저자는 2010-2014 봄 학기 동안 내 트랜스포존 돌연변이 유발 아이디어를 테스트 내 미생물 생리학 대학원생의 학부 독립적 인 연구의 모든 학생 모두에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 영스 타운 주립 대학의 생물학의 부에 의해 투자되었다.

관할 세포 5,11를 1. 일렉트로 <ol><li> 엔테로 박터 SP의 O / N LB 문화를 희석. 신선한 LB 배지 50 ㎖에 YSU 1/20 0.4과 0.6 사이의 OD (600 ㎚)을 30 ° C를 120 rpm으로 진탕과 함께 성장한다. 선택적으로, 최적의 성장 온도에서 다른 균주 성장. </li><li> 5 분 원심 분리기 4 ° C에서 5 분간 7,000 XG 얼음에 세포를 진정. </li><li> , 상층 액을 제거한다 4 ° C에서 멸균 얼음 냉수 및 원심 분리기 50 ㎖의 세포를 재현 탁하고 5 분 동안 7,000 XG. 이 단계를 반복합니다. </li><li> 상청액을 버리고 세포 펠렛 부피 동일 얼음 냉수의 부피로 세포를 재현 탁. 장기 저장을 위해, -80 ° C 및 해동에 빙냉 10 % (v / v) 글리세롤, 매장의 동일한 펠렛 부피 빙냉 10 % (v / v)의 글리세린,에 resuspend 10 ㎖로 세포를 씻어 전기하기 전에 얼음에. </li><li> 40 μL에 transposome의 0.5 μl를 추가세포. 시판 transposome 용액 0.33 ㎍ / ㎕의 DNA의 농도로 공급된다. 0.33 μg의 권장되지만, 0.165 μg의 DNA는 충분하다. </li><li> 얼음 감기, 0.2 mm, 전기의 큐벳에 셀 / transposome 혼합물을 놓고 큐벳의 바닥에 혼합물을 누릅니다. 25 μF 200 Ω, 2.5 kV의를 세포를 충격. 세포가 냉장 상태로 유지되도록 사용하기 전에 -20 ° C 냉동고에서 전기 큐벳을 저장합니다. </li><li> 즉시, catabolite 탄압 (SOC) 매체와 슈퍼 최적의 국물을 살균 필터의 960 μl를 추가합니다. 아래로 피펫 팅에 의해 혼합 및 멸균 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 세포를 전송합니다. NOTE : 세포 충격 후 죽기 시작하지만, SOC 배지 염들을 복구 할 수있다. 절약하기 위해, transposome를 추가하거나 음성 대조군 세포에 충격을 할 필요가 없다. 그냥 멸균 SOC 매체의 960 μl를 추가합니다. </li><li> 30 ° C F에서 세포를 품어120 rpm으로 흔들어으로 45 ~ 60 분. 이 카나마이신 저항을 표현하는 transposome는 세포 숙주 게놈과과에 대한 재결합을위한 시간을 제공합니다. </li><li> LB-관 한천 접시에 세포를 100 μl를 확산하고 30 ° C에서 판 O / N을 품어. 4 ° C의 냉장고에 남아있는 변환 믹스를 저장합니다. 필요한 경우 초기 전기 후 이주에 나중에 업에 추가 금액을 확산. </li></ol> 형질 전환 2. 리딩 <ol><li> 테이프 빈 100 × 15mm 페트리 접시의 뚜껑에 그리드. &quot;세균 유전학의 단기 코스&quot;12에서 그리드를 복사합니다. </li><li> LB-관 한천 플레이트의 하단에 선을 그립니다. 그리드 한천을 통해 볼 수 있도록 격자 덮개에 고정하는 테이프의 작은 조각을 사용한다. 접시의 바닥에있는 선이 그리드의 상단 중앙에 정렬되어 있는지 확인합니다. 테이프와 함께 접시를 정박에도 리딩을 허용, 슬라이딩에서 유지. 라인은 복제 도금 후 식민지의 식별을 용이하게한다. </li><li> 멸균 이쑤시개로 하나의 형질 전환 체를 선택하고 그리드의 사각형의 중심에 자리. 그냥 식민지 그 자리를 터치합니다. 한천에 이쑤시개를 발굴하지 마십시오. 플레이트가 오염되는 것을 방지하기 위해, 하나의 끝 부분에 이쑤시개를 처리합니다. </li><li> 단계 2.3에서와 같이 인접한 광장에서 다른 형질 전환 체를 스팟. 플레이트가 가득 차면, 30 ° C에서 / O N 그것을 품어. 이것은 마스터 플레이트이다. </li></ol> 3. 복제 도금 영양 요구 표현형 (12)를 파악하기 위해 <ol><li> LB-관에 대한 M-9 칸에 대한 LB 관 하나, 둘, 셋 : 격자로 된 각 플레이트를 들어, 세 가지를 통해 하나의 번호가 세 가지 신선한 한천 플레이트의 스택을 확인합니다. 