The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children&#8217;s Hospital Mission Support Funds.

참고 : 모든 절차가 아리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)을 준수하여 수행 하였다. 추천 재료 및 장비의 목록은 표 1에서 찾을 수있다. 1. 조직 준비 <ol><li> 관류 <ol><li> 소듐 펜 토바 비탈 (25 ㎎ / ㎏, IP)의 과다와 설치류를 안락사, 8 ml / 분의 유속으로 완전히하여 죽인 (3-5 분)까지의 인산 완충 식염수 (PBS)을 관류로 transcardially. 깊이있는 관류 지침, 게이지 등 2012 9를 참조하십시오. </li><li> 즉시 / 분 8 ㎖의 유속에서 15 ~ 20 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 관류하여 조직을 고정, PBS 플러시 다음. </li><li> 4 ℃에서 (트리스 완충 식염수를 제조 순서로, 15 %, 30 %, 30 %) 등급 자당 솔루션 다음 24 시간에 대해 4 % 파라 포름 알데히드의 두뇌와 장소를 제거합니다. 이후 자당 솔루션 O에 뇌 이동할수 있답니다 뇌 후 각 솔루션에 침몰했다. 참고 : 일반적으로, 각 솔루션에 오일이 조직이 싱크에 충분한 시간이다. </li></ol></li><li> 조직의 냉동 및 냉동 절편 <ol><li> 등의 OCT 화합물로서 매체에 매립 뇌를 놓고 -35 ℃에서 펜탄으로 잠수함. 뇌가 10 분의 최소 동결 한 후 -80 ℃에서 저장할 수 있습니다. 온도 실사 촬영되지 않은 경우 문제가 발생할 수 있습니다; 문제 해결 정보에 대한 설명을 참조하시기 바랍니다. </li><li> 20 ㎛의 두께 및 -20 ° C의 온도에서 직렬 관상 단면을 잘라. 양으로 대전 된 슬라이드에 조직을 수집합니다. 뇌 부분은 -80 ° C에서 지퍼 가기 가방과 저장 장기적으로 호일에 싸여 슬라이드 상자에 배치 될 수있다. 저장이 방법은 공기, 서리에 노출되는 것을 방지하기위한 이중 경계를 생성한다. </li></ol></li></ol> 2. 조직 처리 참고 : 예 장비 및 재료 연구염색에 대한 equired은 그림 3과 같다. 대안을 사용할 수 있습니다, 그러나, 이러한 이미지는 면역 조직 화학 염색에 새로운 그 전에 구입에 적절한 항목을 시각화하는 데 도움이됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> 도 3 : 실시 예 항목이 면역 조직 화학 염색을 위해 요구 (A)에 도시 한 블랙 박스 면역 이상적인 습도 챔버 인, 슬라이드 호에 박스 포장을 필요로하지 않고 광으로부터 보호되어있다.. 단면 처리 후, 슬라이드 등의 (B)에 도시 한 바와 같이 상자 노란 박스에 저장 될 수있다. 호일로 단단히 상자를 포장 전에 냉장고에 지퍼 가기 가방에 배치하는 것은 냉동 화상에서 조직 샘플을 보호하는 데 도움이됩니다. 슬라이드의 예는 E (다른 염색 (D)에 도시 된 요리와 (C)에서 주어진다 </strong&gt;). 커버 슬립 그러나 1.2 두께 된 커버는 대부분의 수직 및 공 초점 현미경에 좋은 이미징 결과를 제공, 크기와 두께 (F)에 따라 다를 수 있습니다. 이러한 (G)에 나타낸 것과 연필 슬라이드 라벨을 사용할 수있다. 잉크가 실행할 수있는 영구 마커 염색 표본이 무엇인지를 결정하는 기능 모두에 영향을 피해야한다. 