는 흡입 튜브 반대를 찾습니다 &#39;어댑터 난자 목욕 입력. 주 : 흡인력 난자를 superfusing 용액의 연속적인 흐름을 지원하기에 충분해야한다. </li><li> IV 중력 유동 제어 장치를 사용하여 3-5 ㎖ / 분 각 용액 superfusion 속도를 조정한다. 난자 목욕 챔버 어댑터 superfusion 튜브를 연결합니다. </li><li> &lt;1 μm의 팁 직경을 얻기 위해 마이크로 피펫 풀러와 유리 모세관을 당깁니다. 그런 다음 3 M의 KCl과 함께 ~ 1 / 4에 모세 혈관을 채우십시오. 참고 : 전극 홀더의 실버 와이어의 염소 부분의 KCl 용액에 침지되어 있는지 확인합니다. 모세관의 끝 부분에 공기 방울을 확인합니다. 기포의 압력 측정을 손상저항 부유 용량을 증가시켜 별 개로. </li><li> 현재의 전극 홀더와 전압 전극에 모세 혈관을 삽입하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용 ND96 포함 아밀로 라이드 (2 μM) 솔루션에 배치합니다. </li></ol> 아밀로 라이드에 민감한 전체 셀 전류의 3. 측정 <ol><li> 제로 V의 m 및 V 지점을 조정함으로써 전압 전극 (V의 m) 및 전류 전극 (V 전자)의 전극 전위는 버튼 오프셋 NOTE :. 저항 V의 m 및 0.5을 측정하는 전극 용 1-2 MΩ되어야 현재 주입 전극 -1 MΩ. </li><li> 전압 감지 전극에 근접 목욕 챔버로 난자를 놓습니다. 참고 : 이러한 전송 단계를 수행하는 동안 난자를 손상시키지 마십시오. 난자를 전송하는 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 난자에게 피펫의 가장자리의 손상을 방지하기 위해 불타는에 의해 무디게해야한다. </li><li> OO을 찌른다모두 미세 전극을 부드럽게 cytes. </li><li> -60 mV 범위 앰프에서 유지 가능성을 설정하고 차트 레코더의 전원을 켭니다. 솔루션을 포함하는 아밀로 라이드 (2 μM)를 켭니다. 참고 : 현재는 약 0 ± 0.5 μA해야한다. 큰 누설 전류가 새는 말뚝으로 찌르는 형벌을 나타냅니다. 따라서 이러한 난자는 거부되어야한다. 또한, 아밀로 라이드 (2 μM)의 존재에 측정 된 누설 전류는 αβγ-WT는 난자를 표현 αβγ 돌연변이 ENAC 측정에게 난자를 표현하는 유사해야합니다. 이것은 돌연변이 채널의 아밀로 라이드 - 민감성에 영향을주지 않는 것을 나타낸다. </li><li> 녹음을 시작합니다. 필요한 경우 게인을 조정합니다. </li><li> 측정 된 전류가 안정적으로 고원에 도달 한 후, 아밀로 라이드 무료 솔루션으로 변경. 참고 : 현재의 흔적 하향 현재 편향 안쪽 전류, 세포에 세포 측면에서 양의 전하의 이동, 즉 (나 +)에 해당합니다. </li><li> AF현재 고원이 (후 ~ 60 초)에 도달 할 터, 다시 아밀로 라이드 함유 용액에 superfusion을 전환합니다. 난자의 전류가 초기 기준 전류에 도달하면, 전압 클램프를 해제하고 부드럽게 전극을 철회. </li><li> , 말뚝으로 찌르는 형벌의 사이트에서 세포막의 재 밀봉을 허용 프로테아제 무료 ND96 솔루션의 100 ~ 150 μl를 포함하는 96 - 웰 플레이트 잘 하나에 난자를 배치합니다. </li><li> 5 분 후, 30 분의 인큐베이션 시간 동안 용액을 함유하는 프로테아제 또는 프로테아제가없는 대조 용액에 난자를 옮긴다. 주 : 배양 시간은 단백질 분해 효소와 공부 채널에 따라 달라집니다. </li><li> 배양 단계는 현재의 측정을 반복 한 후 (3.2 및 아래 참조). 참고 : 단백질 분해 효소 용액에서 배양 한 후 난자의&gt; 90 %를 측정 할 수있다. </li></ol> 4. 