사용하기 전에 37 ° C에서, 거꾸로 O / N를 접시를 건조. </li><li> 단계 2.2에서 각 판의 상단에 선을 그립니다. </li><li> 70 % 에탄올로 복제 도금 도구를 닦아 복제 도금 가기에 멸균 벨벳 광장을 배치OL과 벨벳 광장을 단속. 손 심지어 세척 후 미생물로 가득합니다. 가장자리에 벨벳 광장을 처리하여 미생물 오염의 도입을 방지합니다. </li><li> 클램프에 그려진 선으로 마스터 접시에 선을 정렬하고 벨벳 광장의 상단에있는 플레이트에 배치합니다. 벨벳 광장 판에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 세균이 묻지 않도록주의하십시오. 벨벳 광장에서 마스터 플레이트를 제거합니다. </li><li> 클램프 라인 판 번호 하나에 그려진 선을 정렬하고 벨벳 광장의 상단에 배치합니다. 판에 벨벳 광장에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 판 번호 하나를 제거합니다. </li><li> 물을 비이커에 벨벳 광장 폐기 단계 3.3에서와 같이 복제 도금 도구에 깨끗하고 멸균 벨벳 광장을 배치합니다. 이 단계에 걸쳐 접종 획기적인 성장과 거짓 긍정적 인 결과를 발생 방지 할 수 있습니다. </li><li> 정렬클램프 라인 판 번호 하나에 라인과 새로운 벨벳 광장의 상단에 배치합니다. 벨벳 광장에 판 번호 하나에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 판 번호 하나를 제거합니다. </li><li> 클램프 라인 판 두 번째에 그려진 선을 정렬하고 벨벳 광장의 상단에 배치합니다. 판 두 번째로 벨벳 광장에서 박테리아를 전송하는 부드러운 압력을 적용합니다. 번호판 두를 제거합니다. </li><li> 번호판 세 단계를 반복 3.8. 3 플레이트는 다른 두 판을 마스터 플레이트로부터 완전한 전송을위한 제어이다. 물을 비이커에 벨벳 광장을 폐기하십시오. 그들을 건조, 씻어 알루미늄 호일을 감아을 다시 압력솥, 오염 된 벨벳 사각형이 들어있는 비커를 오토 클레이브, 벨벳 사각형을 다시 사용합니다. </li><li> 30 ° CO / N에 번호판을 품어. 두 LB 칸 아가 플레이트상에서 성장하지만 M-9 칸 플레이트상에서 성장되지 콜로니 영양 요구 (것으로 간주 <st룽&gt; 그림 2). </li><li> 줄무늬와 신선한 LB 관 한천 판에 판 번호를 하나의 영양 요구하고, 30 ° CO / N에서 접시를 품어. </li><li> 격리 신선한 LB 칸 접시에 단계 3.11의 줄무늬 판 3 식민지 밖으로 행진. 30 ° CO / N에서 접시를 품어. 이 돌연변이가 잘 분리되어 있음을 보장합니다. 하나의 섹션에서 각 식민지 밖으로 분에 플레이트와 행진을 나눈다. </li><li> 신선한 LB 칸 접시에 단계 3.12에서 파생 된 아웃 줄무늬 식민지에서 스팟 식민지 단계 2.1-2.4 같이 격자를 형성한다. 각각의 돌연변이 중으로 다시 테스트되고있다. </li><li> 영양 요 표현형을 확인하는 단계 3.1-3.10 같이 다시 판을 복제합니다. </li></ol> 4. 유전자 구조 <ol><li> 30 ° C에서 액체 LB-관 매체에 단계 3.13에서 고립 된 돌연변이 식민지의 3 ㎖의 O / N 문화를 성장. 시판되는 게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 배양액 1mL로부터 게놈 DNA를 정제. </li><li> 0.025 U의 혼합물을 설정BFU CI의 제한 효소와 얼음에 20 μL 반응에서 / μL 게놈 DNA 1 μg의 14 μL. BFU CI 열두 다른 사이트에서 트랜스포존을 인하하기 때문에, 제한 효소, BFA I 또는 각각 두 세 가지 다른 사이트에서 트랜스포존 인하 해일 III를 사용하는 것이 더 효율적일 수있다. </li><li> 25 분 동안 37 ° C에서 반응을 부화 한 후 80 ° C에서 20 분간 효소를 불 활성화하기 위해. 0.8 % 아가 로스 겔 (도 3)에 부분적으로 소화 DNA의 3 μl를 분석한다. 겔의 하단에 위에서 아래 10킬로바이트에서 도말 검사에서 성공적인 부분 소화 결과. </li><li> 500 ㎕의 반응에 T4 DNA 리가 제 (800)의 단위를 사용하여 부분적으로 소화 된 게놈 DNA의 15 μl를 결찰. 반응 O / N에서 4 ℃를 품어. 