즉, (H)에 도시 된 바와 같이 미니 PAP 펜 구충제 테두리 슬라이드에 그려 질 수 있습니다. <ol><li> 슬라이드 준비 <ol><li> 실온에서 냉동과 해동에서 슬라이드를 제거합니다. <ol><li> 옵션 : 섹션이 이전 슬라이드에서 부유 한 경우, 슬라이드를 떠에서 조직 섹션을 방지하기 위해 더 이상 4보다 시간 동안 60 ℃의 오븐에서 해동 슬라이드를 배치합니다. </li></ol></li><li> 슬라이드 랙 및 대응 접시에 놓고 슬라이드. </li><li> 세척은 세척 용액 간의 변화, 5 분마다 PBS 세 번 슬라이드. 앞으로이 단계에서 섹션에 ì을 피하기기능 장시간 액체없이. 주 : 섹션 건조하면 배경 염색이 증가하고 의미있는 데이터를 확실하게 얻을 수 없다. </li></ol></li><li> 조직 염색 <ol><li> 빛을 꽉 염색 상자에서, 탈 이온수로 적신 보풀이없는 조직과 &quot;습도 챔버를&quot;만들 수 있습니다. </li><li> 멀리 조직 섹션에서, 슬라이드의 맨 가장자리에 액체 구충제 테두리 만들기 위해 미니 아빠 펜을 사용, 보풀이없는 조직과 슬라이드의 가장자리를 건조. 이 경계선은 액체의 메 니스 커스 그 표면 장력이 염색에 영향을주지 않도록 조직의 가장자리 사이의 충분한 공간을 확보한다. 참고 : 관심의 항체가 전자 항원 검색을 필요로하지 않는 경우 PAP 펜 구충제 테두리 이전에 2.1.3에 적용 할 수 있습니다. PAP 펜 PBS로 세척하기 전에 적용된 경우 액성 테두리의 무결성은이 단계에서 체크한다. 경계에 틈을 채우기 위해 미니 자궁 펜을 사용합니다. </li><li슬라이드 가로 배치로&gt;, 블록 특이 항원은 PBS (블록 솔루션)에 4 % V / V의 혈청 배양에 의해 결합. 피펫 실온에서 1 시간을위한 슬라이드 당 블록 솔루션의 300 μL. 반드시 블록 용액 슬라이드의 가장자리 PAP 펜까지 연장 완전히 조직 근처 표면 장력에 의한 염색 얼룩을 방지하기 위해 조직을 포함합니다. <ol><li> 이차 항체가 만들어지는 동일한 종에서 혈청을 사용합니다. 주 :이 절차에서는, 이차 항체는 당나귀에서 만들어진, 따라서 당나귀 혈청이 사용된다. 두 개 이상의 다른 종으로부터의 이차 항체가 사용되는 경우, 각각의 종으로부터 혈청을 포함한다. </li></ol></li><li> 슬라이드 위에 피펫 차 항체. 참고 :이 염색에 대한 항체 농도가 1에 최적화 된 5,000 및 1 : 각각 Iba1 및 팬 신경 500. 이러한 농도는 배경 염색의 결핍으로 의미있는 염색을 보여주는 것으로 밝혀졌다. <ol><li> 에 블록 솔루션을 희석1 % PBS에서 혈청 및 일차 항체를 추가합니다. 슬라이드 당 1 % 혈청 차 항체 용액 300 ㎕를 피펫. 다시 말하지만, 유체가 PAP 펜의 가장자리에 있는지 확인하십시오. 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> Iba1도 팬의 연결도 항체를 포함하는 하나의, 팬 - 신경 세포의 항체가없는 Iba1 하나, 그리고 Iba1없이 팬의 연결 항체와 한 세 가지 제어 슬라이드를 포함합니다. 그러나 차 항체의 결합을 비 특정 테스트를 일차 항체를 생략 동일한 솔루션 같은 런 이러한 슬라이드 얼룩. </li></ol></li><li> 다음 날 아침, 세척은 세척과 솔루션을 변경, 5 분마다 PBS에 세 번 슬라이드. </li><li> 형광 항체는 앞으로이 단계에서, 검은 색 또는 어두운 곳에서 배양 중 하나입니다 세척 용기가 박 및 하이브리드 상자에 포장되어 보장함으로써 빛의 노출을 최소화 따라서, 빛에 민감하다. 