바이오 티 닐화 분석 <ol><li> 선택하고 두눈 현미경으로 결함이있는 난자를 폐기합니다. 참고 : 주사를 사용ED는 전류 측정 및 바이오 티 닐화 실험에 대해 동일한 배치에서 난자. </li><li> 실험에있는 그것의 사용하기 전에 적어도 20 분 동안 실온에서 비오틴을 유지합니다. </li><li> 솔루션을 준비 : ND96와 ND96는 적절한 단백질 분해 효소를 포함. 그 라벨로 간략하게 난자의 부상을 방지하기 위해 팁을 불타는에서 파스퇴르 피펫을 준비합니다. 참고 : 여기에, ND96에서 단백질 분해 효소 키모 트립신 2 ㎍ / ml를 사용합니다. 해법의 교차 오염을 방지하기 위해 별도의 피펫으로 각 그룹을 치료. </li><li> RT에서 단백질 분해 효소를 함유하는 2.5 ml의 제어 ND96 또는 ND96로 6 - 웰 플레이트의 각 웰을 입력합니다. 그런 다음 잘 당 30 난자를 입금하고 실온에서 30 분 동안 그들을 품어. 참고 : 다음 절차는 항상 얼음에 샘플을 유지하는 것이 중요합니다. 모든 원심 분리 단계에서 4 ℃에서 수행된다 </li><li> 2.5 ML의 ND96 (각 그룹은 세척 단계 3 우물을 필요로한다)과 새로운 6 - 웰 플레이트의 각 웰을 입력하고 비오틴 무게. 참고 : 2.5 밀리그램의 비타민 B 복합체 P어 잘 (1 ㎎ / ㎖)가 필요합니다. 25 ML의 바이오 티 닐화 버퍼 표 1 (레시피)에서 바이오 티 닐화 버퍼 (10) 그룹 (즉, 25 밀리그램의 비타민 B 복합체 ()에 비오틴을 디졸브. </li><li> 잘 2.5 ML의 ND96 가득에 난자의 각 그룹을 전송합니다. 전송 남아있는 단백질 분해 효소를 씻어 ND96와 두 개의 추가 우물에 순차적으로 난자. ND96에서 5 분 동안 난자를 품어. </li><li> 잘 들어있는 2.5 ml의 비오틴 솔루션으로 난자를 전송하고 15 분 동안 교반과 ( &#39;통&#39;)와 함께 그들을 품어. 참고 : 비타민 B 복합체 용액의 희석을 방지하기 위해 피펫 전송 ND96을 최소화합니다. </li><li> 바이오 티 닐화 반응을 중지도 포함 2.5 ML 담금질 버퍼 (표 1의 제조법)으로 난자의 각 그룹을 전송합니다. 그리고, 또한 2.5 ml의 버퍼 해소하고 부드러운 교반과 함께 5 분 동안 품어 포함 된 두 번째 우물에 난자의 각 그룹을 전송할 수 있습니다. </li><li> 손상되거나 죽은 난자를 제거합니다. 주 :다음 절차에 대한 그룹 별 난자의 같은 번호를 선택합니다. </li><li> 1.5 ㎖의 플라스틱 microcentrifuge 관에 난자의 각 그룹을 전송합니다. 참고 : 전송 급냉 버퍼의 양을 최소화합니다. </li><li> 그 후, 단백질 분해 효소 억제제와 보완 (레시피는 표 1 참조) 1 ㎖ 용해 버퍼에 27 G 바늘을 통해 전달하여 난자를 용해. </li><li> 1500 X g에서 10 분 동안 용 해물을 원심 분리기. </li><li> 기음 상등액 0.5 % 트리톤-X-100, 0.5 % NP40을 함유 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브로 옮긴다. 나머지 펠렛을 폐기하십시오. 참고 : 상층 액은 바이오틴 플라즈마 막 단백질 및 비 - 바이오틴 세포 내 단백질을 포함하고 있습니다. </li><li> 얼음에 20 분 동안 마이크로 원심 튜브를 품어. 반복적 와류이 기간 동안 튜브 완전히 NP40 및 트리톤-X-100에있는 단백질을 분해한다. </li><li> 1,500 X g에서 3 분 동안 난자 그룹 당 아가로 오스 비즈의 원심 분리기 100 μL. 