큰 반응 부피 자체로 하나의 단편의 결찰을 극대화하고, 두 개 이상의 DNA 단편 사이의 상호 작용을 최소화한다. </li><li> 강수테 3 M 아세트산 나트륨, pH가 5.5, 및 1 ml의 95 % 에탄올의 50 μl를 첨가하고 20 분 동안 -20 ° C에서 인큐베이팅하여 DNA 결찰. </li><li> 70 % 에탄올로 펠렛을 씻어 10 분 동안 4 ° C에서 DNA 및 13,500 XG를 미세 원심 원심 진공 농축기에서 건조하고, 뉴 클레아 무료 물 10 μL에서 그것을 재현 탁. 대안 적으로, DNA는 공기는 15 분 동안 RT에서 건조 될 수있다. </li><li> E.를 변환 재현 탁 DNA의 4 μL를 사용하여 제 1 절 R6K γ 복제 원점에서와 같이 전기에 의한 대장균 균주 ECD100D의 PIR 또는 ECD100D의 pir116 6을 복제하는 PIR 유전자와 균주가 필요합니다. 낮은 복사 플라스미드의 PIR 스트레인 결과 및 pir116 변형은 높은 사본 플라스미드 결과 PIR 돌연변이 유전자가 포함되어 있습니다. 각 형질 전환 트랜스포존과 중단 된 염색체 (그림 1E)의 영역으로 새로운 플라스미드가 포함되어 있습니다. </li><li> Inocul단일 콜로니로 LB 칸 배지 5 ㎖를 먹었다, 120rpm으로 37 ° C에서 진탕 / O N 그것을 성장하고, 상업용 키트를 사용하여 전체 O / N의 배양 물로부터 플라스미드 DNA를 정제. </li><li> 제한 엔도 뉴 클레아 제의 I.을 XhoI를 이용 플라스미드를 14 μl를 다이제스트 반응의 최종 부피가 20 μL 있는지 확인합니다. 이 효소는 카나마이신 내성 유전자의 5 &#39;말단에 트랜스포존의 중앙의 위치를​​ 인식한다. 소화되지 않은 10 μl를 분석하고 0.8 % 아가 로스 젤 (그림 3)에 플라스미드를 소화. 플라스미드는 2 킬로바이트 트랜스포존 플러스 측면에서는 숙주 DNA로 구성되어 있습니다. </li></ol> 5. DNA 시퀀싱 <ol><li> 시판의 시퀀싱 키트, 트랜스포존의 각 단부에 상동 프라이머 및 모세관 서열 분석 시스템을 이용하여 플라스미드를 시퀀싱. 또한, 플라스미드는 순서에 대한 외부 기관에 제공 할 수있다. </li><li> 분자량 표준 (1킬로바이트 사다리)으로 사용합니다겔 플라스미드의 크기를 추정한다. 이어서, 50 fmol에 필요한 플라스미드의 나노 그램 (NG)의 개수를 추정한다. </li><li> 260 nm의 (A 260)과 280 nm의 (A 280)의 파장에서 분광 광도계를 사용하여 플라스미드 DNA의 농도를 측정한다. 큐벳을 통해 빛의 경로 길이가 1cm 있는지 확인하십시오. 50 NG / μL로 260 nm에서 흡광도를 곱하여 농도를 결정합니다. 높은 품질의 플라스미드 DNA는 260 / 1.8과 2.0 사이의 280 비율이있을 것이다. </li><li> 각각의 시퀀싱 반응에 필요한 DNA의 부피는 플라스미드의 농도로 나눈 50 fmol 필요한 NG의 수이다. 10 μL로 총 부피를 가지고 물과 필요한 플라스미드의 볼륨을 섞는다. </li><li> 1 분 동안 96 ° C에서 플라스미드 DNA / 물 혼합물을 가열 한 후 RT로 냉각. </li><li> 시퀀싱 키트에서 마스터 믹스 8 μL 및 시퀀싱 프라이머 중 하나의 μM 1.6의 2 μL를 추가합니다. </li><li> FOL열 자전거 타는 프로그램과 반응 정리에 대한 시퀀싱 키트에서 낮은 프로토콜입니다. </li><li> 모세관 DNA 분석 시스템을 이용하여 각각의 샘플을 분석한다. </li><li> DNA 서열을 볼 수 상용 소프트웨어 패키지를 사용합니다. 트랜스포존 (그림 4)의 지난 7 BP되는 순서 &quot;5&#39;-GAGACAG-3 &#39;,&quot;를 검색합니다. 이 7 bp의 세그먼트의 5 &#39;말단 전에 시퀀스 트랜스포존에 속한다. 이 7 bp의 세그먼트의 3 &#39;말단 서열은 이후 중단 유전자에 속한다. </li><li> 기본 지역 맞춤 검색 도구 (BLAST) 7, 8을 사용하여 중단 된 유전자의 가능한 기능을 결정합니다. 다음을 사용하여 link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . 인터럽트의 순서를 붙여 넣기쿼리 상자에 ED 유전자 데이터베이스에서 &quot;기타&quot;를 선택하고 페이지 하단에 &quot;BLAST&quot;을 클릭합니다. 결과가 나타나면, 정렬 결과 (그림 5)을 볼 수 있도록 페이지를 아래로 스크롤합니다. </li></ol>

