이 작품은 박사 Poelzing에게 수여 보건 부여 번호 R21 - HL094828 - 01의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 소음 기능 및 입력 신호를 준비 <ol><li> 원하는 주파수 구성 요소를 포함하는 노이즈 함수를 만듭니다. 이것은 주파수 영역에서 원하는 주파수 구성 요소를 설명하는 다음 역 고속 푸리에 변환을 계산하여 수행할 수 있습니다. 본 연구에서는 1 - 15 kHz에서 사용되었다. 모든 푸리에 변환이 연구에서 설명하는 역 푸리에 변환은 Matlab의 FFT 및 IFFT 함수를 사용하여 계산되었다. </li><li> 적절하게 노이즈 함수의 진폭을 크기. 본 연구에서는 노이즈 함수는 노이즈 함수의 진폭을 최대로 제로가 50 또는 100 MV 것을 같은 크기를 조정했습니다. </li><li> 사용중인 수집 소프트웨어에 대한 적절한 방법을 사용하여 자극 파일을 만듭니다. Clampex 8, 먼저 적당한 헤더와 텍스트 파일을 만듭니다. 머리글 아래의 첫 번째 열에 하나의 청소를위한 시간 증가를 삽입합니다. 시간 단위는 측정에 사용되는 샘플링 간격과 같은 시간적 간격이 있어야합니다. 전압 단계 프로토콜의 각 스위프 각 시간 단계에서 원하는 정확한 전압을 삽입합니다. 이것은 노이즈 함수를 포함해야합니다. </li></ol> 2. 전압 클램프 측정을 수행 <ol><li> 이전에 생성된 자극 파일과 호환됩니다 수집 소프트웨어 내에서 측정 프로토콜을 만듭니다. Clampex에서는 사용자가 현재 프로토콜 자극 파일을 연결할 수있는 메뉴가 있습니다. </li><li> 측정 장비에 세포 모델 (또는 생물학) 연결합니다. </li><li> 예정대로 실험을 수행합니다. 제어 목적을 위해, 모든 노이즈 함수를 포함하지 정기적인 측정을 포함해야합니다. </li></ol> 3. 포스트 실험 분석 <ol><li> 개인 기록에 대한 IV 곡선을 계산합니다. 녹음이 노이즈 기능이 적용되어 안정적인 상태에있는 경우, IV 곡선은 temporally 노이즈 함수의 범위 밖 녹음의 안정 상태 부분을 사용하여 만들 수 있습니다. 녹음이 안정 상태에 있지 않은 경우, 소음 기능이 IV 곡선의 계산을 방해할 수있는 두 번째 녹음이 존재하는 노이즈 기능없이해야한다. </li><li> 녹음의 각 전압 단계에 대한 고속 푸리에 노이즈 함수를 삽입했던 녹음 부분의 변환을 계산합니다. amxn m는 FFT의 주파수의 숫자 매트릭스, 그리고 N으로 각 전압 단계에 대한 푸리에 변환을 결합하는 것은 전압 단계의 번호입니다. 이 구성에서는 행렬의 각 행이 실험의 모든 전압 단계에서 단일 주파수의 진폭을 나타냅니다. </li><li> 각 주파수 (위의 행렬의 각 행이 IE) 3.1에서 생성된 IV 곡선으로 행을 상관 관계 및 상관 계수를 기록합니다. </li><li> 높은 IV 커브와 연관 주파수를 시각화하기 위해 상관 계수 대 주파수를 플롯. DC 구성 요소는 FFT의 첫 번째 주파수에 포함된이므로이 주파수에 대한 상관 계수는 항상&gt; 0.99되어야합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 대표 전압 클램프 측정은하지 않고 (그림 1A) 및 전압 단계 프로토콜에 삽입 (그림 1B) 노이즈 기능 모델 셀에 표시됩니다. IV 곡선도 모델 세포 (그림 1C)를 계산했습니다. 각 스위프 들어, 그림 1에서 기록에서 FFT는 노이즈 함수를 삽입했던 시간 프레임 (그림 1A, 1B에 빨간색 상자 참조)를 통해 계산되었다. 그림 2A와 2B는 각각 그림 1A와 1B에 표시된 레코딩 계산 FFTs를 보여줍니다. 육안 검사시 DC 구성 요소 (빨간색으로 강조) IV 곡선의 모양을 모방하기 위해 나타납니다. 소음없는 함수, DC 위의 모든 주파수가 제로 (그림 2A) 근처 amplitudes을 가지고 나타납니다. 