후원심 분리 비즈 솔루션에서 뜨는을 제거하고 버퍼 구슬 평형을 용해 완충액으로 3 회 세척한다. </li><li> 비즈 바이오틴 단백질의 결합을 허용하는 4.13에서 제조 된 단백질 세제 솔루션을 포함하는 각 microcentrifuge 관에 세척 구슬의 피펫 100 μL. </li><li> 4 ℃에서 오버 헤드가 회전 O / N과 마이크로 원심 튜브를 품어 </li><li> 1,500 X g에서 3 분의 microcentrifuge 튜브를 원심 분리기. 그런 다음 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 참고 : 세포 내 단백질은 비오틴으로 표시되지 않습니다. 상층 액을 -20 ℃에서 저장 될 수있다 구슬을 대기음하지 마십시오. </li></ol> 웨스턴 블롯 분석에 의한 세포 표면에서 ENAC 분열 파편의 5. 검출 <ol><li> 용해 버퍼로 구슬을 세 번 세척하고 2X SDS-PAGE 샘플 버퍼의 100 μl를 추가합니다. 참고 : 샘플은 -20 ° C에 저장하거나 바로 웨스턴 블롯 분석을 제조 할 수있다. </li><li> 종기의5 ~ 95 ° C에서 최소 및 얼음에 다음 장소 튜브 amples. </li><li> 3 20,000 XG에 분 새로운 microcentrifuge 관에 뜨는을 피펫을위한 원심 분리기 샘플. 참고 :이 상층 액은 난자의 세포 표면에서 비오틴 세포막의 단백질을 포함하고 있습니다. </li><li> 세포 표면에 절단 조각을 조사하기 위해 서양 얼룩에 의해이 상층의 30 μl를 분석합니다. </li><li> 적절한 겔 (8 %, 10 %, 12 %가 추궁 절단 단편의 분자량에 따라서)을 사용하여 SDS-PAGE (소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동)에 의해 바이오틴 단백질을 분리. </li><li> 세미 드라이 블로 팅에 의해 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 막에 단백질을 전송합니다. </li><li> (그림 3과 13 참조) C-말단에있는 항원에 대항 인간 γENaC에 대한 특이 항체를 가진 막을 조사. </li><li> 보조 반으로 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 표지 염소 항 - 토끼 항체를 사용하여몸. </li><li> 화학 발광 신호를 감지합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 원고에서 성공적으로 단백질 분해 효소에 의해 ENAC의 활성화를 기본 메커니즘을 연구하기 위해 적용된 방법 론적 접근 방식은 8,13를 설명한다. 잘 확립는 Xenopus laevis의 난자 발현 시스템은 기능적으로 표현 ENAC에 사용되었다. ENAC 기능은 종래의 2 전극 전압 클램프 기법으로 평가 하였다. 부위 특이 적 변이는 기능적으로 관련된 프로테아제 절단 부위를 식별하기 위해 사용 하였다. 전기 생리 측량으로 병렬로 수행 바이오 티 닐화 실험은 가능한 ENAC의 외관은 단백질 분해 활성 전류와 세포 표면에 제품을 절단 상관시키는 제. 현재 활성의 시간 경과와 세포 표면에 단백질 분해 절단 조각의 모양 간의 상관은 단백질 분해 활성 채널의 개념을 지원한다. 두 전극 전압 클램프 녹음 O의 말뚝으로 찌르는 형벌을 필요로두 개의 미소 전극과 ocyte. 이 절차는 일반적으로 각각의 난자에 한 번만 수행됩니다. 그러나, 난자 명백 손상없이 초기 전체 - 셀 전류 기록 후 미세 전극을 제거하게 실현되었다. 실제로, impalements의 사이트에서 세포막은 몇 분 이내에 다시 봉인이 나타납니다. 따라서, 처음 두 전극 전압 클램프 측정을 완료 한 후, 미세 원심 분리 튜브 또는 충전 96 - 웰 플레이트의 웰에 두 전극 전압 클램프 설정의 실험 유량 챔버로부터 난자를 전송하는 것이 가능하다 테스트 또는 제어 솔루션의 작은 양. 