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transposome을 사용하여 트랜스포존 돌연변이 유발 엔테로 SP의 영양 요구를 생성하기위한 효과적인 도구이다. YSU과 그람 음성의 다른 유형과 그람 양성 세균 3,4. 프로세스는 일렉트로 의해 숙주에 테네시 5 유래 transposome 도입함으로써 개시 하였다. 인서트 콜로니를 확인하기 위하여, 변형되지 않은 대상 균주는 트랜스포존에 의해지지 저항 마커 선택하기 위해 카나마이신에 민...

Prototrophic 박테리아 생합성 1, 아미노산, 핵산, 비타민 등의 전구체를 생성하도록 중앙 탄소 대사 경로를 통해 글루코즈 변환 매체 글루코스 (M-9 매체)를 포함하는 M-9 최소 염 성장. M-9 매체는 탄소 및 에너지 원으로서 황 공급원 및 글루코스 버퍼 및 인 소스, 황산 마그네슘 등의 질소원, 나트륨 및 인산 칼륨 등의 암모늄 클로라이드를 포함한다. 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 트립에서 효모 추출물 비타민과 성장 인자의 아미노산이 풍부하다. 그것은 M-9 매체 상 성장에 필요한 아미노산, 비타민 및 다른 성장 인자를 합성 할 수없는 영양 요구의 성장을 지원한다. 영양 요구는 M-9 매체에 LB 배지에서 성장할 수 있지만 반면 따라서 prototrophs는 LB 및 M-9 배지에서 성장할 것이다. 영양 요 구성 돌연변이 표현형을 야기하는 유전자를 박테리아 prototrophic 인구에 돌연변이를 도입하고 식별함으로써, 포는균주의 대사의 더 나은 이해를 얻을 ssible. 트랜스포존 돌연변이는 M-9 배지에서 포도당에서의 성장에 필요한 유전자의 대부분을 식별하는데 사용될 수있다. 트랜스포존는 숙주 게놈 2에 무작위로 자신을 삽입합니다. M-9 배지 아가 플레이트 상에 LB 아가 플레이트 및 이들을 도금 복제본 트랜스포존 형질을 스폿 팅함으로써, 영양 요구 스크리닝 할 수있다. 중단 된 유전자는 유전자 구조를 통해 확인된다. 본 연구는 시판 테네시 5 트랜스 단백질과 혼합 선형 트랜스포존 DNA 세그먼트의 용액으로서 제공되는 transposome - 유래를 이용한다. DNA 세그먼트는 트랜스 유전자가 부족하지만 카나마이신 저항성 유전자, R6K γ 복제 원점과 세그먼트 3,4의 각 끝 부분에 결합 트랜스에 대한 DNA 서열 두 개의 모자이크 모티브가 포함되어 있습니다. 트랜스 단백질은 DNA 단독 DNA 세그먼트에 직접 첨가되어 있기 때문에트랜스포존으로 정의되고, DNA / 트랜스 단백질 복합체 transposome로서 정의된다. transposome은 카나마이신 민감한 호스트 (그림 1A)에 전기 (5)에 의해 변환된다. 카나마이신 (LB 칸)을 함유하는 LB 아가 플레이트상에서 성장 콜로니를 카나마이신 (M-9 칸) 영양 요구 아르 함유 M-9 배지 아가 플레이트상에서 성장되지 트랜스포존 삽입 (도 1B), 및 복제 도금 형질 (Figire있을 1C). 돌연변이로부터 게놈 DNA 정제 부분적 4베이스 절삭 제한 엔도 뉴 클레아 제, BFU CI (도 1D)로 분해된다. DNA 라이 게이션은 그 PIR 유전자 (도 1E)를 포함 대장균 (E. 콜라이)의 균주에 형질 전환된다. 이 유전자는 새로운 플라스미드 트랜스포존을 포함하고 E.에서 복제 호스트 염색체 영역을 측면에서는 수 있습니다 대장균 6. 카나마이신 내성 유전자와 같은 역할새로운 플라스미드에 대한 electable 마커. 마지막으로, 중단 유전자의 신원을 결정하는 데 사용되는 트랜스포존 얻어진 시퀀스의 기본 로컬 검색 정렬 도구 (BLAST) 분석 7,8의 각 단부에 상보적인 프라이머를 이용하여 시퀀싱. 이 transposome 돌연변이 유발 전략은 세 가지 장점 (3)를 제공한다. 트랜스 단백질 트랜스포존에 직접 결합되기 때문에 먼저, 삽입 호스트 내의 트랜스 유전자의 발현에 의존하지 않는다. 트랜스포존은 숙주 게놈 내로 그 자체를 포함하면 트랜스는 트랜스포존의 추가적인 이동을 방지 저하된다. 호스트가 내인성 테네시 5 transpositional 요소를 소유하는 경우에는, 추가 이동이 방지 될 수 없다. 둘째로, 전기 천공에 의해 도입 transposome은 가능한 호스트 다양한 그것을 사용한다. 또한 접합하여 또는 VI를하여 트랜스포존을 도입 할 필요성을 제거RAL 감염. 두 프로세스는 호스트 감수성을 필요로한다. 셋째, 카나마이신 내성 유전자 및 transposome에서 γ R6K 복제 기원의 포함은 쉽게 중단 유전자를 식별 할 수있다. 트랜스포존 중단 영역 저장 및 유전자 식별을위한 역 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용할 필요가 없어, 플라스미드로 서열화 될 수있다. 이 비디오에 제시된 프로토콜은 엔테로 박터 SP의 트랜스포존 돌연변이 유발을위한 각 단계를 설명합니다. YSU 9는 중단 추정되는 유전자의 식별에 박테리아 세포에 도입에서 transposome를 사용하여. 이전에 출판 프로토콜 3,4,10 이외에 영양 요구에 대해 스크리닝 복제본 도금을 사용하는 상세한 방법이 제시된다. 이 돌연변이 유발 기술은 식별자에 대한 박테리아의 다른 유형에서, 그러한 항생제 저항과 금속과 같은 다른 표현형을 조사하기 위해 사용될 수있다또는 유전학 또는 미생물 생리학 코스의 실험실 구성 요소를 가르치는 합성 생물학 연구에서 정의 된 배양 조건에서 성장에 필요한 유전자의 최소한의 수를 ifying.