모든 슬라이드에 적절한 보조 항체를 피펫과 부화1의 농도로 실온에서 60 분 : 블록 용액 250 라이트 타이트 &quot;습도 챔버&quot;에 (단계 2.2.3 참조) (단계 2.2.1 참조). <ol><li> 서로 다른 파장의 이차 항체를 사용합니다. 여기서, 일차 항체 토끼 항 Iba1은 해당 이차 항체로서 당나귀 항 - 토끼 (594)를 사용한다. 일차 항체가 마우스 항 - 팬 신경은 해당 이차 항체로서 당나귀 항 마우스 (488)를 사용한다. 또는, 항 - 토끼 488 및 항 - 마우스 (594)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 세척을 5 분마다 PBS 세 번 슬라이드. </li><li> 옵션 : 핵 염색을 수행합니다. <ol><li> 정확히 60 초 동안 두 번 증류수 H 2 0에서 0.03 μg / ml의 농도 훽스트 (또는 다른 핵 얼룩)에 놓습니다. </li><li> 세척을 5 분마다 PBS 세 번 슬라이드. </li></ol></li><li> DDH 2 0 씻으십시오. </li></ol></li><li> Coverslipping <ol><li> 같은 형석 등의 수성 장착 매체 커버 슬립 슬라이드,omount-G 또는 ProlongGold. 면봉을 사용하여 모든 거품을 제거하기 위해주의하십시오. 참고 : 다른 설치 에이전트를 사용할 수 그러나 높은 블리드을 통해 염료 사이는 coverslipping의 일 이내에 일부가 주목되고있다. </li><li> 가장자리를 밀봉 명확한 매니큐어를 사용하여 증발에 의한 건조되는 부분을 방지 할 수있다. 슬라이드는 평평하고 실온에서 유지하면서 매니큐어가 빛을 꽉 용기에 건조 할 수 있도록 허용 한 후 4 ℃에서 호일에 싸여 빛 기밀 용기에 저장합니다. </li></ol></li></ol> 3. 스테인드 조직 이미징 <ol><li> 현미경 사용 <ol><li> 매니큐어는 어두운 방에서 개최해야하는, 현미경을 시작하기 전에 한 시간 이상 건조시킵니다. </li><li> 형광 광원과 디지털 카메라의 첨부 파일이있는 공 초점 또는 연구 현미경을 사용하여 현미경을 획득. 수반 소프트웨어를 사용하여 각 파장에 대한 노출 설정 - 405, 488, 및 594 - 별도. 참고 : 깊이있는 영상 지침은 현미경 제조 업체에서 온라인으로 사용할 수 있어야한다. </li><li> 섹션을 이동하거나 초점을 조정하지 않고 각 채널에서 현미경을 획득. 컬러로 이미지를 가지고, 또는 교대로 그레이 스케일과 이후에 색상을 변환 할 수 있습니다. 참고 : 컬러 또는 각 채널에서 그레이 스케일 이미지 후 처리에 대조 할 수 있습니다. </li><li> 섹션의 사진 표백가 발생하므로, 그 조직 섹션은 오랜 기간 동안 주변 광 또는 미세한 빛에 노출되지 않도록. 이를 방지하기 위해, 증가 빛 / 레이저 강도보다는 노출 시간을 증가시킨다. </li><li> 전원이 켜진 후 30 분 이내에 형광 광원의 전원을 끄지 마십시오. 참고 : 빠르게 연속 켜거나 소스를 전환 형광 전구의 수명을 감소시킬 수있다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 통신의 전반적인 목표는 독자에게 면역 조직 화학 절차를 소개했다. 이를 위해, Iba1 및 팬 신경 항원에 두 번 라벨의 예는 미세 아교 세포 및 관류 파라 포름 알데히드의 신경 세포를 관찰하기 위해, 자당 cryoprotected, 저온 절단 된 쥐의 뇌를 사용 하였다. 이 기술은 무단 목적을 제공하도록 구성 될 수있다. 뇌, 폐, 간, 신장, 소장에 제한 등 아니라 조직 유형의 다양한 상이한...