이후, 동일한 난자 유동 챔버로 다시 전송 될 수 있고 제 두 전극 전압 클램프 측정을 수행하기 위해 다시 찔 수있다. 현저하게, 중재 ENAC 전류 난자는 대조액에 유지 제 1 및 제 2 측정 간의 많이 변화하지 않았다. 단백질 분해 효소 함유 졸의 난자의 대비, 배양에서첫 번째 측정 이후의 ution가 두 번째 측정에서 증가 ENAC 매개 전류 (그림 2)의 결과. 이 발견은 단백질 분해 채널 활성화를 나타냅니다. 하나의 난자에 두 개의 별도의 전류 측정을 수행하는 것은 난자가 시험 용액의 소량의 시간 가변 길이 두 측정 사이 프로테아제 또는 다른 약리학 적 제제에 노출 될 수있는 이점을 제공한다. 대량 비용 및 / 또는 사용할 수없는 제, 예를 들어, 정제 된 단백질 분해 효소 제제를 사용하는 경우 중요합니다. 에이전트의 제한 여부는 지속적으로 분당 몇 밀리리터의 유속으로 난자를 superfusing에 필요한 테스트 솔루션의 큰 볼륨으로 불가능 (또는 감당할 수없는) 연속 두 전극 전압 클램프 녹음에서 사용할 수 있도록 할 수 있습니다. 또한, 연속적인 두 전극 전압 클램프 측정은 잘 알려진 신동 의해 제한된다자연 채널 런의 enon 또한 ENAC (15)에 대해 설명했다. 반면, 한 시간 이상까지 두 개의 별도의 측정 사이의 솔루션을 테스트하기 위해 난자를 노출하는 것은 일반적으로 (그림 4A 참조) 문제가있는 것은 아닙니다. 마지막으로, 같은 난자에서 수행 두 개의 연속 측정은 약물 효과의 쌍을 관찰 할 수 있습니다. 그것은 일반적으로 이온 채널의 표현에서 관찰 된 난자, 사이의 높은 변동성의 문제를 줄일 수 있기 때문에, 난 모세포 (단백질 분해 효소 처리 및 차량 처리)의 두 개의 분리 된 그룹의 짝이 측정을 통해 장점이 있습니다. 페어링 관측과 제 측량 데이터를 정상화 할 가능성이 적은 난자 약리 제의 상당한 효과를 입증하는 실험 그룹별로 필요하다. 데이터의 정규화는 쉽게 다른 이온 통로 발현 수준 따라서 상이한 기준 전류 (도 2D와 난자의 다른 배치로부터의 데이터를 요약 할 수있다). 이 접근법은 또한 이온 채널 활성은 (도 2 참조) 제 측량으로부터 먼저 차량 처리 제어 난자에 안정적으로 유지하는 것이 입증하기 위해 분명히, 제어의 실험이 필요하다. 단백질 분해 현재 활성화가 세포 표면에 제품을 절단 ENAC의 외관과 상관을 입증하기 위해, 바이오 티 닐화 접근법은 원래 해리스 등에 의해 기재된. 구가 사용될 수있다. 이 절차는 (프로토콜 절에 상세하고도 4에 도시 된 바와 같이) 및 프로테아제 ENAC 중재 전류의 후속 활성화가 절단 단편의 시간 종속 외형으로 평행을 이룬다 채널의 노출을 발휘하도록 하였다. 바이오 티 닐화 방법은 세포 표면에서의 전체적인 증​​가 또는 막 단백질의 감소에 대한 분석을 허용한다. 따라서,이 방법은 단백질 분해 효소 및 다른 PHAR의 영향을 조사하는 것이 적합하다원형질막에 또는 채널 검색시 채널 삽입시 macological 에이전트. 또한, 바이오틴 세포막 단백질의 웨스턴 블롯 분석은 허용 단백질 단편 (예를 들어 단백질 분해 ENAC 단편) 또는 기능적으로 관련 될 수있는 글리코 실화 패턴의 변화의 검출. 결론적으로, 방법의 조합은 ENAC 중재 전체 - 셀 전류에 프로테아제 자극 효과를 조사하고 광범위한 애플리케이션에 유용 할 수 ENAC의 발생과 상관 관계가 세포 표면에 제품을 절단 입증하는데 사용. 특히,이 방법은 다른 이온 채널, 수송 또는 횡단 수용체 (예 : 단백질 분해 효소 활성화 수용체 갈 거예요)의 규정에 대한 비슷한 질문을 해결하기 위해 적합 할 수있다.

