The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children&#8217;s Hospital Mission Support Funds.

참고 : 모든 절차가 아리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)을 준수하여 수행 하였다. 추천 재료 및 장비의 목록은 표 1에서 찾을 수있다. 1. 조직 준비 <ol><li> 관류 <ol><li> 소듐 펜 토바 비탈 (25 ㎎ / ㎏, IP)의 과다와 설치류를 안락사, 8 ml / 분의 유속으로 완전히하여 죽인 (3-5 분)까지의 인산 완충 식염수 (PBS)을 관류로 transcardially. 깊이있는 관류 지침, 게이지 등 2012 9를 참조하십시오. </li><li> 즉시 / 분 8 ㎖의 유속에서 15 ~ 20 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 관류하여 조직을 고정, PBS 플러시 다음. </li><li> 4 ℃에서 (트리스 완충 식염수를 제조 순서로, 15 %, 30 %, 30 %) 등급 자당 솔루션 다음 24 시간에 대해 4 % 파라 포름 알데히드의 두뇌와 장소를 제거합니다. 이후 자당 솔루션 O에 뇌 이동할수 있답니다 뇌 후 각 솔루션에 침몰했다. 참고 : 일반적으로, 각 솔루션에 오일이 조직이 싱크에 충분한 시간이다. </li></ol></li><li> 조직의 냉동 및 냉동 절편 <ol><li> 등의 OCT 화합물로서 매체에 매립 뇌를 놓고 -35 ℃에서 펜탄으로 잠수함. 뇌가 10 분의 최소 동결 한 후 -80 ℃에서 저장할 수 있습니다. 온도 실사 촬영되지 않은 경우 문제가 발생할 수 있습니다; 문제 해결 정보에 대한 설명을 참조하시기 바랍니다. </li><li> 20 ㎛의 두께 및 -20 ° C의 온도에서 직렬 관상 단면을 잘라. 양으로 대전 된 슬라이드에 조직을 수집합니다. 뇌 부분은 -80 ° C에서 지퍼 가기 가방과 저장 장기적으로 호일에 싸여 슬라이드 상자에 배치 될 수있다. 저장이 방법은 공기, 서리에 노출되는 것을 방지하기위한 이중 경계를 생성한다. </li></ol></li></ol> 2. 조직 처리 참고 : 예 장비 및 재료 연구염색에 대한 equired은 그림 3과 같다. 대안을 사용할 수 있습니다, 그러나, 이러한 이미지는 면역 조직 화학 염색에 새로운 그 전에 구입에 적절한 항목을 시각화하는 데 도움이됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> 도 3 : 실시 예 항목이 면역 조직 화학 염색을 위해 요구 (A)에 도시 한 블랙 박스 면역 이상적인 습도 챔버 인, 슬라이드 호에 박스 포장을 필요로하지 않고 광으로부터 보호되어있다.. 단면 처리 후, 슬라이드 등의 (B)에 도시 한 바와 같이 상자 노란 박스에 저장 될 수있다. 호일로 단단히 상자를 포장 전에 냉장고에 지퍼 가기 가방에 배치하는 것은 냉동 화상에서 조직 샘플을 보호하는 데 도움이됩니다. 슬라이드의 예는 E (다른 염색 (D)에 도시 된 요리와 (C)에서 주어진다 </strong&gt;). 커버 슬립 그러나 1.2 두께 된 커버는 대부분의 수직 및 공 초점 현미경에 좋은 이미징 결과를 제공, 크기와 두께 (F)에 따라 다를 수 있습니다. 이러한 (G)에 나타낸 것과 연필 슬라이드 라벨을 사용할 수있다. 잉크가 실행할 수있는 영구 마커 염색 표본이 무엇인지를 결정하는 기능 모두에 영향을 피해야한다. 즉, (H)에 도시 된 바와 같이 미니 PAP 펜 구충제 테두리 슬라이드에 그려 질 수 있습니다. <ol><li> 슬라이드 준비 <ol><li> 실온에서 냉동과 해동에서 슬라이드를 제거합니다. <ol><li> 옵션 : 섹션이 이전 슬라이드에서 부유 한 경우, 슬라이드를 떠에서 조직 섹션을 방지하기 위해 더 이상 4보다 시간 동안 60 ℃의 오븐에서 해동 슬라이드를 배치합니다. </li></ol></li><li> 슬라이드 랙 및 대응 접시에 놓고 슬라이드. </li><li> 세척은 세척 용액 간의 변화, 5 분마다 PBS 세 번 슬라이드. 앞으로이 단계에서 섹션에 ì을 피하기기능 장시간 액체없이. 주 : 섹션 건조하면 배경 염색이 증가하고 의미있는 데이터를 확실하게 얻을 수 없다. </li></ol></li><li> 조직 염색 <ol><li> 빛을 꽉 염색 상자에서, 탈 이온수로 적신 보풀이없는 조직과 &quot;습도 챔버를&quot;만들 수 있습니다. </li><li> 멀리 조직 섹션에서, 슬라이드의 맨 가장자리에 액체 구충제 테두리 만들기 위해 미니 아빠 펜을 사용, 보풀이없는 조직과 슬라이드의 가장자리를 건조. 이 경계선은 액체의 메 니스 커스 그 표면 장력이 염색에 영향을주지 않도록 조직의 가장자리 사이의 충분한 공간을 확보한다. 참고 : 관심의 항체가 전자 항원 검색을 필요로하지 않는 경우 PAP 펜 구충제 테두리 이전에 2.1.3에 적용 할 수 있습니다. PAP 펜 PBS로 세척하기 전에 적용된 경우 액성 테두리의 무결성은이 단계에서 체크한다. 