저자는 2010-2014 봄 학기 동안 내 트랜스포존 돌연변이 유발 아이디어를 테스트 내 미생물 생리학 대학원생의 학부 독립적 인 연구의 모든 학생 모두에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 영스 타운 주립 대학의 생물학의 부에 의해 투자되었다.

관할 세포 5,11를 1. 일렉트로 <ol><li> 엔테로 박터 SP의 O / N LB 문화를 희석. 신선한 LB 배지 50 ㎖에 YSU 1/20 0.4과 0.6 사이의 OD (600 ㎚)을 30 ° C를 120 rpm으로 진탕과 함께 성장한다. 선택적으로, 최적의 성장 온도에서 다른 균주 성장. </li><li> 5 분 원심 분리기 4 ° C에서 5 분간 7,000 XG 얼음에 세포를 진정. </li><li> , 상층 액을 제거한다 4 ° C에서 멸균 얼음 냉수 및 원심 분리기 50 ㎖의 세포를 재현 탁하고 5 분 동안 7,000 XG. 이 단계를 반복합니다. </li><li> 상청액을 버리고 세포 펠렛 부피 동일 얼음 냉수의 부피로 세포를 재현 탁. 장기 저장을 위해, -80 ° C 및 해동에 빙냉 10 % (v / v) 글리세롤, 매장의 동일한 펠렛 부피 빙냉 10 % (v / v)의 글리세린,에 resuspend 10 ㎖로 세포를 씻어 전기하기 전에 얼음에. </li><li> 40 μL에 transposome의 0.5 μl를 추가세포. 시판 transposome 용액 0.33 ㎍ / ㎕의 DNA의 농도로 공급된다. 0.33 μg의 권장되지만, 0.165 μg의 DNA는 충분하다. </li><li> 얼음 감기, 0.2 mm, 전기의 큐벳에 셀 / transposome 혼합물을 놓고 큐벳의 바닥에 혼합물을 누릅니다. 25 μF 200 Ω, 2.5 kV의를 세포를 충격. 세포가 냉장 상태로 유지되도록 사용하기 전에 -20 ° C 냉동고에서 전기 큐벳을 저장합니다. </li><li> 즉시, catabolite 탄압 (SOC) 매체와 슈퍼 최적의 국물을 살균 필터의 960 μl를 추가합니다. 아래로 피펫 팅에 의해 혼합 및 멸균 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 세포를 전송합니다. NOTE : 세포 충격 후 죽기 시작하지만, SOC 배지 염들을 복구 할 수있다. 절약하기 위해, transposome를 추가하거나 음성 대조군 세포에 충격을 할 필요가 없다. 그냥 멸균 SOC 매체의 960 μl를 추가합니다. </li><li> 30 ° C F에서 세포를 품어120 rpm으로 흔들어으로 45 ~ 60 분. 이 카나마이신 저항을 표현하는 transposome는 세포 숙주 게놈과과에 대한 재결합을위한 시간을 제공합니다. </li><li> LB-관 한천 접시에 세포를 100 μl를 확산하고 30 ° C에서 판 O / N을 품어. 4 ° C의 냉장고에 남아있는 변환 믹스를 저장합니다. 필요한 경우 초기 전기 후 이주에 나중에 업에 추가 금액을 확산. </li></ol> 형질 전환 2. 리딩 <ol><li> 테이프 빈 100 × 15mm 페트리 접시의 뚜껑에 그리드. &quot;세균 유전학의 단기 코스&quot;12에서 그리드를 복사합니다. </li><li> LB-관 한천 플레이트의 하단에 선을 그립니다. 그리드 한천을 통해 볼 수 있도록 격자 덮개에 고정하는 테이프의 작은 조각을 사용한다. 접시의 바닥에있는 선이 그리드의 상단 중앙에 정렬되어 있는지 확인합니다. 테이프와 함께 접시를 정박에도 리딩을 허용, 슬라이딩에서 유지. 라인은 복제 도금 후 식민지의 식별을 용이하게한다. </li><li> 멸균 이쑤시개로 하나의 형질 전환 체를 선택하고 그리드의 사각형의 중심에 자리. 그냥 식민지 그 자리를 터치합니다. 한천에 이쑤시개를 발굴하지 마십시오. 플레이트가 오염되는 것을 방지하기 위해, 하나의 끝 부분에 이쑤시개를 처리합니다. </li><li> 단계 2.3에서와 같이 인접한 광장에서 다른 형질 전환 체를 스팟. 플레이트가 가득 차면, 30 ° C에서 / O N 그것을 품어. 이것은 마스터 플레이트이다. </li></ol> 3. 복제 도금 영양 요구 표현형 (12)를 파악하기 위해 <ol><li> LB-관에 대한 M-9 칸에 대한 LB 관 하나, 둘, 셋 : 격자로 된 각 플레이트를 들어, 세 가지를 통해 하나의 번호가 세 가지 신선한 한천 플레이트의 스택을 확인합니다. 사용하기 전에 37 ° C에서, 거꾸로 O / N를 접시를 건조. </li><li> 단계 2.2에서 각 판의 상단에 선을 그립니다. </li><li> 70 % 에탄올로 복제 도금 도구를 닦아 복제 도금 가기에 멸균 벨벳 광장을 배치OL과 벨벳 광장을 단속. 손 심지어 세척 후 미생물로 가득합니다. 가장자리에 벨벳 광장을 처리하여 미생물 오염의 도입을 방지합니다. </li><li> 클램프에 그려진 선으로 마스터 접시에 선을 정렬하고 벨벳 광장의 상단에있는 플레이트에 배치합니다. 벨벳 광장 판에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 세균이 묻지 않도록주의하십시오. 벨벳 광장에서 마스터 플레이트를 제거합니다. </li><li> 클램프 라인 판 번호 하나에 그려진 선을 정렬하고 벨벳 광장의 상단에 배치합니다. 