프로테아제는 복잡한 규제 신호 전달 경로에 관여 매우 정교한 프로테아제 캐스케이드로, 소화의 문맥에서 단백질의 잘 알려진 단백질 가수 분해에 이르기까지 여러 가지 생리적 반응에 관여하는 효소이다. 단백질 분해 효소가 자신의 촉매 활성 부위에 따라 일곱 개 그룹으로 분류됩니다 아스파라긴산, 아스파라긴, 시스테인, 글루탐산, 메탈로, 세린, 트레오닌 단백질 분해 효소. 다른 프로테아제는 항상 단백질의 일차 구조로부터 예측하기 쉽지 않은 별개의 절단 부위를 표적으로한다. MEROPS 데이터베이스 ( <a href="http://merops.sanger.ac.uk/">http://merops.sanger.ac.uk/는</a> ) 단백질 분해 효소와 그 우선 절단 부위의 넓은 범위에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 기능적으로 관련이 절단 부위는 부위 특이 적 변이를 이용하여 식별 될 수있다. 그것은 잘 ENAC의 단백질 분해 처리 일의 활성화의 중요한 메커니즘이라고 설립특정 이온 채널 1,2입니다. 흥미롭게도, 관련 산 감지 이온 채널 1A (ASIC1a)의 기능은 또한 프로테아제 3-5에 의해 수정 될 수 있다는 증거가있다. 현재는 단백질 분해 채널 분열 다른 이온 채널 또는 수송의 활동을 조절에 관련된 생리 학적 역할을하는지 여부 의문 남아있다. 그러나, 잘 단백 분해 절단은 G 단백질 결합 수용체, 프로테아제 활성화 된 수용체 (PARS)의 그룹을 활성화하는 것이 확립 6. 여러 세린 프로테아제 (예 : 채널 활성화 단백질 분해 효소 (CAP1-3), 키모 트립신은, 트립신, furin, 플라스, 호중구 엘라 스타 제, 및 칼리 크레인)은 단백질 가수 분해 ENAC이 활성화하는 것으로 나타났다. 세린 프로테아제 외에, 프로테아제의 다른 그룹은 단백질 분해 ENAC 활성화에 관여 될 수있다. 사실, 최근의 데이터를 보여줍니다 메탈의 meprin-β 7 시스테인 프로테아제 카 텝신-S (8)는 또한 할 수있다 ACTIVA테 ENAC. 그러나, ENAC 활성화를위한 (병리) 생리 학적으로 관련 단백질 분해 효소가 결정되는 유지하고 조직에 조직과 다를 수 있습니다. 프로테아제가 우선적으로 아미노산 서열의 특정 부위에서 절단하는 것으로 알려져있다. 예를 들어, 세린 프로테아제는 키모 트립신, 방향족 아미노산은 페닐알라닌 및 티로신 잔기 클 리빙 후에 특정 절단 패턴을 도시한다. 염기성 잔기의 라이신 또는 아르기닌 후에 이에 대하여, 세린 프로테아제는 트립신 우선적 클리브. 부위 특이 적 돌연변이 유발에 의해 생성 된 돌연변이 인간 γENaC 구문을 사용 heterologously 난자 발현 시스템에서 발현 ENAC 기능적으로 관련이 절단 부위는 8-13를 식별 할 수있다. 격리 된 난 모세포에 세 ENAC 소단위 (αβγ)를위한 cRNA를 주입함으로써, ENAC 기능적으로 이들 세포에서 발현 될 수 있고, 세포막에 존재하는 채널의 활성을 측정 할 수있다두 전극 전압 - 클램프 기술을 이용하여. 이뇨제 아밀로 라이드, 특정 ENAC 억제제, 아밀로 라이드를 구분 ENAC 중재 전체 - 셀 전류 성분 (ΔI AMI)를 사용하여 비특이적 누설 전류 나 다른 이온 채널 실시한 전류로부터 분리 될 수있다. 따라서, ΔI AMI 값은 전체적인 ENAC 활동을 반영 아밀로 라이드의 부재시 기록 된 해당 전체 - 셀 전류에서의 아밀로 라이드의 존재하에 측정 된 전체 - 셀 전류를 감산함으로써 결정될 수있다. 단백질 분해 효소가 ENAC에 자극 효과가 있는지 여부를 테스트하기 위해, ΔI AMI는 즉, 이전과 단백질 분해 효소 함유 용액에서 난자의 배양 후, 동일한 난자에 두 번 측정한다. 두 번째 측정에 대한 첫 번째에서 ΔI AMI의 증가는 단백질 분해 ENAC 활성화를 나타냅니다. 키모 트립신은 극대 또는 난자 발현 시스템에서 2,14 ENAC을 자극하는 것으로 알려져 확인 합니하는데 사용될 수있다RM이 단백질 분해 ENAC 활성화는 난자의 주어진 배치에서 감지합니다. 전체 - 셀 전류의 측정과 병행, 바이오 티 닐화 방법 9 ENAC의 외관과 상관이 세포 표면에 조각을 절단 ΔI AMI의 증가는 단백질 분해 효소에 난자의 노광시 탐지 여부를 조사하기 위해 사용 하였다. 세포 표면의 단백질은 비오틴으로 표시되며 뉴트라 비딘 표지 아가로 오스 비즈 바이오틴 결합 단백질에 의해 세포 내 단백질에서 분리 될 수있다. 바이오틴 단백질은 서양 얼룩에 의해 분석 될 수있다. 세포 표면에서 γENaC 절단 단편 γENaC의 C-말단에서 에피토프에 대항 특이 적 항체를 사용하여 검출 될 수있다. 기능적으로 중요한 절단 부위 (들)을 식별하기 위해, 절단 부위는 부위 특이 적 변이를 이용하여 변이 수 예측. 야생형 및 돌연변이 채널들로부터 난자를 사용한 병렬 실험에서 비교AME 배치. 이러한 방법론적인 접근법과는 ENAC 중재 전체 - 셀 전류의 단백질 분해 활성은 세포 표면에 조각을 절단 ENAC의 시간 종속 외관과 상관 것을 처음으로 입증 하였다. 이러한 결과는 채널 분열 및 채널 활성화 사이의 인과 관계를 제안합니다. 또한,이 전극의 전압 - 클램프 기법, 플라스 민을위한 기능적 관련 절단 부위, 13 키모 트립신 및 카 텝신 S-13과 조합 추정 절단 부위의 부위 특이 적 변이를 사용하는 것이 확인되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1446">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bath Clamp Headstage for OC-725C-V</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cold light source - Schott KL 1500 LCD&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Schott&#160;</td>