<table><tbody><tr><td>EZ-Tn5 R6K&amp;gamma;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>TSM08KR</td><td></td></tr><tr><td>EC100D pir&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Electrocompetent E. coli</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>ECP09500</td><td>Capable of replicating plasmids with an R6K&amp;gamma; replication origin at a low copy number</td></tr><tr><td>EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>EC6P095H</td><td>Capable of replicating plasmids with an R6K&amp;gamma; replication origin at a high copy number</td></tr><tr><td>5X M-9 Salts</td><td>Thermo Fisher</td><td>DF048517</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Broth</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J637-1KG</td><td>Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate&amp;nbsp;</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0408-25G</td><td>When required, media contained 50 &amp;mu;g/ml kanamycin sulfate</td></tr><tr><td>D-Glucose Monohydrate</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J850-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J859-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco, Inc.</td><td>X190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td><td></td><td></td><td>0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 20 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 20 mM Glucose</td></tr><tr><td>BfuC I</td><td>NEB</td><td>R0636S</td><td>Partial digestion of genomic DNA</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td>Plasmid digestion</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Amresco, Inc.</td><td>E476-1L</td><td>For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td></tr><tr><td>GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>608120</td><td>DNA sequencing</td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120A</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>Plasmid purification</td></tr><tr><td>Replica Plating Block</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-1</td><td></td></tr><tr><td>Velveteen Squares</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-2</td><td>Replica plating</td></tr><tr><td>PetriStickers</td><td>Diversified Biotech</td><td>PSTK-1100</td><td>Grid for replica plating</td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II</td><td>BioRad</td><td></td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes &amp;ndash; 2 mm</td><td>BioExpress</td><td>E-5010-2</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td><td>Labconco</td><td>7970010</td><td>Drying DNA</td></tr><tr><td>CEQ 2000XL DNA Analysis System</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>DNA sequencing</td></tr><tr><td>Vector NTI Advance 11.5.0</td><td>Life Technologies</td><td>12605099</td><td>DNA sequence analysis</td></tr></tbody></table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