판에 벨벳 광장에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 판 번호 하나를 제거합니다. </li><li> 물을 비이커에 벨벳 광장 폐기 단계 3.3에서와 같이 복제 도금 도구에 깨끗하고 멸균 벨벳 광장을 배치합니다. 이 단계에 걸쳐 접종 획기적인 성장과 거짓 긍정적 인 결과를 발생 방지 할 수 있습니다. </li><li> 정렬클램프 라인 판 번호 하나에 라인과 새로운 벨벳 광장의 상단에 배치합니다. 벨벳 광장에 판 번호 하나에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 판 번호 하나를 제거합니다. </li><li> 클램프 라인 판 두 번째에 그려진 선을 정렬하고 벨벳 광장의 상단에 배치합니다. 판 두 번째로 벨벳 광장에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 번호판 두를 제거합니다. </li><li> 번호판 세 단계를 반복 3.8. 3 플레이트는 다른 두 판을 마스터 플레이트로부터 완전한 전송을위한 제어이다. 물을 비이커에 벨벳 광장을 폐기하십시오. 그들을 건조, 씻어 알루미늄 호일을 감아을 다시 압력솥, 오염 된 벨벳 사각형이 들어있는 비커를 오토 클레이브, 벨벳 사각형을 다시 사용합니다. </li><li> 30 ° CO / N에 번호판을 품어. 두 LB 칸 아가 플레이트상에서 성장하지만 M-9 칸 플레이트상에서 성장되지 콜로니 영양 요구 (것으로 간주 <st룽&gt; 그림 2). </li><li> 줄무늬와 신선한 LB 관 한천 판에 판 번호를 하나의 영양 요구하고, 30 ° CO / N에서 접시를 품어. </li><li> 격리 신선한 LB 칸 접시에 단계 3.11의 줄무늬 판 3 식민지 밖으로 행진. 30 ° CO / N에서 접시를 품어. 이 돌연변이가 잘 분리되어 있음을 보장합니다. 하나의 섹션에서 각 식민지 밖으로 분에 플레이트와 행진을 나눈다. </li><li> 신선한 LB 칸 접시에 단계 3.12에서 파생 된 아웃 줄무늬 식민지에서 스팟 식민지 단계 2.1-2.4 같이 격자를 형성한다. 각각의 돌연변이 중으로 다시 테스트되고있다. </li><li> 영양 요 표현형을 확인하는 단계 3.1-3.10 같이 다시 판을 복제합니다. </li></ol> 4. 유전자 구조 <ol><li> 30 ° C에서 액체 LB-관 매체에 단계 3.13에서 고립 된 돌연변이 식민지의 3 ㎖의 O / N 문화를 성장. 시판되는 게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 배양액 1mL로부터 게놈 DNA를 정제. </li><li> 0.025 U의 혼합물을 설정BFU CI의 제한 효소와 얼음에 20 μL 반응에서 / μL 게놈 DNA 1 μg의 14 μL. BFU CI 열두 다른 사이트에서 트랜스포존을 인하하기 때문에, 제한 효소, BFA I 또는 각각 두 세 가지 다른 사이트에서 트랜스포존 인하 해일 III를 사용하는 것이 더 효율적일 수있다. </li><li> 25 분 동안 37 ° C에서 반응을 부화 한 후 80 ° C에서 20 분간 효소를 불 활성화하기 위해. 0.8 % 아가 로스 겔 (도 3)에 부분적으로 소화 DNA의 3 μl를 분석한다. 겔의 하단에 위에서 아래 10킬로바이트에서 도말 검사에서 성공적인 부분 소화 결과. </li><li> 500 ㎕의 반응에 T4 DNA 리가 제 (800)의 단위를 사용하여 부분적으로 소화 된 게놈 DNA의 15 μl를 결찰. 반응 O / N에서 4 ℃를 품어. 큰 반응 부피 자체로 하나의 단편의 결찰을 극대화하고, 두 개 이상의 DNA 단편 사이의 상호 작용을 최소화한다. </li><li> 강수테 3 M 아세트산 나트륨, pH가 5.5, 및 1 ml의 95 % 에탄올의 50 μl를 첨가하고 20 분 동안 -20 ° C에서 인큐베이팅하여 DNA 결찰. </li><li> 70 % 에탄올로 펠렛을 씻어 10 분 동안 4 ° C에서 DNA 및 13,500 XG를 미세 원심 원심 진공 농축기에서 건조하고, 뉴 클레아 무료 물 10 μL에서 그것을 재현 탁. 대안 적으로, DNA는 공기는 15 분 동안 RT에서 건조 될 수있다. </li><li> E.를 변환 재현 탁 DNA의 4 μL를 사용하여 제 1 절 R6K γ 복제 원점에서와 같이 전기에 의한 대장균 균주 ECD100D의 PIR 또는 ECD100D의 pir116 6을 복제하는 PIR 유전자와 균주가 필요합니다. 낮은 복사 플라스미드의 PIR 스트레인 결과 및 pir116 변형은 높은 사본 플라스미드 결과 PIR 돌연변이 유전자가 포함되어 있습니다. 각 형질 전환 트랜스포존과 중단 된 염색체 (그림 1E)의 영역으로 새로운 플라스미드가 포함되어 있습니다. </li><li> Inocul단일 콜로니로 LB 칸 배지 5 ㎖를 먹었다, 120rpm으로 37 ° C에서 진탕 / O N 그것을 성장하고, 상업용 키트를 사용하여 전체 O / N의 배양 물로부터 플라스미드 DNA를 정제. </li><li> 제한 엔도 뉴 클레아 제의 I.을 XhoI를 이용 플라스미드를 14 μl를 다이제스트 반응의 최종 부피가 20 μL 있는지 확인합니다. 