노이즈 함수가 삽입되면, 1 kHz에서 15 사이의 주파수는 시각적으로 눈에 띄는 amplitudes (그림 2B)를했습니다. 그림 3은 IV 곡선에 대한 전압 단계의 범위 개별 주파수 amplitudes을 연관의 결과를 보여줍니다. 그림 3A - C는 실험이 제어 조건 (없음 소음 기능)에 따라 각각 50과 100 뮤직 비디오의 노이즈 amplitudes와 함께 끝났다고 상관 계수를 보여줍니다. 모든 경우에 공지 사항, DC 구성 요소는 IV 곡선과 거의 완벽하게 연관시키는가 나타납니다. 사실, 모든 레코딩을 위해,이 주파수에 대한 상관 계수는 0.99 (R = 0.9996 ± 1E - 5, 말은 ± 표준 편차)보다되었습니다. 우리가 그림 3A (제어 조건)에 보면, 진폭 크게 IV 커브와 상호 DC 구성 요소 이외에는 주파수가 없습니다. 특히,이 주파수의 아무도는 0.5 이상의 상관 계수가 없습니다. 가장 낮은 진폭 노이즈 기능 (50 뮤직 비디오) 삽입시이 같은 주파수는 아직 0.5 이상의 상관 계수가 덜했다. 에 대한 상관 계수노이즈 진폭 100 뮤직 비디오로 증가되었을 때 SE 주파수는 0.5보다 큰이 없어요. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig1.jpg" alt="그림 1" /> . 그림 1 모델 셀 레코딩 : 전압 클램프 레코딩을하지 않고 (1A) 및 전압 단계 프로토콜에 포함 (1B) 노이즈 기능 모델 셀에 표시됩니다. 각 스위프의 첫 번째와 지난 20 MS에 대한, 가능성이 개최 가능성 (0 MV)에서 유지되었다. 각 전압 단계 80 MS 길이었고, 소음 기능 단계의 시작 후 40 MS를 삽입했습니다. 노이즈 함수는 30 MS의 기간을했다 1 15 kHz에서 사이의 주파수가 포함되어 있습니다. 전압이 서있는 다섯 MV 단위 -150에 50 MV를 강화했다. 모델 세포에 대한 IV 곡선도 (1C) 표시됩니다. 읽기 레코딩을보다 쉽게​​하기 위해, 오직 모든 다섯째 청소는 1A 및 1B에 포함되었지만, 모든 감시 장치는 1C에 포함되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 레코딩 FFT :. FFT는 노이즈 함수 (그림 1A에 빨간색 상자 1B에 묶여 지역) 삽입하기 위해 각 스위프의 30 MS 부분에 대한 계산했다. 그림 2A와 2B는 FFTs가 각각 소음 기능없이 함께 계산 보여줍니다. 다시 한번, 명확성을 위해, 모든 다섯째 수색에서만 FFT는 그림에 포함되어 있지만, 모든 감시 장치는 앞으로 계산에 사용되었다. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig3.jpg" alt="그림 3" /> . 그림 3 IV 주파수 상관 관계 : 녹음의 IV 곡선 및 전압 단계의 범위에서 각각의 주파수의 진폭 사이의 상관 관계의 결과가 표시됩니다. 그림 1A - 1C는 각각 제어 조건 하에서 0에서 20 kHz에서하는 주파수에 대한 50 또는 100 MV 노이즈 기능의 존재의 상관 계수를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2361/2361fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4 IV 곡선의 재 창조 :. 모델 세포 (그림 1C와 같음) 두 주파수의 크기에 대한 IV 곡선이 겹쳐 있었다. 첫 번째 주파수는 DC 성분 (R = 0.995)이었고, 두 번째는 낮은 상관 관계 (R = 0.3212)으로 무작위로 선택된 주파수했다. 주파수 amplitudes는 IV 곡선으로 거의 같은 진폭을 축소했다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

