이 프로토콜은 RNA 무결성을 보존하는 데 도움이 되는 사후 인간 뇌 조직에 염료 기반 시각화 대신 얼룩이 없는 시각화 방법을 활용하기 때문에 중요합니다. RNA의 보존은 이 프로토콜에서 큰 이점입니다, 그것은 유용, 뿐만 아니라 사후 인간 뇌 조직에서, 뿐만 아니라 다른 조직 유형, 높은 RNase 활동. 먼저, 냉동고에서 조직을 제거하고 냉동고로 운반하기 위해 드라이 아이스에 놓습니다.
깨끗한 브러시, 척 및 조직을 극저온에 20분 이상 넣고 최적의 온도에 도달할 수 있도록 합니다. 이중 챔버와 시편 유지 온도가 있는 저온의 경우 물체 온도를 영하 16도, 챔버 온도를 영하 18도로 설정합니다. 저온측정기의 단면 두께를 14마이크로미터로 설정하고 트림 두께를 30마이크로미터로 설정합니다.
다음으로, RNase 오염물질과 70%에탄올의 일대일 혼합물로 무대를 청소하여 동결을 방지합니다. 새로운 일회용 저온 극저온 블레이드를 얻고 RNase 오염 제거물질로 청소하십시오. 청소된 블레이드를 블레이드 홀더에 배치합니다.
그런 다음 RNase 오염 제거제로 롤 방지 플레이트를 청소하십시오. 청소된 접시를 무대에 부착하고 블레이드와 롤 방지 판이 극저온의 온도까지 내려올 때까지 적어도 20 분 동안 기다립니다. 첫째, 단면에 대한 조직의 작은 조각을 잘라, 섹션이 약 95 %의 소뇌 피질인지 확인.
나머지 조직을 드라이 아이스또는 냉동고에 영하 80도에서 반환합니다. 다음으로, 천천히, 원형 동작척 위에 OCT를 추가하기 시작합니다. 척을 덮고 있는 약 3밀리미터 높이의 마운트가 있을 때까지 OTC 층을 구축합니다.
OCT가 부분적으로 동결되었지만 여전히 중앙에 액체가 있는 경우 조직을 마운트 위에 놓습니다. 조직이 완전히 얼어 붙을 때까지 1 ~2 분 동안 1 0 월 위에 앉게하십시오. 그런 다음 냉동 10 월 및 조직으로 척을 냉동 절단 팔로 옮킨다.
조직을 커팅 블레이드와 함께 플러시하고 조직이 절단 팔에 20 분 동안 앉아 새로운 온도에 적응하도록 조정합니다. 가장 중요한 단계는 조직이 필요한 기간 동안 극저온 절단 팔에 적응할 수 있도록 하는 것입니다. 조직이 분쇄되면, purkinje 세포 시각화는 매우 어려울 것입니다.
조직이 더 빨리 적응할 수 있도록 조직의 더 작고 얇은 조각을 사용하는 것이 좋습니다. 그 후 조직을 블레이드에 가깝게 천천히 이동합니다. 조직이 블레이드에 도달하면 트리밍 과정을 시작합니다.
피질 층이 보일 때까지 조직을 2~3회 다듬습니다. 다음으로, 냉동 블레이드 바로 위에 안티 롤 플레이트를 배치하고 정렬합니다. 14 마이크로미터 두께의 4~6개의 섹션을 잘라 내어 제대로 절단된 섹션이 롤 방지 플레이트 아래에 평평하다는 점에 주목합니다.
저스트스테이지를 가로질러 절단 된 부분을 수평으로 정렬합니다. 슬라이드를 각도로 모든 조직 조각을 동시에 집어 들수 있습니다. 조직을 단면한 직후 슬라이드를 70%에탄올로 슬라이드 홀더에 2분간 얼음 위에 놓습니다.
슬라이드를 얼음 위에 95%의 에탄올이 있는 슬라이드 홀더로 45초 동안 전송합니다. 다음으로 슬라이드 홀더에 100% 에탄올을 실온에 2분간 놓습니다. 실온에서 자일렌 넘버 1이 들어있는 슬라이드 홀더에 슬라이드를 세 번 찍어 넣습니다.