이 효소는 카나마이신 내성 유전자의 5 &#39;말단에 트랜스포존의 중앙의 위치를​​ 인식한다. 소화되지 않은 10 μl를 분석하고 0.8 % 아가 로스 젤 (그림 3)에 플라스미드를 소화. 플라스미드는 2 킬로바이트 트랜스포존 플러스 측면에서는 숙주 DNA로 구성되어 있습니다. </li></ol> 5. DNA 시퀀싱 <ol><li> 시판의 시퀀싱 키트, 트랜스포존의 각 단부에 상동 프라이머 및 모세관 서열 분석 시스템을 이용하여 플라스미드를 시퀀싱. 또한, 플라스미드는 순서에 대한 외부 기관에 제공 할 수있다. </li><li> 분자량 표준 (1킬로바이트 사다리)으로 사용합니다겔 플라스미드의 크기를 추정한다. 이어서, 50 fmol에 필요한 플라스미드의 나노 그램 (NG)의 개수를 추정한다. </li><li> 260 nm의 (A 260)과 280 nm의 (A 280)의 파장에서 분광 광도계를 사용하여 플라스미드 DNA의 농도를 측정한다. 큐벳을 통해 빛의 경로 길이가 1cm 있는지 확인하십시오. 50 NG / μL로 260 nm에서 흡광도를 곱하여 농도를 결정합니다. 높은 품질의 플라스미드 DNA는 260 / 1.8과 2.0 사이의 280 비율이있을 것이다. </li><li> 각각의 시퀀싱 반응에 필요한 DNA의 부피는 플라스미드의 농도로 나눈 50 fmol 필요한 NG의 수이다. 10 μL로 총 부피를 가지고 물과 필요한 플라스미드의 볼륨을 섞는다. </li><li> 1 분 동안 96 ° C에서 플라스미드 DNA / 물 혼합물을 가열 한 후 RT로 냉각. </li><li> 시퀀싱 키트에서 마스터 믹스 8 μL 및 시퀀싱 프라이머 중 하나의 μM 1.6의 2 μL를 추가합니다. </li><li> FOL열 자전거 타는 프로그램과 반응 정리에 대한 시퀀싱 키트에서 낮은 프로토콜입니다. </li><li> 모세관 DNA 분석 시스템을 이용하여 각각의 샘플을 분석한다. </li><li> DNA 서열을 볼 수 상용 소프트웨어 패키지를 사용합니다. 트랜스포존 (그림 4)의 지난 7 BP되는 순서 &quot;5&#39;-GAGACAG-3 &#39;,&quot;를 검색합니다. 이 7 bp의 세그먼트의 5 &#39;말단 전에 시퀀스 트랜스포존에 속한다. 이 7 bp의 세그먼트의 3 &#39;말단 서열은 이후 중단 유전자에 속한다. </li><li> 기본 지역 맞춤 검색 도구 (BLAST) 7, 8을 사용하여 중단 된 유전자의 가능한 기능을 결정합니다. 다음을 사용하여 link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . 인터럽트의 순서를 붙여 넣기쿼리 상자에 ED 유전자 데이터베이스에서 &quot;기타&quot;를 선택하고 페이지 하단에 &quot;BLAST&quot;을 클릭합니다. 결과가 나타나면, 정렬 결과 (그림 5)을 볼 수 있도록 페이지를 아래로 스크롤합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, B. H., Gadd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial physiology and metabolism. , (2008).</li><li>Hayes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-based+strategies+for+microbial+functional+genomics+and+proteomics.">Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics.</a> Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).</li><li>Hoffman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+chromosomal+gene+disruption+in+vivo+using+transposomes.">Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes.</a> Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).</li><li>Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+transposon+mutagenesis+by+electroporation+of+released+Tn5+transposition+complexes.">Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes.</a> Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Transformation+of+E.+coli+by+High+Voltage+Electroporation.">High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+rep+technique+for+allele+replacement+to+construct+new+Escherichia+coli+hosts+for+maintenance+of+R6K&#947;+origin+plasmids+at+different+copy+numbers.">Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K&#947; origin plasmids at different copy numbers.