Prototrophic 박테리아는 탄소 및 에너지 원으로 사용되는 배지 글루코오스 (M-9 배지)로 보충 M-9 최소 염에 성장. 영양 요구는 transposome를 이용하여 생성 될 수있다. 이 프로토콜에 사용되는 상용, 테네시 (5) 유도 된 transposome은 트랜스 결합 부위의 역할을 R6K γ 복제 기원, 카나마이신 저항과 두 개의 모자이크 순서 종료하는 유전자를 포함하는 DNA의 선형 세그먼트로 구성되어 있습니다. DNA / 트랜스 단백질 복합체로서 제공 transposome는, prototrophic 균주, 엔테로 SP는 일렉트로로 도입된다. YSU, 그리고 무작위로이 숙주의 게놈에 자신을 통합합니다. 형질 전환 체는 카나마이신 (LB 칸)을 함유하는 한천 플레이트 루리아 - 베르 타니에 도금 복제본 카나마이신 (M-9 칸)을 함유하는 M-9 배지 아가 플레이트 상이다. M-9 칸 접시에 LB-관 판에 성장하지만 형질 전환 영양 요구로 간주됩니다. 정제 게놈영양 요구로부터 DNA는 부분적으로 소화 PIR + 대장균 (E. 콜라이) 균주에 결찰 및 변환된다. R6Kγ 복제 원점은 플라스미드 PIR + E.에 복제 할 수 있습니다 콜라이 균주 및 카나마이신 저항 마커 플라스미드의 선택을 허용한다. 각 형질 전환 중단 된 염색체 영역에 의해 측면에 트랜스포존을 포함하는 새로운 플라스미드를 보유하고있다. 생거 시퀀싱 및 기본 지역 맞춤 검색 도구 (BLAST)는 중단 된 유전자의 추정 정체성을 제안한다. 이 transposome 돌연변이 유발 전략을 사용하는 세 가지 이점이있다. 첫째, 호스트에 의한 트랜스 유전자의 발현에 의존하지 않는다. 둘째, transposome는 전기에 의하여보다는 접합 또는 형질 도입에 의하여 대상 호스트에 도입하고, 따라서보다 효율적이다. 셋째, R6Kγ 복제 원점 쉽게 돌연변이 g을 식별 할 수있게부분적으로 재조합 플라스미드에 복구 에너지. 이 기술은 엔테로 박터 (SP)의 다른 특성에 관여하는 유전자를 조사하기 위하여 사용될 수있다. YSU 또는 균주의 넓은 다양한.

엔테로 박터 SP의 변환. transposome와 일렉트로 의해 YSU는 숙주 게놈 (도 1A, B)에 임의의 게놈 삽입을 개시. 성공적인 전기는 LB-관 판에 성장 수천 개의 형질 전환 체를 얻었다. 300 ~ 400를 얻으려면, 판 당 식민지를 잘 간격, 각 LB 관 한천 접시에 변환 혼합 확산의 양을 최적화했다. 각 형질 전환 체는 적어도 하나의 트랜스포존 삽입물을 포함하지만, M-9 매체상의 성장에 중요한 유전?...