<html> 면역 관심 항원에 특이 적으로 결합하는 일차 항체를 사용하여 조직 절편에서 항원 (예 : 단백질)를 검출하기위한 공정이다. 그는 항체가 큰 특이성 1 항원을 지역화 할 수 있다고 판단 할 때 면역은 1934 년 JR Marrack에 의해 개척되었다. 1942 년부터, 면역 조직 화학 염색을 시각화하기 위해 형광 항체를 사용하여 연구를 체외에서 첫 번째의 일부는 생체 조직 화학적 연구에서 처음으로 4 발표 된 후 2,3, 출판되었다. 1960 년대, 삼십년 면역 조직 화학 방법의 개시 후, 효소 결합 된 항체는 보조 시약으로 사용되기 시작했다. 이 방법은 동시에 독립적으로 프랑스와 미국 5,6에서 개발되었다. 오늘, 항체의 다양한는 면역 조직 화학 연구 (7)에 대한 무한한 가능성을 제공합니다. &quot;&gt;이 대응의 전반적인 목표는 면역 조직 화학 염색에 대한 간략한 소개를 제공하는 것입니다, 그것은이 기술의 포괄적이고 철저한 검토하기위한 것이 아닙니다 설명 된 방법에있어서,이 항원에 대한 면역 조직 화학 기술은 미세 아교 세포에 대한 (마커를 제공하고 있습니다. 관류 파라 포름 알데히드의 염색 뉴런), 자당 cryoprotected, 저온 절단 된 쥐의 뇌. 면역 조직 화학 염색을 배경 염색을 줄이기 위해 결합 특이 항원을 차단 시작한다. 다음으로, 일차 항체와 배양이 조직의 특정 항원에 결합이 가능합니다. 차 항체에 따라, 다른 항체를 이차 항체로 명명 공액 시각화 신호 8 차 항체를 링크에 적용된다. 이차 항체 차 항체가 발생시킨 종에 특이적인 면역 글로불린 G (IgG의) 도메인을 대상. 이차 항체는 신호를 증폭 차 항체의 T의 팹 지역부터차 항체의 IgG의 도메인에 여러 사이트에 그가 차 항체 바인드. 어느 차 항체의 F C 영역에 결합 효소 또는 형광 분자 시각화를 가능하게한다. 예를 들어, 토끼 항 Iba1 일차 항체에 특이 Iba1 토끼의 IgG 분자이다. 당나귀 항 - 토끼 IgG를 이차 항체가로인가 될 때, 인식하고 토끼 항 Iba1의 IgG의 복수의 영역 (도 1 참조)에 결합된다. 당나귀 항체는 다양한 방법에 의해 시각화 될 수있다. 이 통신은 형광 현미경으로 시각화를위한, 차 항체를 인식하는 이차 항체에 결합 형광 검출에 초점을 맞추고있다. 형광 면역 조직 화학에서, 이러한 훽스트 또는 DAPI와 같은 핵 염색은 모든 핵을 시각화 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> 그림 1 :의 SCH직접 대 간접 항체 라벨링 기술 ematic 표현. 항체는 관심있는 항원에 결합하여 일차 항체 종에 대해 발생하는 이차 항체에 의해 증폭 될 수있다. 이 기술은 시각화 (A)에 대한 증폭 및 DAB 용 아비딘 - 바이오틴 복합체 (ABC)를 사용하여 수행 할 수있다 또는 형광 직접 접합 된 이차 항체 (B). 또한, 일차 항체가 직접 비오틴 또는 형광 (C) 등 다양한 태그와 결합 될 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> (DAB;도 1 및도 2 참조) 면역 조직 화학 염색의 시각화를위한 다른 방법은 3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘의 tetrahydrochloride를 이용한다. 