</a> Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).</li><li>Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Sch&#228;ffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Database+indexing+for+production+MegaBLAST+searches.">a Database indexing for production MegaBLAST searches.</a> Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).</li><li>Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).</li><li>Holmes, A., Vinayak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+multimetal+resistant+bacterial+strains:+Enterobacter+sp.+YSU+and+Stenotrophomonas+maltophilia+OR02.">Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02.</a> Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).</li><li>Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposome+insertional+mutagenesis+and+direct+sequencing+of+microbial+genomes.">Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes.</a> Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).</li><li>Ausubel, F., Brent, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).</li><li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).</li><li>Gibson, M. I., Gibson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+studies+on+the+isolation+and+metabolism+of+an+intermediate+in+aromatic+biosynthesis:+chorismic+acid.">Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid.</a> The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).</li><li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).</li><li>Reznikoff, W., Winterberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-Based+Strategies+for+the+Identification+of+Essential+Bacterial+Genes.">Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes.</a> Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).</li><li>Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+genome+deletion+methods+applicable+to+prokaryotes.">Random genome deletion methods applicable to prokaryotes.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).</li><li>Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-making+distinctions+in+synthetic+biology.">Knowledge-making distinctions in synthetic biology.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).</li><li>Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Problems+with+the+microbial+production+of+butanol.">Problems with the microbial production of butanol.</a> Journal of industrial microbiolog., &amp; biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없습니다.