현재 나중에 각 채널 유형에 기인한다 얼마나 많은 전류 결정의 의도와 동시에 여러 이온 채널 유형을 측정 연구자 방지 기술 장애가 있습니다. 때문에 이러한 제한의 이온 채널은 일반적으로 같은 전압, 전류 및 행동 잠재력을 클램프로 기술을 사용하여 개별적으로 연구하고 있습니다. 1 개별 채널 유형, heterologous 표현 시스템이 자주 사용하는 연구를합니다. 2 등 cardiomyocytes과 같은 조직에서 분리된 세포와 작업하는 경우 다른 수단은 다양한 이온 채널을 차단하는 데 사용해야합니다. 예를 들어, 나트륨 채널이 느린 depolarizing 전압 램프에 의해 inactivated 수있는 3 내향 정류 칼륨 채널은 세포 BaCl2와 차단할 수, 4, 칼슘 채널 verapamil을 사용하여 차단할 수 5. 부분적으로이 제한을 극복 사용하는 한 가지 방법은 선택적으로 적절한 에이전트 하나의 채널 유형을 차단 후 측정을 반복 동시에 다음 두 채널 유형을 통해 현재의 유량을 측정하는 것입니다. 두 측정 뺄셈 그 다음 차단했습니다 채널 유형에 전류 기인의 양을 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 6 단,이 방법을 두 가지 주요 한계가 있습니다. 첫째, 화학 약품이 선택 각각의 이온 채널을 차단할 수 파악, 일부 널리 사용되는 약물은 다른 채널 유형이 아닌 구체적인 상호 작용이되지 않았습니다. 5,7 둘째, 그것은 하나의 채널이 다른가 변조 여부를이 기술에서 결정 수 없습니다 채널. 예를 들어, 우심실에서 상위 Kir 2.1 표현식이 전도 속도를 depresses 이러한, NAV 1.5 Kir 2.1의 이질적인 표현은 실험용 돼지 심실에 표시하고 있으며, 그것은 시너지 관계가 두 채널 사이에 존재하는 것을 제안했습니다. 현재 8 , 이것은 확인할 수 없습니다. 본 연구에서는, 우리는 그 임피던스 분광 동시에 측정한 여러 이온 채널 유형을 공부를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다 제안합니다. 제출 방법가 동시에 측정이 채널 유형에서 전류를 분별하는 데 사용되는 적이 있지만, 임피던스 분광은 이온 채널 기능의 다른 측면의 숫자를 연구하는 데 사용되었습니다. 굿맨 예술 현재 클램프 프로토콜이 서로 다른 주파수로 세포를 조정하도록 수정하고, transmembrane 잠재력의 oscillations가 안으로 정류 K + 채널과 칼슘 2 + 채널 사이의 상호 작용에 의한 수있는 거북이 청각 세포를 사용했다. 9 한나라와 프레 이저는 임피던스가 주파수의 넓은 범위 (100 Hz에서 5 MHz의) 이상의 단일 셀에 측정할 수 시연하고, K + 또는 칼슘 2 + 채널 차단되었습니다가 간단한 의미가 있었을 때 임피던스의 증가가 관찰 높은 처리량 약물 화면에서 채널 블록을 감지하면. 10 하야시와 피쉬맨은 내향 정류 K + 채널. 11 다른 그룹은 다른 채널 형식의 전압 클램프 프로토콜에 단일 주파수를 삽입하고 있습니다의 운동 특성을 공부하고 복잡한 도전을 사용한 것은 보여주 그 관찰 주파수 응답은 어떤 주파수 아니라 다른 사람에 대한 예상 응답 하였다. 12,13 Millonas과 Hanck 어떤 주파수는 예상 반응은 마르코프 모델에서 여러 속도 상수의 존재는 생성하지 않은 이유를 제안했습니다. 이러한 12 연구, 뿐만 아니라 다른 사람으로 임피던스 분광법을 사용하면서 이온 채널의 측정 이온 전류가 이론적으로 주파수 응답 동의하지 않는 경우가있다는 것을 증명하고있다. 본 연구에서는 메서드의 목적은 멤브레인 전기 회로의 기본 가정 독립 현재 진폭과 상관 관계 주파수를 식별할 수 있기 때문에 이것은 본 연구에서는 문제가되지 않습니다. Furtheremore는 현재의 진폭은 그들에 삽입된 모든 노이즈 함수를하지 않는 기록의 일부에서 계산됩니다. 