경계에 틈을 채우기 위해 미니 자궁 펜을 사용합니다. </li><li슬라이드 가로 배치로&gt;, 블록 특이 항원은 PBS (블록 솔루션)에 4 % V / V의 혈청 배양에 의해 결합. 피펫 실온에서 1 시간을위한 슬라이드 당 블록 솔루션의 300 μL. 반드시 블록 용액 슬라이드의 가장자리 PAP 펜까지 연장 완전히 조직 근처 표면 장력에 의한 염색 얼룩을 방지하기 위해 조직을 포함합니다. <ol><li> 이차 항체가 만들어지는 동일한 종에서 혈청을 사용합니다. 주 :이 절차에서는, 이차 항체는 당나귀에서 만들어진, 따라서 당나귀 혈청이 사용된다. 두 개 이상의 다른 종으로부터의 이차 항체가 사용되는 경우, 각각의 종으로부터 혈청을 포함한다. </li></ol></li><li> 슬라이드 위에 피펫 차 항체. 참고 :이 염색에 대한 항체 농도가 1에 최적화 된 5,000 및 1 : 각각 Iba1 및 팬 신경 500. 이러한 농도는 배경 염색의 결핍으로 의미있는 염색을 보여주는 것으로 밝혀졌다. <ol><li> 에 블록 솔루션을 희석1 % PBS에서 혈청 및 일차 항체를 추가합니다. 슬라이드 당 1 % 혈청 차 항체 용액 300 ㎕를 피펫. 다시 말하지만, 유체가 PAP 펜의 가장자리에 있는지 확인하십시오. 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> Iba1도 팬의 연결도 항체를 포함하는 하나의, 팬 - 신경 세포의 항체가없는 Iba1 하나, 그리고 Iba1없이 팬의 연결 항체와 한 세 가지 제어 슬라이드를 포함합니다. 그러나 차 항체의 결합을 비 특정 테스트를 일차 항체를 생략 동일한 솔루션 같은 런 이러한 슬라이드 얼룩. </li></ol></li><li> 다음 날 아침, 세척은 세척과 솔루션을 변경, 5 분마다 PBS에 세 번 슬라이드. </li><li> 형광 항체는 앞으로이 단계에서, 검은 색 또는 어두운 곳에서 배양 중 하나입니다 세척 용기가 박 및 하이브리드 상자에 포장되어 보장함으로써 빛의 노출을 최소화 따라서, 빛에 민감하다. 모든 슬라이드에 적절한 보조 항체를 피펫과 부화1의 농도로 실온에서 60 분 : 블록 용액 250 라이트 타이트 &quot;습도 챔버&quot;에 (단계 2.2.3 참조) (단계 2.2.1 참조). <ol><li> 서로 다른 파장의 이차 항체를 사용합니다. 여기서, 일차 항체 토끼 항 Iba1은 해당 이차 항체로서 당나귀 항 - 토끼 (594)를 사용한다. 일차 항체가 마우스 항 - 팬 신경은 해당 이차 항체로서 당나귀 항 마우스 (488)를 사용한다. 또는, 항 - 토끼 488 및 항 - 마우스 (594)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 세척을 5 분마다 PBS 세 번 슬라이드. </li><li> 옵션 : 핵 염색을 수행합니다. <ol><li> 정확히 60 초 동안 두 번 증류수 H 2 0에서 0.03 μg / ml의 농도 훽스트 (또는 다른 핵 얼룩)에 놓습니다. </li><li> 세척을 5 분마다 PBS 세 번 슬라이드. </li></ol></li><li> DDH 2 0 씻으십시오. </li></ol></li><li> Coverslipping <ol><li> 같은 형석 등의 수성 장착 매체 커버 슬립 슬라이드,omount-G 또는 ProlongGold. 면봉을 사용하여 모든 거품을 제거하기 위해주의하십시오. 참고 : 다른 설치 에이전트를 사용할 수 그러나 높은 블리드을 통해 염료 사이는 coverslipping의 일 이내에 일부가 주목되고있다. </li><li> 가장자리를 밀봉 명확한 매니큐어를 사용하여 증발에 의한 건조되는 부분을 방지 할 수있다. 슬라이드는 평평하고 실온에서 유지하면서 매니큐어가 빛을 꽉 용기에 건조 할 수 있도록 허용 한 후 4 ℃에서 호일에 싸여 빛 기밀 용기에 저장합니다. </li></ol></li></ol> 3. 스테인드 조직 이미징 <ol><li> 현미경 사용 <ol><li> 매니큐어는 어두운 방에서 개최해야하는, 현미경을 시작하기 전에 한 시간 이상 건조시킵니다. </li><li> 형광 광원과 디지털 카메라의 첨부 파일이있는 공 초점 또는 연구 현미경을 사용하여 현미경을 획득. 수반 소프트웨어를 사용하여 각 파장에 대한 노출 설정 - 405, 488, 및 594 - 별도. 참고 : 깊이있는 영상 지침은 현미경 제조 업체에서 온라인으로 사용할 수 있어야한다. </li><li> 섹션을 이동하거나 초점을 조정하지 않고 각 채널에서 현미경을 획득. 컬러로 이미지를 가지고, 또는 교대로 그레이 스케일과 이후에 색상을 변환 할 수 있습니다. 참고 : 컬러 또는 각 채널에서 그레이 스케일 이미지 후 처리에 대조 할 수 있습니다. </li><li> 섹션의 사진 표백가 발생하므로, 그 조직 섹션은 오랜 기간 동안 주변 광 또는 미세한 빛에 노출되지 않도록. 이를 방지하기 위해, 증가 빛 / 레이저 강도보다는 노출 시간을 증가시킨다. </li><li> 전원이 켜진 후 30 분 이내에 형광 광원의 전원을 끄지 마십시오. 참고 : 빠르게 연속 켜거나 소스를 전환 형광 전구의 수명을 감소시킬 수있다. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