transposome을 사용하여 트랜스포존 돌연변이 유발 엔테로 SP의 영양 요구를 생성하기위한 효과적인 도구이다. YSU과 그람 음성의 다른 유형과 그람 양성 세균 3,4. 프로세스는 일렉트로 의해 숙주에 테네시 5 유래 transposome 도입함으로써 개시 하였다. 인서트 콜로니를 확인하기 위하여, 변형되지 않은 대상 균주는 트랜스포존에 의해지지 저항 마커 선택하기 위해 카나마이신에 민...

Prototrophic 박테리아 생합성 1, 아미노산, 핵산, 비타민 등의 전구체를 생성하도록 중앙 탄소 대사 경로를 통해 글루코즈 변환 매체 글루코스 (M-9 매체)를 포함하는 M-9 최소 염 성장. M-9 매체는 탄소 및 에너지 원으로서 황 공급원 및 글루코스 버퍼 및 인 소스, 황산 마그네슘 등의 질소원, 나트륨 및 인산 칼륨 등의 암모늄 클로라이드를 포함한다. 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 트립에서 효모 추출물 비타민과 성장 인자의 아미노산이 풍부하다. 그것은 M-9 매체 상 성장에 필요한 아미노산, 비타민 및 다른 성장 인자를 합성 할 수없는 영양 요구의 성장을 지원한다. 영양 요구는 M-9 매체에 LB 배지에서 성장할 수 있지만 반면 따라서 prototrophs는 LB 및 M-9 배지에서 성장할 것이다. 영양 요 구성 돌연변이 표현형을 야기하는 유전자를 박테리아 prototrophic 인구에 돌연변이를 도입하고 식별함으로써, 포는균주의 대사의 더 나은 이해를 얻을 ssible. 트랜스포존 돌연변이는 M-9 배지에서 포도당에서의 성장에 필요한 유전자의 대부분을 식별하는데 사용될 수있다. 트랜스포존는 숙주 게놈 2에 무작위로 자신을 삽입합니다. M-9 배지 아가 플레이트 상에 LB 아가 플레이트 및 이들을 도금 복제본 트랜스포존 형질을 스폿 팅함으로써, 영양 요구 스크리닝 할 수있다. 중단 된 유전자는 유전자 구조를 통해 확인된다. 본 연구는 시판 테네시 5 트랜스 단백질과 혼합 선형 트랜스포존 DNA 세그먼트의 용액으로서 제공되는 transposome - 유래를 이용한다. DNA 세그먼트는 트랜스 유전자가 부족하지만 카나마이신 저항성 유전자, R6K γ 복제 원점과 세그먼트 3,4의 각 끝 부분에 결합 트랜스에 대한 DNA 서열 두 개의 모자이크 모티브가 포함되어 있습니다. 트랜스 단백질은 DNA 단독 DNA 세그먼트에 직접 첨가되어 있기 때문에트랜스포존으로 정의되고, DNA / 트랜스 단백질 복합체 transposome로서 정의된다. transposome은 카나마이신 민감한 호스트 (그림 1A)에 전기 (5)에 의해 변환된다. 카나마이신 (LB 칸)을 함유하는 LB 아가 플레이트상에서 성장 콜로니를 카나마이신 (M-9 칸) 영양 요구 아르 함유 M-9 배지 아가 플레이트상에서 성장되지 트랜스포존 삽입 (도 1B), 및 복제 도금 형질 (Figire있을 1C). 돌연변이로부터 게놈 DNA 정제 부분적 4베이스 절삭 제한 엔도 뉴 클레아 제, BFU CI (도 1D)로 분해된다. DNA 라이 게이션은 그 PIR 유전자 (도 1E)를 포함 대장균 (E. 콜라이)의 균주에 형질 전환된다. 이 유전자는 새로운 플라스미드 트랜스포존을 포함하고 E.에서 복제 호스트 염색체 영역을 측면에서는 수 있습니다 대장균 6. 카나마이신 내성 유전자와 같은 역할새로운 플라스미드에 대한 electable 마커. 마지막으로, 중단 유전자의 신원을 결정하는 데 사용되는 트랜스포존 얻어진 시퀀스의 기본 로컬 검색 정렬 도구 (BLAST) 분석 7,8의 각 단부에 상보적인 프라이머를 이용하여 시퀀싱. 이 transposome 돌연변이 유발 전략은 세 가지 장점 (3)를 제공한다. 트랜스 단백질 트랜스포존에 직접 결합되기 때문에 먼저, 삽입 호스트 내의 트랜스 유전자의 발현에 의존하지 않는다. 트랜스포존은 숙주 게놈 내로 그 자체를 포함하면 트랜스는 트랜스포존의 추가적인 이동을 방지 저하된다. 호스트가 내인성 테네시 5 transpositional 요소를 소유하는 경우에는, 추가 이동이 방지 될 수 없다. 둘째로, 전기 천공에 의해 도입 transposome은 가능한 호스트 다양한 그것을 사용한다. 또한 접합하여 또는 VI를하여 트랜스포존을 도입 할 필요성을 제거RAL 감염. 두 프로세스는 호스트 감수성을 필요로한다. 셋째, 카나마이신 내성 유전자 및 transposome에서 γ R6K 복제 기원의 포함은 쉽게 중단 유전자를 식별 할 수있다. 트랜스포존 중단 영역 저장 및 유전자 식별을위한 역 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용할 필요가 없어, 플라스미드로 서열화 될 수있다. 이 비디오에 제시된 프로토콜은 엔테로 박터 SP의 트랜스포존 돌연변이 유발을위한 각 단계를 설명합니다. YSU 9는 중단 추정되는 유전자의 식별에 박테리아 세포에 도입에서 transposome를 사용하여. 이전에 출판 프로토콜 3,4,10 이외에 영양 요구에 대해 스크리닝 복제본 도금을 사용하는 상세한 방법이 제시된다. 이 돌연변이 유발 기술은 식별자에 대한 박테리아의 다른 유형에서, 그러한 항생제 저항과 금속과 같은 다른 표현형을 조사하기 위해 사용될 수있다또는 유전학 또는 미생물 생리학 코스의 실험실 구성 요소를 가르치는 합성 생물학 연구에서 정의 된 배양 조건에서 성장에 필요한 유전자의 최소한의 수를 ifying.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="707">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Tn5 R6K&#947;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">TSM08KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir+ Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">ECP09500</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a low copy number</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">EC6P095H</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a high copy number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5X M-9 Salts</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">DF048517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lennox LB Broth</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1427-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J637-1KG</td>
			<td style="width:227px;">Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kanamycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0408-25G</td>
			<td style="width:227px;">When required, media contained 50 &#956;g/ml kanamycin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D-Glucose Monohydrate</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J850-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J859-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;">0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BfuC I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0636S</td>
			<td>Partial digestion of genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xho I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td>Plasmid digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nuclease Free Water</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">E476-1L</td>
			<td style="width:227px;">For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">608120</td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1120A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1460</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica Plating Block</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen Squares</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-2</td>
			<td>Replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PetriStickers</td>
			<td style="width:145px;">Diversified Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PSTK-1100</td>
			<td>Grid for replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Pulser II</td>
			<td style="width:145px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Electroporation Cuvettes &#8211; 2 mm</td>
			<td style="width:145px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-5010-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td>
			<td style="width:145px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970010</td>
			<td>Drying DNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CEQ 2000XL DNA Analysis System</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vector NTI Advance 11.5.0</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12605099</td>
			<td>DNA sequence analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