다른 연구의 숫자는 또한 수많은 이온 채널의 현재 모델은 모두 자신의 속도 상수와 다수의 실시와 비 전도 상태를 전시. 14,15,16 톰슨 외가 KcsA 채널의 선택도 필터가 나에 대해 다른 바인딩 사이트를 가지고 것으로 나타났다 + 리가 + 및 K +, 그리고 선택도 필터를 통해 이온 이동으로 다른 하나의 구속력이 사이트에서 이동의 활기찬 비용이 채널은 우선적으로 그 구멍을 통해 K + 이온을 실시하는 이유가 무엇입니까합니다. 17 본 논문에서 우리는 범위를 삽입 전압 단계 프로토콜로 주파수 (소음 기능)과 그의 진폭 높은 전반적인 현재의 진폭과 주파수 상관 관계에 대한 보았다. 강력한 증거가 제시 제시되어 있기 때문에 여러 속도 상수는 differen을 통해 이온의 전도에 역할을t 채널, 이러한 속도 상수와 관련된 주파수의 도입은 특정 주파수가 울려 또는 높은 달리하지 않았을 현재의 진폭,와 연관시키는 원인이 될 수 있습니다. 본 연구에서 보여준 기술은 일반적으로 전압 클램프 회로 및 수집 장비를 테스트하는 데 사용되는 병렬 RC 회로는 모델 세포에 수행됩니다. 이것은 DC 이외의 모든 주파수가 현재의 크기와 연관 것이라고 예상하고, 이것은 우리가 데이터에 표시됩니다. 우리는 또한 노이즈 함수의 또한 어떤 주파수가 높은 현재의 진폭와 연관시키는 원인이 아니라고 표시됩니다. 그들은 측정 장비와 소음 기능 어​​떤 주파수는 현재 진폭와 연관시키는 원인이 스스로하지 표시하기 때문입니다이 두 연구 결과는 중요합니다. 미래 연구 이온 채널을 포함하는 세포막을 사용하여 측정을하면, 그것은 사용하는 채널에 따라 선택도 필터 또는 아마도 구멍에서 속도 상수에 해당하는 주파수는 채널의 주파수 응답에 영향을하고 주파수가 높은 갖고있는 영향을 미칠 것이다 것으로 기대된다 현재 진폭 또는 낮은 상관 관계. 이 방법은 이온 채널을 연구하기위한 새로운 기술이기 때문에, 미래의 연구 방향에 따라 수의 숫자가있다. 첫째, 기술은 특정 격리 채널의 주파수 응답을 특성화하는 데 사용해야합니다. 추가 작업은 또한 현재 amplitudes에 주파수 amplitudes를 보정하기 위해 완료해야합니다. 여러 채널을 개별적 특징되면, 다중 채널 형식은 동시에 측정해야합니다. 이 기술은 또한 잠재적인 행동 클램프, 현재 클램프 및 현장 자극 연구에 사용하기 위해 적응 수 있습니다. 이 새로운 기술이지만, 그것은 이전에 불가능했다 electrophysiological 측정하고 이온 채널의 생리적 역할에 가치있는 새로운 통찰력을 제공하는 강력한 방법이 될 수 있습니다 무엇 보여줍니다.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>n/a</td>
<td>Natick, MA</td>
</tr>
<tr>
<td>Clampex 8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Clampex 8</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Integrating Patch Clamp Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axopatch 200</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>CV202</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>16-Bit Data Acquisition System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>
<tr>
<td>Model Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Patch 1 Model Cell</td>
<td>Sunnyvale, CA</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