그런 다음 슬라이드 홀더에 실온에서 2 개의 자일렌2를 5 분 동안 놓습니다. 깨끗한 연기 후드에 슬라이드를 서서 적어도 30 분 동안 공기를 건조하게하십시오. 슬라이드를 저장하는 경우 각 튜브를 별도의 50 밀리리터 튜브에 넣고 튜브를 섭씨 영하 80도에서 최대 7일 동안 냉동실에 넣습니다.
먼저 RNase 오염제거기를 사용하여 현미경 단계와 캡 수집 암을 청소하십시오. 장갑을 낀 손으로 슬라이드를 현미경에 놓고 500 마이크로리터 불투명 캡을 수집 팔에 놓습니다. 낮은 배율에서, 소뇌 조직 위에 불투명 캡을 정렬하여 캡이 눈조각에 시각화되는 전체 영역을 덮을 수 있도록 보장합니다.
5배에서 10배의 목표를 사용하여 소뇌 층을 시각화합니다. 분자 층과 과립 세포 층이 교차하는 섹션 위에 커서를 놓습니다. 40배 배율로 이동하고 퍼킨제 세포를 시각화한다.
그런 다음 캡처를 시작합니다. 마이크로 절제 후 RNA 수집을 시작하려면 캡이 위로 향하도록 불투명 한 캡에 셀 리시스 버퍼 50 마이크로 리터를 추가합니다. 조심스럽게 캡 위에 튜브를 닫고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 컬렉션을 진행합니다.
이 프로토콜에서, 신선한, 냉동, 사후, 인간의 뇌 조직은 UV 레이저 캡처 미세 절에 대한 준비가되어 있습니다. 할당된 드로잉 타임에 극저고의 절개에 이어, 소뇌의 세포 층은 5배, 10배의 객관적인 렌즈로 쉽게 볼 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 적절한 자일렌 인큐베이션은 조직이 어두워지고 에탄올만하는 것보다 세포 층을 더 잘 묘사합니다.
레이저 포획 현미경에서 절단할 때, 40배의 객관적인 렌즈는 주변 조직이 아닌 퍼킨제 세포만 캡처할 수 있도록 하는 데 필요합니다. 여기서 볼 수 있듯이, 자일렌의 적절한 인큐베이션은 에탄올 고정에만 비해 고품질의 형태학적 으로 손상되지 않은 이미지를 생성합니다. 불투명 캡의 커버 슬립 능력은 다른 프로토콜이 액체 채워진 캡을 활용하는 동안 테스트되며, 이러한 캡은 조직 시각화를 줄이고 현미경하에서 결과 이미지가 세분화되고 무지개 빛깔로 만들 수 있습니다.
그러나 불투명한 캡을 통한 시각화는 형태가 부드럽고 선명한 매끄러운 조직 외관을 초래합니다. 저전력과 고출력에서 절제된 퍼킨제 세포의 대표적인 이미지는 퍼킨제 세포 체체만을 정밀하게 제거한 것을 보여준다. 그 후, 고품질 Rnase는 후속 RNA 염기서열분석에 대해 수득된다.
6개의 대표적인 견본은 RNA 추출을 겪었고 Rnase 없는 물의 14마이크로리터에서 재중단되고 모든 6개의 견본은 RNA 무결성 수와 동일하거나 8개 이상 인 고품질 RNA를 생성했습니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 조직의 품질이 전부라는 것입니다. 절단 및 슬라이드 배치조차도 이 프로토콜을 만들거나 중단합니다.
이 절차에 따라, RNA 또는 DNA를 조사하는 어떤 방법든지, 특히 우리는 차동 유전자 발현을 위해 우리의 RNA를 탐구합니다, 그러나 유전자 규칙에 관하여 그밖 질문도 조사될 수 있었습니다. 이 방법은 관심있는 세포의 식별을 위해 항원 또는 염료 특이 시약의 사용을 필요로하지 않는 특정 묘사 형태학이있는 조직 유형에 적용 될 수있다. 우리는 이 기술이 우리가 떨림 표현형이 있는 필수적인 떨림 및 그밖 질병의 유전학을 이해하는 것을 도울 것이라는 점을 희망합니다.
이 프로토콜에 사용되는 가장 위험한 화학 물질은 자일렌입니다. 연기 후드에 제대로 처리해야 하며, 제대로 폐기해야 하며, 슬라이드는 열린 공간에서 사용될 때까지 적절하게 건조할 수 있어야 합니다. 또한, 인간의 샘플과 함께 작업 할 때, 생물 위험 폐기물 관리 및 안전을 활용해야한다.
