3세대 나노포어 시퀀싱은 다양한 시료로부터 서열 정보를 매우 쉽게 얻을 수 있는 강력한 새로운 시퀀싱 기술이다. 이 기술의 주요 장점은 시퀀싱 장치의 휴대성, 매우 긴 읽기 길이 및 데이터의 실시간 가용성입니다. 나노포어 시퀀싱은 원격 위치에서 질병 발생 시 특히 유용한 기술입니다.
그것은 성공적으로 서아프리카와 중앙 아프리카에서 에볼라 바이러스 발발 도중 그리고 후에 필드 실험실에서 이용되었습니다. 이러한 목적을 위해 MinION 장치의 사용은 다소 쉽고, 라이브러리 준비 중 및 유동 셀 로딩 중에 주의해야 한다. 이 절차를 시작하려면, 하나의 마이크로리터 템플릿으로 50 마이크로리터 반응 부피의 적절한 반응 버퍼로 핫 스타트 고충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 프라이머 세트로 cDNA를 증폭시키기 위해 터치 다운 PCR을 설정합니다.
가능하면 얼음이나 시원한 블록에 4도의 반응을 설정하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 열순환기의 반응을 배양합니다. 그 후, PCR 제품의 50 마이크로리터를 1.5 밀리리터 DNA 저결합 반응 튜브로 이송한다.
소용돌이에 의해 자기 구슬을 철저히 재중단합니다. 그런 다음 PCR 반응에 50 마이크로 리터의 구슬을 추가하고 잘 섞습니다. 15 RPM에서 회전하는 동안 실온에서 5 분 동안 회전 믹서에 샘플을 배양합니다.
샘플을 잠시 회전한 다음 튜브를 자기 랙에 놓고 자기 구슬을 펠릿합니다. 계속하기 전에 상체가 완전히 명확해질 때까지 기다립니다. 다음으로, 비드 펠릿을 방해하지 않고 상류체를 흡인하고 폐기하십시오.
파이펫 200 마이크로리터70%에탄올은 반응 튜브에 넣고 실온에서 30초 동안 배양합니다. 비드 펠릿을 방해하지 않고 에탄올을 흡입하고 폐기하십시오. 총 2개의 세척을 위해 에탄올로 이 세척 과정을 다시 한 번 반복하십시오.
실온에서 1분 동안 펠릿을 공기 건조시다. 그런 다음 자기 랙에서 반응 튜브를 제거합니다. 펠릿을 30마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터로 재중단하고 실온에서 2분간 배양한다.
반응 튜브를 자기 랙에 다시 놓고 반응 구슬이 완전히 펠릿될 때까지 기다립니다. 그 후, 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거하고 새로운 1.5 밀리리터 반응 튜브로 옮김한다. 여러 샘플이 동시에 시퀀스되는 경우 바코드는 이제 두 개의 추가 PCR 단계로 추가한 다음 이전에 표시된 DNA 정리를 추가할 수 있습니다.
첫째, 0.2 밀리리터 반응 관에서 45 마이크로리터의 부피에서 DNA의 총 1 마이크로그램에 대해 각 샘플에서 동일한 양의 바코드 된 DNA를 결합합니다. dA-Tailing의 경우 최종 준비 반응 버퍼 7개, 최종 준비 효소 믹스 3개, 뉴클레아제 프리 워터 5마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 쓸어 섞습니다.
열순환기에서는 섭씨 20도에서 5분간 반응한 후 섭씨 65도에서 5분간 배양합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 반응 제품의 PCR 정제를 수행한다. 선택적으로, UV 분광광계를 사용하여 샘플의 농도를 정량화하기 위해 하나의 마이크로리터를 복용한다.
1D2 어댑터의 2.5 마이크로리터와 새로운 1.5 밀리리터 DNA 저결합 반응 튜브에 블런트/TA 리개아제 마스터 믹스 25 마이크로리터와 이전에 획득한 정제된 DNA의 22.5 마이크로리터를 결합합니다. 튜브를 부드럽게 쓸어 섞습니다. 혼합물을 잠시 회전시키고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 반응 제품의 PCR 정제를 수행합니다. 반응 제품의 45 마이크로리터와 바코드 어댑터 믹스 5마이크로리터, DNA 저결합 반응 튜브에 블런트/TA 리개세 마스터 믹스 50마이크로리터를 결합합니다. 부드럽게 혼합하고 실온에서 10 분 동안 배양합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 반응 생성물을 정화하고 결과 제품을 얼음이나 섭씨 4도에 저장하여 사용할 준비가 될 때까지 보관합니다. 먼저 사용하기 전에 유량 셀에 대한 품질 검사를 수행합니다. 이를 위해 시퀀싱 장치를 호스트 컴퓨터에 연결하고 소프트웨어를 엽니다.
흐름 셀을 시퀀싱 장치에 삽입합니다. 그런 다음 선택기 상자에서 흐름 셀 유형을 선택하고 확인하려면 사용 가능한 클릭합니다. 화면 하단에서 흐름 셀을 확인하고 올바른 흐름 셀 유형을 선택합니다.