recapitulation of an ion channel iv curve using frequency components

소개 : 현재, 동시에 여러 이온 채널 유형을 측정하고 각 채널 유형에 기인 일부로 측정된 전류를 분해 할 정해진 방법이 없습니다. 이 연구는 임피던스 분광가 높은 전압 클램프 실험 기간 동안 측정된 정상 상태 전류 진폭와 연관 특정 주파수를 식별하는 데 사용될 수 있습니다 방법을 보여줍니다. 방법은 전압 단계 프로토콜에 특정 주파수를 포함하는 노이즈 함수를 삽입이 포함됩니다. 제출 작품에서 모델 세포는 더 높은 상관 관계가 더 이온 채널이 존재없는 경우 소음이 기능 자체가 높은 상관 관계를 소개하지 않습니다 또한 전압 클램프 회로에 의해 도입하지 않으며는 것을 입증하는 데 사용됩니다. 기술은 이온 채널을 포함하는 준비를 적용하기 전에이 유효성 검사가 필요합니다. 제출 프로토콜의 목적은 노이즈 함수에 단일 이온 채널 형식의 주파수 응답을 특성화하는 방법을 보여줍니다하는 것입니다. 특정 주파수가 개별 채널 유형 확인되고 나면, 그들은 정상 상태 전류 전압 (IV) 곡선을 재현하는 데 사용할 수 있습니다. 높은 하나의 채널 유형 상관 관계와 최소한 다른 채널 유형과 상관 관계 주파수는 다음 동시에 측정 다중 채널 형식의 현재의 기여를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 방법 : 전압 클램프 측정은 표준 전압 단계 프로토콜 (-150에 50 뮤직 비디오, 5mV 단계)을 사용하여 모델의 세포에서 수행되었다. 1-15 kHz에서 주파수 (최대 amplitudes에 제로 : 50 또는 100mV)의 동등 magnitudes를 포함하는 노이즈 함수는 각 전압 단계에 삽입되었다. 출력 신호의 고속 푸리에 변환 (FFT)의 실제 구성 요소와 각 단계에 잠재력에 대한 잡음없이 계산했다. 전압 단계의 함수로 각 주파수의 크기는 해당 전압에서 전류 진폭과 상관했다. 결과 및 결론 : 소음이없는 (제어), DC 구성 요소를 제외한 모든 주파수의 magnitudes 상관이 저조한 (| R | &lt;0.5) IV 곡선과 DC 구성 요소가 모든 측정에서 0.999 이상의 상관 계수를했다 반면. 노이즈 기능이 전압 단계 프로토콜에 추가되었을 때 각각의 주파수와 IV 곡선 사이의 상관 관계의 품질은 변경되지 않았다. 마찬가지로, 노이즈 함수의 진폭을 증가하면 상관을 증가하지 않았다. 제어 측정 자체적으로 전압 클램프 회로가 0 Hz에서 위의 모든 주파수가 높은 정상 상태 IV 곡선와 연관시키는 원인이되지 않는다는 것을 보여줍니다. 마찬가지로, 노이즈 함수의 존재에 측정 노이즈 기능이 더 이온 채널이 존재없는 경우 0 Hz에서 위의 모든 주파수가 정상 상태 IV 곡선와 연관시키는 원인이되지 않는다는 것을 보여줍니다. 이 검증을 바탕으로, 방법은 지금 amplitudes 해당 채널의 유형과 특별히 상관 관계 식별 주파수의 목적으로 단일 이온 채널 유형을 포함하는 준비를 적용할 수 있습니다.

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Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

가 동시에 여러 이온 채널을 통해 전류 흐름을 측정하는 기술적인 장애가되며, transmembrane 전류 이후 안목 어떤 부분은 각 채널의 종류에 의한 것입니다. 이 필요를 해결하기 위해,이 방법은 특정 주파수 구성 요소를 사용하여 개별 채널 유형의 IV 곡선을 생성하는 방법을 보여줍니다.

주파수 구성 요소를 사용하는 이온 채널 IV 곡선의 재현부

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

recapitulation-of-an-ion-channel-iv-curve-using-frequency-components

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K 조회수.  University of Utah. 가 동시에 여러 이온 채널을 통해 전류 흐름을 측정하는 기술적인 장애가되며, transmembrane 전류 이후 안목 어떤 부분은 각 채널의 종류에 의한 것입니다. 이 필요를 해결하기 위해,이 방법은 특정 주파수 구성 요소를 사용하여 개별 채널 유형의 IV 곡선을 생성하는 방법을 보여줍니다.

비디오: Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

연구

생물학

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

라이트 현미경의 주요 구성 요소

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Syngeneic Zebrafish의 제한 희석 세포 이식을 사용하여 종양 - 증식 세포의 주파수 Quantifying

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

패치 클램프 전기 생리학 및 압력 Myography를 사용하여 간선 평활근 Kv7 칼륨 채널 기능을 탐색

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

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Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

형광 현미경으로 Stromule 주파수를 시각화

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...