			<td>#SCOC150200EU</td>
			<td>brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#ESW-F10v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">left micromanipulator; MM-33L</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIH 1600 - computer interface</td>
			<td style="width:223px;">HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:644px;">magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA)</td>
			<td style="width:223px;">ALA Scientific Instruments, HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>heat=550; velocity=22; time=200&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">right micromanipulator; MM-33R</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Series Electrode Holder (45&#176;, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#E45w-f10vh&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STAT 2 IV Gravity Flow Controller</td>
			<td style="width:223px;">Conmed</td>
			<td>#P-S2V-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution</td>
			<td style="width:223px;">Schmalz</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INFUJECT 60ml pump syringes for solutions</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#22050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Injekt-F for lysing the oocytes</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#9166033V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">standard wall borosilicate tubing with filament&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td>#BF150-86-10</td>
			<td>outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:223px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:119px;">#11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21217</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">NeutrAvidin Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#29200</td>
			<td>Neutravidin-labeled agarose beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP40 (Nonidet P-40)</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roti-Load 1 (2&#215; SDS-PAGE sample buffer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>#K929.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of proteolytic activation of the epithelial sodium channel (enac) by combining current measurements with detection of cleavage fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel&#8217;s &#947;-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (&#916;Iami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of &#947;ENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a &#947;ENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in &#947;ENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