테스트를 시작하려면 테스트 시작을 클릭하여 품질 검사를 시작합니다. 유동 셀을 사용할 수 있도록 최소 800개의 활성 나노포지가 필요합니다. 먼저 시계 방향으로 슬라이딩하여 프라이밍 포트 커버를 엽니다.
P1000 파이펫을 200 마이크로리터로 설정하고 팁을 프라이밍 포트에 삽입합니다. 그런 다음 파이펫을 230 마이크로리터로 조정하면서 프라이밍 포트에 팁을 유지하면서 버퍼 20~30마이크로리터를 끌어내고 기포를 제거합니다. 새로운 1.5 밀리리터 DNA 저결합 반응 튜브에서 RBF 완충제 576 마이크로리터와 624 마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터를 결합하여 프라이밍 믹스를 준비한다.
준비된 프라이밍 포트에 800 마이크로리터를 조심스럽게 파이펫하고 5분간 기다립니다. 그 후, 샘플 포트 커버와 파이펫을 프라이밍 포트에 준비된 프라이밍 믹스의 200 마이크로리터를 추가로 들어올립니다. 새로운 깨끗한 1.5 밀리리터 DNA 저결합 반응 튜브로 RBF 버퍼의 파이펫 35 마이크로리터.
PIPEtting하여 LLB 구슬을 철저히 혼합하고 RBF 버퍼에 구슬 25.5 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 2.5 마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터와 DNA 라이브러리 12마이크로리터를 추가하고 파이펫팅하여 혼합합니다. 샘플 포트를 통해 유량 셀에 느린 드롭 현명한 방식으로 샘플 혼합물의 75 마이크로리터를 추가합니다.
그런 다음 샘플 포트 덮개를 교체하고 프라이밍 포트를 닫고 시퀀싱 장치의 뚜껑을 닫습니다. 소프트웨어 내에서 흐름 셀을 계속 사용할 수 있는지 확인합니다. 새 실험을 열고 사용된 키트를 선택하여 실행 매개 변수를 설정합니다.
라이브 베이스콜을 선택합니다. 시작 실험을 클릭하여 시퀀싱 실행을 시작합니다. 충분한 실험 데이터가 수집될 때까지 시퀀싱 실행을 계속합니다.
대표적인 실험에서, RNA는 5개의 동물 종에게서 10개의 상이한 혈액 샘플에서 추출됩니다. RNA 농도는 마이크로리터 당 43 나노그램과 543 나노그램 사이에서 관찰됩니다. RT-PCR에 의해 증폭 된 후, MPC1 PCR 제품의 젤 분석은 샘플 BC01 및 BC02에 대한 현저하게 약한 대역으로 다양한 결과를 보여줍니다.
이러한 차이는 샘플 품질의 차이에 의해 발생할 가능성이 높지만 다른 종의 MCP1 유전자에 결합하는 프라이머의 차이로 인한 PCR 효능의 차이는 배제될 수 없다. 그러나 수율 및/또는 증폭 효율의 이러한 차이는 전체 시퀀싱 결과에 현저히 영향을 미치지 않습니다. 10, 000개의 하위 집합을 획득한 다음 추가 분석을 위해 선택되고 다변화됩니다.
분석된 10, 000 판독 중 5, 457은 워크플로우의 일부로 증폭된 PCR 단편에 대한 예상 크기와 일치하는 1, 750 및 2, 000 뉴클레오티드 사이의 길이를 나타낸다. 읽기의 길이 분포에 있는 추가 피크는 특이한 PCR 제품에 기인할 수 있는 250에서 500의 뉴클레오티드 사이에서 관찰됩니다. 읽기의 디멀티플렉싱을 사용하면 분석된 10개의 샘플 중 하나에 읽기의 87.6%를 할당할 수 있습니다.
이 방법은 매우 신뢰할 수 있지만, 필드 조건에서, PCR 증폭은 가장 문제가 단계입니다. 우리의 경험 동안, 중첩 프로토콜은 종종 대상 시퀀스를 증폭하는 데 필요했다. 동물 호스트 유전자를 시퀀싱하는 것 외에도,이 방법은 바이러스 성 또는 세균성 병원체를 포함한 모든 DNA 또는 RNA를 서열화하는 데 사용할 수 있습니다.
따라서 나노포어 시퀀싱은 질병 발병 중뿐만 아니라 원격 지대의 과학적 연구뿐만 아니라 긴 읽기 길이가 흥미 진진한 새로운 연구 가능성을 열어 놓은 일반 실험실에서도 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 사용된 시약중 어느 것도 특히 위험하지는 않지만 표준 좋은 실험실 관행을 따라야 합니다. 분명히 질병 에이전트를 시퀀싱 할 때, 이러한 에이전트를 처리하기위한 필요한 모든 예방 조치를 준수해야합니다.