이 통신의 전반적인 목표는 독자에게 면역 조직 화학 절차를 소개했다. 이를 위해, Iba1 및 팬 신경 항원에 두 번 라벨의 예는 미세 아교 세포 및 관류 파라 포름 알데히드의 신경 세포를 관찰하기 위해, 자당 cryoprotected, 저온 절단 된 쥐의 뇌를 사용 하였다. 이 기술은 무단 목적을 제공하도록 구성 될 수있다. 뇌, 폐, 간, 신장, 소장에 제한 등 아니라 조직 유형의 다양한 상이한...

<html> 면역 관심 항원에 특이 적으로 결합하는 일차 항체를 사용하여 조직 절편에서 항원 (예 : 단백질)를 검출하기위한 공정이다. 그는 항체가 큰 특이성 1 항원을 지역화 할 수 있다고 판단 할 때 면역은 1934 년 JR Marrack에 의해 개척되었다. 1942 년부터, 면역 조직 화학 염색을 시각화하기 위해 형광 항체를 사용하여 연구를 체외에서 첫 번째의 일부는 생체 조직 화학적 연구에서 처음으로 4 발표 된 후 2,3, 출판되었다. 1960 년대, 삼십년 면역 조직 화학 방법의 개시 후, 효소 결합 된 항체는 보조 시약으로 사용되기 시작했다. 이 방법은 동시에 독립적으로 프랑스와 미국 5,6에서 개발되었다. 오늘, 항체의 다양한는 면역 조직 화학 연구 (7)에 대한 무한한 가능성을 제공합니다. &quot;&gt;이 대응의 전반적인 목표는 면역 조직 화학 염색에 대한 간략한 소개를 제공하는 것입니다, 그것은이 기술의 포괄적이고 철저한 검토하기위한 것이 아닙니다 설명 된 방법에있어서,이 항원에 대한 면역 조직 화학 기술은 미세 아교 세포에 대한 (마커를 제공하고 있습니다. 관류 파라 포름 알데히드의 염색 뉴런), 자당 cryoprotected, 저온 절단 된 쥐의 뇌. 면역 조직 화학 염색을 배경 염색을 줄이기 위해 결합 특이 항원을 차단 시작한다. 다음으로, 일차 항체와 배양이 조직의 특정 항원에 결합이 가능합니다. 차 항체에 따라, 다른 항체를 이차 항체로 명명 공액 시각화 신호 8 차 항체를 링크에 적용된다. 이차 항체 차 항체가 발생시킨 종에 특이적인 면역 글로불린 G (IgG의) 도메인을 대상. 이차 항체는 신호를 증폭 차 항체의 T의 팹 지역부터차 항체의 IgG의 도메인에 여러 사이트에 그가 차 항체 바인드. 어느 차 항체의 F C 영역에 결합 효소 또는 형광 분자 시각화를 가능하게한다. 예를 들어, 토끼 항 Iba1 일차 항체에 특이 Iba1 토끼의 IgG 분자이다. 당나귀 항 - 토끼 IgG를 이차 항체가로인가 될 때, 인식하고 토끼 항 Iba1의 IgG의 복수의 영역 (도 1 참조)에 결합된다. 당나귀 항체는 다양한 방법에 의해 시각화 될 수있다. 이 통신은 형광 현미경으로 시각화를위한, 차 항체를 인식하는 이차 항체에 결합 형광 검출에 초점을 맞추고있다. 형광 면역 조직 화학에서, 이러한 훽스트 또는 DAPI와 같은 핵 염색은 모든 핵을 시각화 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> 그림 1 :의 SCH직접 대 간접 항체 라벨링 기술 ematic 표현. 항체는 관심있는 항원에 결합하여 일차 항체 종에 대해 발생하는 이차 항체에 의해 증폭 될 수있다. 이 기술은 시각화 (A)에 대한 증폭 및 DAB 용 아비딘 - 바이오틴 복합체 (ABC)를 사용하여 수행 할 수있다 또는 형광 직접 접합 된 이차 항체 (B). 또한, 일차 항체가 직접 비오틴 또는 형광 (C) 등 다양한 태그와 결합 될 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> (DAB;도 1 및도 2 참조) 면역 조직 화학 염색의 시각화를위한 다른 방법은 3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘의 tetrahydrochloride를 이용한다. 이 비오틴 화를 사용하여 형광 또는 상이밝은 필드 현미경 아래에서 볼 수있는 침전물에 DAB를 변환하는 효소를 제공 말 무 퍼 옥시 다제 (HRP) 복합 이차 항체,. 단일 항원 관심 또는 염색이 오래 지속되는 것이 요구되는 경우에, DAB 형광 염색보다 더 적합 할 수있다. 그러나, DAB 염색은 두 개의 핵 항원이 관심있는 특히, 여러 마커 사이의 차별화에 적합하지 않습니다. DAB 재료 및 프로토콜 변경에 대한 자세한 내용은 표 1를 참조. 대안으로는, 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드 / 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 포스페이트 (NBT / BCIP)는 이차 공액 알칼리성 포스파타제 (AP)를 시각화하기 위해 사용될 수있다 항체. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> 그림 2 :. 니켈 강화 DAB 하나의 표지 쥐의 뇌 조직 섹션의 대표 이미지 쥐의 뇌는 SE는혼자 미세 아교 세포 또는 뉴런의 오래 지속되는 분석을 허용 Iba1 (A)와 팬의 연결 (B)을 위해 니켈이 강화 된 DAB로 표시되어 있습니다 ctions. 스케일 바 20 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 하나는 조직 내에서 관심있는 항원의 존재 량 추정 분석되는 것을 고려한다. 간접 방법은 위에서 설명한대로 낮은 풍부한 목표에 유용하다. 관심 항원 높은 풍부하게되면 직접 방법이 적용될 수있다. 직접 방법은 직접 시각화 신호에 결합되는 일차 항체를 포함하고, 따라서 어떤 차 항체가 필요하지 않습니다. 이 방법은 염색 공정을 단순화하지만, 간접적 인 방법에 의해 달성 증폭을 제거한다. 직접 복합 일차 항체를 사용하여 이차 항체의 교차 반응을 제거때 두 번 라벨. 이 통신은 Iba1과 팬의 연결 (표 1의 세부 사항)와 이중 라벨에 대한 프로토콜을 자세히 설명합니다. Iba1는 분지, 하이퍼 분지의 활성화, 아메바, 및로드 등 많은 활성화 상태에서 미세 아교 세포를 얼룩. 팬 신경 얼룩 신경 축삭 돌기, 그리고 소마. Iba1 대부분의 미세 아교 세포와 팬의 연결 대상에게 신경을 얼룩 때문에, 얼룩의 조합은 미세 아교 세포 - 신경 세포 상호 작용의 폭 넓은 이해를 얻는 데 유용합니다. 결론적으로, 면역 조직 화학 염색은 항체의 신중한 선택에 의존한다. 연구 문제는보다 구체적인 해짐에 따라, 다른 항원에 제기 항체는 바람직 할 수있다. 특정 소교 활성화 상태를 대상으로, 하나는 오히려 Iba1보다, CD45 또는 CD68 항체를 사용하도록 선택할 수 있습니다. 또한, 마우스를 작동에서 F4 / 80은 필요한 결과를 제공 할 수있다. 마찬가지로, 신경 요소는 특히 항체 류마티스 관절염의 대상이 될 수 있습니다핵에 대한에 다루지, 시냅스 (사전 또는 사후), 축삭, 성장 콘. 또한, 신경 세포 (더블 cortin, NeuN)의 나이를 구별 다른 마커 및 신경 재생 (GAP-43)이있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1171">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:523px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td>Used for tissue mounting (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Oven</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51028112</td>
			<td>Used for tissue drying (2.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mini Pap pen</td>
			<td style="width:132px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">00-8877</td>
			<td>Used in step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-149-429</td>
			<td>Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666-A</td>
			<td>Used for drying slides (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Black Staining Box</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">21050</td>
			<td>Used for blocking and staining steps (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-413-253</td>
			<td>Used for block and antibody incubation (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse &#945;-Pan-neuronal</td>
			<td style="width:132px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB2300</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rabbit &#945;-Iba1</td>
			<td style="width:132px;">Wako Chemical</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-Rabbit 594</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">711-585-152</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-mouse 488</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-545-150</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Caterer&#39;s foil</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used in steps 1.2.2 and 2.3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:132px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">0100-01</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Coverslips</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12544E</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Clear Nail Polish&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axioskop A2</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CitriSolv&#160;</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ABC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAB Peroxidase kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-2001</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Wheaton slide racks and staining dishes</td>
			<td style="width:132px;">TedPella</td>
			<td style="width:119px;">21043</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex perfusion pump and tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Thermometer (-50 to 50 C)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-059-228</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM3500S</td>
			<td>Used for tissue sectioning (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish, Plastic with 2 Lids</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>353</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 Place Staining Rack, Slides Horizontal</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>354</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons

면역 조직 화학은 동일계에서 항원의 존재, 위치 및 상대적인 풍부함을 검출하기위한 널리 이용되는 기술이다. 이 초급 프로토콜 및 미세 아교 예로서 신경 요소의 마커를 사용하여, 시약, 장비 및 설치류 뇌 조직의 면역 조직 화학 염색을 완료하기 위해 필요한 기술들을 설명한다. 특히,이 논문은 각각 Iba1과 팬의 연결에 대한 면역 조직 화학 염색을 통해 미세 아교 세포와 신경 세포의 형광 시각화를위한 단계별 프로토콜입니다. 형광 이중 라벨링 정확하게 세포 유형, 수용체, 리간드 사이의 상호 작용을 관찰 할 수있는 기회를 제공하고, 동일한 샘플 내의 다중 단백질의 위치 파악에 특히 유용하며, 및 / 또는 서로뿐만 아니라 단백질 공동과 관련된 세포 외 기질 하나의 셀 내에서 지역화. 다른 시각화 기술과는 달리, 형광 면역 조직 화학 염색의 강도가 감소 할 수있다적절한 예방 조치가되지 않는 한, 염색 다음 달에 주. 형광은 더 효율적이고, 두 개 이상의 사이보다 정확한 분화 가능으로 이러한 제한에도 불구하고, 많은 어플리케이션에서 형광 이중 표지, 예컨대 3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘의 tetrahydrochloride (DAB) 또는 알칼리성 포스파타제 (AP)와 같은 대안보다 선호 마커. 토론은 문제 해결 팁과 성공을 촉진하기 위해 조언을 포함한다.