세린 프로테아제 플라스는 ENAC 매개 전류를 활성화 할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 개별 ENAC 발현 난자의 ΔI AMI는 단백질 분해 효소가없는 (제어)에서 난자의 30 분의 배양 (그림 2A) 또는 플라스 함유 용액 (그림 전후에 결정되었다 도 2b)이 전극 전압 - 클램프 기술 (도 1 참조)을 사용. 플라스에 노출을 측정 모든 난자에 ΔI AMI 증가했다. 반면, 제어 실험에서, 단백질 분해 효소가없는 솔루션 ENAC 발현 난자의 30 분의 배양 효과는 경미한 (그림 2 C, D)을했다. 따라서,이 방법을 사용하여 플라스 의하여 ENAC 중재 전류의 자극이 검출 될 수있다. ENAC 매개 전류의 활성화뿐만 아니라,시 추정 절단 부위를 돌연변이의 효과를 연구하기 위해 채널의 분열에, WT-ENAC에 키모 트립신의 효과는 그에 비교 하​​였다변이 된 프로 스타와 플라스 절단 부위와 돌연변이 ENAC (γ의 RKRK178AAAA, K189A). 채널 키모 트립신에 의해 활성화뿐만 아니라 ENAC 모양 세포 표면에 제품을 절단의 타임 코스는 다른 프로테아제 배양 시간 (도 4a)를 사용하여 조사 하였다. 이것은 돌연변이 채널 지연 및 키모 트립신에 의한 ENAC 중재 현재의 활성을 감소 시킨다는 것을 증명 하였다. 이것은 완전히 쪼개진 서브 유닛에 대응하는 67 kDa의 낮은 분자량 γENaC 절단 단편의 지연 외형으로 평행을 이룬다. 절단 조각은 C-말단에있는 항원 (그림 3)에 대한 감독 γENaC 항체를 사용하여 검출 하였다. 이 방법 론적 접근 ENAC 중재 전류의 단백질 분해 활성의 타임 코스가 세포 표면에서 67 kDa의 γENaC의 분열 생성물의 모양 (도 4 B, C)와 상관 관계가 있음을 보여준다. 이 개념을 지원단백질 분해 채널 절단 및 채널 활성화 13 사이의 인과 관계 링크를 클릭하십시오. 더욱이, 세포 표면에서 전류 측정 및 γENaC 단편의 검출을 결합하여이를 변이 된 절단 부위가 단백질 분해 채널 활성화에 기능적으로 관련이 있다는 것을 입증 하였다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. heterologously Xenopus의 표현 ENAC에 단백질 분해 효소의 자극 효과를 결정하는 절차 난자를 laevis의. ENAC 활동이 아밀로 라이드에 민감한 전체 셀 전류 성분 ΔI AMI를 측정하여 추정된다. <img alt="그림 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig2highres.jpg" width="400" /> 그림 2. 플라스는 ENAC 매개 CURREN을 자극ENAC을 표현 난자의 TS. 인간의 ENAC을 표현 (AD) 난 모세포는 단백질 분해 효소가없는 솔루션 (제어) 또는 플라스 (10 ㎍ / ㎖) 함유 용액에 30 분 동안 배양 하였다. (-) 전에 ΔI AMI를 결정하고, 이후에 (+) 배양, 난자가 -60 뮤직 비디오의 개최 가능성은 고정 된 (A, B) 난자 하나의 배치에서 4 대표 전체 셀 전류 흔적.. 아밀로 라이드 (AMI)는 검은 색 막대로 나타낸 바와 같이 구체적으로 ENAC을 억제하기 위해 목욕 솔루션에 존재했다. (C)는 각각의 난자에서 얻은 데이터 포인트가 선으로 연결되어있다. (D)와 유사한 실험의 개요 C. 열 같이 표현 ΔI AMI에 상대적으로 자극 효과가 부화하기 전에 측정 된 초기 ΔI AMI (ΔI 아미 초기)에 30 분 배양 (ΔI AMI 30 분) 후 측정 ΔI AMI의 비율로 계산. 열이 내부 숫자 표시측정 된 각각의 난자의 수. N은 난자의 다른 배치의 수를 나타냅니다. (이 그림에서 수정 된 [Haerteis 등 2012 세대 J Physiol 140, 375-389, 간접 :. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="그림 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig3highres.jpg" width="400" /> 채널은 세포막에 도달하기 전에 골지 - 연관의 convertase의 furin 의한 단백질 분해 활성 및 사용 된 항체의 결합 부위에 대한 γENaC 소단위 보여주는 절단 부위의도 3. 모델. 단백 분해 절단은 생합성 경로에서 ENAC 성숙을 위해 중요하다. 76 kDa의 단편을 furin 의한 단리는 γ-서브 유닛의 C-말단에서 에피토프에 대하여 접근 및 바이오 티 닐화 된 항체를 사용하여 세포 표면에서 검출 될 수 후. 단백질 분해 EN의 중요한 마지막 단계교류 활성화는 아마 γENaC이 67 kDa의 절단 조각의 결과로 furin 사이트에 지역의 말단에서 세포 외 단백질 분해 효소 (예 : 플라스 또는 키모 트립신)에 의해 절단되어 세포막에서 열립니다. (이 그림에서 수정 된 [Haerteis 등 2012 세대 J Physiol 140, 375-389, 간접 :. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="그림 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" width="300" /> 그림 4 :. 플라스 (K189)과 프로 스타 절단 부위 (RKRK178) 모두에 변경을 가하면 ENAC 매개 전류의 활성화 및 채널의 γ-서브 유닛의 67 kDa의 절단 제품의 모양을 지연 난 모세포는 WT을 표현하는 (오픈 기호) 및 γ RKRK178AAAA은, K189A ENAC 돌연변이 채널 (폐쇄 기호) 단백질 분해 효소가없는 솔루션 (제어)에서 30 분 동안, 5, 3 배양 하였다키모 트립신 (2 ㎍ / ㎖)이 포함 된 용액에 0 또는 60 분. (A) 배양 전후 ΔI AMI를 결정하기는 난자 -60 뮤직 비디오의 개최 가능성에 고정되었다. 원이 부화하기 전에 측정 된 초기 ΔI AMI (ΔI 아미 초기)에 5 후에 측정 ΔI AMI의 비율, 30, 60 분의 배양 (ΔI 아미 분)을 나타냅니다. 각 데이터 포인트는 네 개의 다른 배치의 난자 22-24 개별 측정 평균치 ΔI AMI를 나타낸다. (BD) ΔI AMI, 세포 표면에서 비오틴 γENaC 발현 SDS-PAGE로 분석의 검출과 병행. γENaC 인간 γENaC의 C-말단에있는 항원에 대한 항체로 검출되었다. 각 레인은 B 또는 D에 표시된 것과 유사한 세 서부 오,의의 난자 하나의 일괄 처리에서 대표 서쪽 롯이 표시됩니다. (CE) 농도계 분석76 kD의 (개방 열) 및 67 kD의 (회색 열)의 영역에서 검출 ignals가 결정 검출 된 총 신호의 합으로 정규화 하였다. N은 난자의 다른 배치의 수를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