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Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다.

생성<em&gt; 엔테로 박터</em&gt; SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

13.8K 조회수.  Youngstown State University.  엔테로 박터 SP. YSU는 포도당 최소 염 배지에서 성장한다. 영양 요구 임의로 숙주 게놈 내로 그 자체를 삽입 transposome로 변환함으로써 생성된다. 돌연변이는 최소 배지에 복잡한 매체로부터 복제 도금에 의해 발견된다. 중단 된 유전자는 유전자 구조 및 시퀀싱에 의해 식별됩니다. 

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Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic characteristics, this unconventional yeast is not only a good model for the study of the fundamental nature of fungal differentiation but is also a promising microbial platform for biochemical production and various biotechnological applications, which require extensive genetic manipulations. However, genetic manipulations of Y. lipolytica have been limited due to the lack of an efficient and stable genetic transformation system as well as very high rates of non-homologous recombination that can be mainly attributed to the KU70 gene. Here, we report an easy and rapid protocol for the efficient genetic transformation and for gene deletion in Y. lipolytica Po1g. First, a protocol for the efficient transformation of exogenous DNA into Y. lipolytica Po1g was established. Second, to achieve the enhanced double-crossover homologous recombination rate for further deletion of target genes, the KU70 gene was deleted by transforming a disruption cassette carrying 1 kb homology arms. Third, to demonstrate the enhanced gene deletion efficiency after deletion of the KU70 gene, we individually deleted 11 target genes encoding alcohol dehydrogenase and alcohol oxidase using the same procedures on the KU70 knockout platform strain. It was observed that the rate of precise homologous recombination increased substantially from less than 0.5% for deletion of the KU70 gene in Po1g to 33%-71% for the single gene deletion of the 11 target genes in Po1g KU70&#916;. A replicative plasmid carrying the hygromycin B resistance marker and the Cre/LoxP system was constructed, and the selection marker gene in the yeast knockout strains was eventually removed by expression of Cre recombinase to facilitate multiple rounds of targeted genetic manipulations. The resulting single-gene deletion mutants have potential applications in biofuel and biochemical production.

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

연구

유전학

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated biological pathways to the benefit of the bacterium. Identification of putative bacterial effector proteins has become more manageable due to advances in bacterial genome sequencing and the advent of algorithms that allow in silico identification of genes encoding secretion candidates and/or eukaryotic-like domains. However, identification of these important virulence factors is only an initial step. Naturally, the goal is to determine the molecular function of effector proteins and elucidate how they interact with the host. In recent years, techniques like the yeast two-hybrid screen and large-scale immunoprecipitations coupled with mass spectrometry have aided in the identification of protein-protein interactions. Although identification of a host binding partner is the crucial first step toward elucidating the molecular function of a bacterial effector protein, sometimes the host protein is found to have multiple biological functions (e.g., actin, clathrin, tubulin), or the bacterial protein may not physically bind host proteins, depriving the researcher of crucial information about the precise host pathway being manipulated. A modified yeast toxicity screen coupled with a suppressor screen has been adapted to identify host pathways impacted by bacterial effector proteins. The toxicity screen relies on a toxic effect in yeast caused by the effector protein interfering with the host biological pathways, which often manifests as a growth defect. Expression of a yeast genomic library is used to identify host factors that suppress the toxicity of the bacterial effector protein and thus identify proteins in the pathway that the effector protein targets. This protocol contains detailed instructions for both the toxicity and suppressor screens. These techniques can be performed in any lab capable of molecular cloning and cultivation of yeast and Escherichia coli.

Bacterial pathogens secrete proteins into the host that target crucial biological processes. Identifying the host pathways targeted by bacterial effector proteins is key to addressing molecular pathogenesis. Here, a method using a modified yeast suppressor and toxicity screen to elucidate host pathways targeted by toxic bacterial effector proteins is described.

효모 독성 및 억제기 스크린을 사용하여 세균 효과 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로의 확인

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

면역학 및 감염병학

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

모듈형 골든 게이트 복제를 사용하여 다중 유전자 구조물의 신속한 조립

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

생체공학

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

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Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

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