이 비오틴 화를 사용하여 형광 또는 상이밝은 필드 현미경 아래에서 볼 수있는 침전물에 DAB를 변환하는 효소를 제공 말 무 퍼 옥시 다제 (HRP) 복합 이차 항체,. 단일 항원 관심 또는 염색이 오래 지속되는 것이 요구되는 경우에, DAB 형광 염색보다 더 적합 할 수있다. 그러나, DAB 염색은 두 개의 핵 항원이 관심있는 특히, 여러 마커 사이의 차별화에 적합하지 않습니다. DAB 재료 및 프로토콜 변경에 대한 자세한 내용은 표 1를 참조. 대안으로는, 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드 / 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 포스페이트 (NBT / BCIP)는 이차 공액 알칼리성 포스파타제 (AP)를 시각화하기 위해 사용될 수있다 항체. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> 그림 2 :. 니켈 강화 DAB 하나의 표지 쥐의 뇌 조직 섹션의 대표 이미지 쥐의 뇌는 SE는혼자 미세 아교 세포 또는 뉴런의 오래 지속되는 분석을 허용 Iba1 (A)와 팬의 연결 (B)을 위해 니켈이 강화 된 DAB로 표시되어 있습니다 ctions. 스케일 바 20 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 하나는 조직 내에서 관심있는 항원의 존재 량 추정 분석되는 것을 고려한다. 간접 방법은 위에서 설명한대로 낮은 풍부한 목표에 유용하다. 관심 항원 높은 풍부하게되면 직접 방법이 적용될 수있다. 직접 방법은 직접 시각화 신호에 결합되는 일차 항체를 포함하고, 따라서 어떤 차 항체가 필요하지 않습니다. 이 방법은 염색 공정을 단순화하지만, 간접적 인 방법에 의해 달성 증폭을 제거한다. 직접 복합 일차 항체를 사용하여 이차 항체의 교차 반응을 제거때 두 번 라벨. 이 통신은 Iba1과 팬의 연결 (표 1의 세부 사항)와 이중 라벨에 대한 프로토콜을 자세히 설명합니다. Iba1는 분지, 하이퍼 분지의 활성화, 아메바, 및로드 등 많은 활성화 상태에서 미세 아교 세포를 얼룩. 팬 신경 얼룩 신경 축삭 돌기, 그리고 소마. Iba1 대부분의 미세 아교 세포와 팬의 연결 대상에게 신경을 얼룩 때문에, 얼룩의 조합은 미세 아교 세포 - 신경 세포 상호 작용의 폭 넓은 이해를 얻는 데 유용합니다. 결론적으로, 면역 조직 화학 염색은 항체의 신중한 선택에 의존한다. 연구 문제는보다 구체적인 해짐에 따라, 다른 항원에 제기 항체는 바람직 할 수있다. 특정 소교 활성화 상태를 대상으로, 하나는 오히려 Iba1보다, CD45 또는 CD68 항체를 사용하도록 선택할 수 있습니다. 또한, 마우스를 작동에서 F4 / 80은 필요한 결과를 제공 할 수있다. 마찬가지로, 신경 요소는 특히 항체 류마티스 관절염의 대상이 될 수 있습니다핵에 대한에 다루지, 시냅스 (사전 또는 사후), 축삭, 성장 콘. 또한, 신경 세포 (더블 cortin, NeuN)의 나이를 구별 다른 마커 및 신경 재생 (GAP-43)이있다.