Prototrophic 박테리아는 탄소 및 에너지 원으로 사용되는 배지 글루코오스 (M-9 배지)로 보충 M-9 최소 염에 성장. 영양 요구는 transposome를 이용하여 생성 될 수있다. 이 프로토콜에 사용되는 상용, 테네시 (5) 유도 된 transposome은 트랜스 결합 부위의 역할을 R6K γ 복제 기원, 카나마이신 저항과 두 개의 모자이크 순서 종료하는 유전자를 포함하는 DNA의 선형 세그먼트로 구성되어 있습니다. DNA / 트랜스 단백질 복합체로서 제공 transposome는, prototrophic 균주, 엔테로 SP는 일렉트로로 도입된다. YSU, 그리고 무작위로이 숙주의 게놈에 자신을 통합합니다. 형질 전환 체는 카나마이신 (LB 칸)을 함유하는 한천 플레이트 루리아 - 베르 타니에 도금 복제본 카나마이신 (M-9 칸)을 함유하는 M-9 배지 아가 플레이트 상이다. M-9 칸 접시에 LB-관 판에 성장하지만 형질 전환 영양 요구로 간주됩니다. 정제 게놈영양 요구로부터 DNA는 부분적으로 소화 PIR + 대장균 (E. 콜라이) 균주에 결찰 및 변환된다. R6Kγ 복제 원점은 플라스미드 PIR + E.에 복제 할 수 있습니다 콜라이 균주 및 카나마이신 저항 마커 플라스미드의 선택을 허용한다. 각 형질 전환 중단 된 염색체 영역에 의해 측면에 트랜스포존을 포함하는 새로운 플라스미드를 보유하고있다. 생거 시퀀싱 및 기본 지역 맞춤 검색 도구 (BLAST)는 중단 된 유전자의 추정 정체성을 제안한다. 이 transposome 돌연변이 유발 전략을 사용하는 세 가지 이점이있다. 첫째, 호스트에 의한 트랜스 유전자의 발현에 의존하지 않는다. 둘째, transposome는 전기에 의하여보다는 접합 또는 형질 도입에 의하여 대상 호스트에 도입하고, 따라서보다 효율적이다. 셋째, R6Kγ 복제 원점 쉽게 돌연변이 g을 식별 할 수있게부분적으로 재조합 플라스미드에 복구 에너지. 이 기술은 엔테로 박터 (SP)의 다른 특성에 관여하는 유전자를 조사하기 위하여 사용될 수있다. YSU 또는 균주의 넓은 다양한.

엔테로 박터 SP의 변환. transposome와 일렉트로 의해 YSU는 숙주 게놈 (도 1A, B)에 임의의 게놈 삽입을 개시. 성공적인 전기는 LB-관 판에 성장 수천 개의 형질 전환 체를 얻었다. 300 ~ 400를 얻으려면, 판 당 식민지를 잘 간격, 각 LB 관 한천 접시에 변환 혼합 확산의 양을 최적화했다. 각 형질 전환 체는 적어도 하나의 트랜스포존 삽입물을 포함하지만, M-9 매체상의 성장에 중요한 유전?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis at JoVE.com

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다.

생성<em&gt; 엔테로 박터</em&gt; SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

generation-enterobacter-sp-ysu-auxotrophs-using-transposon

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

13.8K 조회수.  Youngstown State University.  엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다. 

비디오: Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

연구

생물학

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

전체 Plasmids의 수제 사이트 감독 돌연변이 유발

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNA 함유 Oligonucleotides를 사용하여 변환하여 게놈 DNA에서 RNA / DNA 하이브리드의 생성

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

웜 실험실 소개 : Culturing 웜에서 돌연변이 유발하는

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

단일 Oocyte의 Bisulfite의 돌연변이 유발

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...