이 염색 프로토콜 미세 아교 세포 형광 594 채널 (빨간색)에 표시 한 쥐의 뇌 조직 섹션에서 결과와 488 채널 레이블 뉴런 (녹색, 그림 4 참조). 핵 염색을 완료 한 경우, 채널 405 (블루)에 표시한다. 이미지는 서로 다른 채널에서의 촬영과 세 채널의 직접 비교를 위해 오버레이 또는 두 채널 사이에있을 수있다. 많은 디지털 수집 소프트웨어 스위트는이 기능을 포함한다. 여기에 표시된 Iba1...

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Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.6K 조회수.  University of Arizona College of Medicine - Phoenix. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example. 

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

연구

신경과학

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

의미 심장한 복잡한 두뇌 지형에 대한 Wholemount Immunohistochemistry

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

면역 조직 화학 및 전자 현미경을 사전은 임베딩에 대한 비 인간 영장류 뇌 조직의 준비

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As the first responders, microglia have important functions to mitigate neuron and glia dysfunction, and in this process, they undergo a broad range of morphologic changes. Microglia morphologies can be categorized descriptively or, alternatively, can be quantified as a continuous variable for parameters such as cell ramification, complexity, and shape. While methods for quantifying microglia are applied to single cells, few techniques apply to multiple microglia in an entire photomicrograph. The purpose of this method is to quantify multiple and single cells using readily available ImageJ protocols. This protocol is a summary of the steps and ImageJ plugins recommended to convert fluorescence and bright-field photomicrographs into representative binary and skeletonized images and to analyze them using software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) and FracLac for morphology data collection. The outputs of these plugins summarize cell morphology in terms of process endpoints, junctions, and length as well as complexity, cell shape, and size descriptors. The skeleton analysis protocol described herein is well suited for a regional analysis of multiple microglia within an entire photomicrograph or region of interest (ROI) whereas FracLac provides a complementary individual cell analysis. Combined, the protocol provides an objective, sensitive, and comprehensive assessment tool that can be used to stratify between diverse microglia morphologies present in the healthy and injured brain.

Microglia are brain immune cells that survey and react to altered brain physiology through morphologic changes which may be evaluated quantitatively. This protocol outlines an ImageJ based analysis protocol to represent microglia morphology as continuous data according to metrics such as cell ramification, complexity, and shape.

Microglia 형태학 Immunohistochemistry 조직 ImageJ를 사용 하 여 준비의 Photomicrographs에서 측정

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.