heterologously Xenopus의 표현 상피 나트륨 채널 (ENAC)의 단백질 분해 활성은 난자가 세포 표면에서의 이온 채널 벽개 제품의 외관을 조사하는 바이오 티 닐화 방식으로 전류 측정을 결합하여 설명 될 수 laevis의. 기능적으로 중요한 절단 부위는 부위 특이 적 변이를 이용하여 식별 될 수있다.

절단 조각의 탐지와 전류 측정을 결합하여 상피 나트륨 채널 (ENAC)의 단백질 분해 활성의 데모

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

12.8K 조회수.  Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU).  heterologously Xenopus의 표현 상피 나트륨 채널 (ENAC)의 단백질 분해 활성은 난자가 세포 표면에서의 이온 채널 벽개 제품의 외관을 조사하는 바이오 티 닐화 방식으로 전류 측정을 결합하여 설명 될 수 laevis의. 기능적으로 중요한 절단 부위는 부위 특이 적 변이를 이용하여 식별 될 수있다. 

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Interview: Glycolipid Antigen Presentation by CD1d and the Therapeutic Potential of NKT cell Activation

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious agents, and the development of artheriosclerotic plaques.   In this interview, Mitch Kronenberg discusses his laboratory's efforts to understand the mechanism through which NKT cells are activated by glycolipid antigens.  Central to these studies is CD1d - the antigen presenting molecule that presents glycolipids to NKT cells.  The advent of CD1d tetramer technology, a technique developed by the Kronenberg lab, is critical for the sorting and identification of subsets of specific glycolipid-reactive T cells.  Mitch explains how glycolipid agonists are being used as therapeutic agents to activate NKT cells in cancer patients and how CD1d tetramers can be used to assess the state of the NKT cell population in vivo following glycolipid agonist therapy.  Current status of ongoing clinical trials using these agonists are discussed as well as Mitch's prediction for areas in the field of immunology that will have emerging importance in the near future.

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmunity, clearance of infection, and the development of artheriosclerotic plaques. In this interview, Mitch Kronenberg discusses his laboratory's efforts to understand the mechanism through which NKT cells are activated by glycolipid antigens.

CD1d에 의해 Glycolipid의 항원 프레 젠 테이션 및 NKT 세포 활성화의 치료 가능성 : 인터뷰

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious ...

연구

생물학

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis. In some women the severe episodes of cyclic pain change and the resultant pain becomes continuous and this condition becomes known as Chronic Pelvic Pain. This state can be present even after the appropriate medical or surgical therapy has been instituted. It can be associated with pain and tenderness in the muscles of the abdomen wall and intra-pelvic muscles leading to severe dyspareunia. Additional symptoms of irritable bowel and interstitial cystitis are common. A common sign of the development of this state is the emergence of cutaneous allodynia which emerges from the so-called viscero-somatic reflex. A simple bedside test for the presence of cutaneous allodynia is presented that does not require excessive time or special equipment. This test builds on previous work associated with changes in sensation related to gall bladder function and the viscera-somatic reflex(1;2).
The test is undertaken with the subject s permission after an explanation of how the test will be performed. Allodynia refers to a condition in which a stimulus that is not normally painful is interpreted by the subject as painful. In this instance the light touch associated with a cotton-tipped applicator would not be expected to be painful. A positive test is however noted by the woman as suddenly painful or suddenly sharp. The patterns of this sensation are usually in a discrete pattern of a dermatome of the nerves that innervate the pelvis.
The underlying pathology is now interpreted as evidence of neuroplasticity as a consequence of severe and repeating pain with changes in the functions of the dorsal horns of the spinal cord that results in altered function of visceral tissues and resultant somatic symptoms(3). 
The importance of recognizing the condition lies in an awareness that this process may present coincidentally with the initiating condition or after it has been treated. It also permits the clinician to evaluate the situation from the perspective that alternative explanations for the pain may be present that may not require additional surgery.

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

A demonstration of the bedside test for cutaneous allodynia and its clinical implications.

실연 피부 Allodynia 만성 골반 통증과 공동으로

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis.  In some women the severe episodes of cyclic pain change and the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

단백질 Ubiquitination의 감지

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

편광 상피 세포에 Plasmids의 Microinjection에 의해 작은 GTPases의 기능을 분석

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

시토크롬의 세포질 Microinjection 의한 Apoptosis의 활성화 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

의 DNA 조각의 분리를위한 아가로 오스 젤 전기 영동

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

유전자 규정의 단일 분자 이미징<em&gt; 생체에</em&gt; 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...