<table><tbody><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td>Used for tissue mounting (1.2.2)</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028112</td><td>Used for tissue drying (2.1.1)</td></tr><tr><td>Mini Pap pen</td><td>Life Technologies</td><td>00-8877</td><td>Used in step 2.2.2</td></tr><tr><td>Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-149-429</td><td>Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td>Used for drying slides (2.2)</td></tr><tr><td>Black Staining Box</td><td>Ted Pella</td><td>21050</td><td>Used for blocking and staining steps (2.2)</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-413-253</td><td>Used for block and antibody incubation (2.2)</td></tr><tr><td>Mouse &amp;alpha;-Pan-neuronal</td><td>Millipore</td><td>MAB2300</td><td>Used for primary antibody (2.2.4)</td></tr><tr><td>Rabbit &amp;alpha;-Iba1</td><td>Wako Chemical</td><td>019-19741</td><td>Used for primary antibody (2.2.4)</td></tr><tr><td>Donkey &amp;alpha;-rabbit 594</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td></tr><tr><td>Donkey &amp;alpha;-mouse 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-150</td><td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td></tr><tr><td>Caterer&#039;s foil</td><td>Any</td><td>N/A</td><td>Used in steps 1.2.2 and 2.3.2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Used for coverslipping (2.2.8)</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Used for coverslipping (2.2.8)</td></tr><tr><td>Clear Nail Polish&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td>N/A</td><td>Used for coverslipping (2.2.8)</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Used for imaging (3)</td></tr><tr><td>Axioskop A2</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Used for imaging (3)</td></tr><tr><td>CitriSolv&amp;nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td></td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>DAB Peroxidase kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>Biotinylated horse &amp;alpha;-rabbit IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1100</td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>Biotinylated horse &amp;alpha;-mouse IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2001</td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>30% Hydrogen Peroxide</td><td>FisherScientific</td><td>H325-500</td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>Wheaton slide racks and staining dishes</td><td>TedPella</td><td>21043</td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>Masterflex perfusion pump and tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)</td></tr><tr><td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td></tr><tr><td>Thermometer (-50 to 50 C)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-059-228</td><td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3500S</td><td>Used for tissue sectioning (1.2.2)</td></tr><tr><td>Staining Dish, Plastic with 2 Lids</td><td>Grale Scientific</td><td>353</td><td>For antigen retrival</td></tr><tr><td>20 Place Staining Rack, Slides Horizontal</td><td>Grale Scientific</td><td>354</td><td>For antigen retrival</td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Any</td><td>N/A</td><td>For antigen retrival</td></tr></tbody></table>

primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons

면역 조직 화학은 동일계에서 항원의 존재, 위치 및 상대적인 풍부함을 검출하기위한 널리 이용되는 기술이다. 이 초급 프로토콜 및 미세 아교 예로서 신경 요소의 마커를 사용하여, 시약, 장비 및 설치류 뇌 조직의 면역 조직 화학 염색을 완료하기 위해 필요한 기술들을 설명한다. 특히,이 논문은 각각 Iba1과 팬의 연결에 대한 면역 조직 화학 염색을 통해 미세 아교 세포와 신경 세포의 형광 시각화를위한 단계별 프로토콜입니다. 형광 이중 라벨링 정확하게 세포 유형, 수용체, 리간드 사이의 상호 작용을 관찰 할 수있는 기회를 제공하고, 동일한 샘플 내의 다중 단백질의 위치 파악에 특히 유용하며, 및 / 또는 서로뿐만 아니라 단백질 공동과 관련된 세포 외 기질 하나의 셀 내에서 지역화. 다른 시각화 기술과는 달리, 형광 면역 조직 화학 염색의 강도가 감소 할 수있다적절한 예방 조치가되지 않는 한, 염색 다음 달에 주. 형광은 더 효율적이고, 두 개 이상의 사이보다 정확한 분화 가능으로 이러한 제한에도 불구하고, 많은 어플리케이션에서 형광 이중 표지, 예컨대 3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘의 tetrahydrochloride (DAB) 또는 알칼리성 포스파타제 (AP)와 같은 대안보다 선호 마커. 토론은 문제 해결 팁과 성공을 촉진하기 위해 조언을 포함한다.

이 염색 프로토콜 미세 아교 세포 형광 594 채널 (빨간색)에 표시 한 쥐의 뇌 조직 섹션에서 결과와 488 채널 레이블 뉴런 (녹색, 그림 4 참조). 핵 염색을 완료 한 경우, 채널 405 (블루)에 표시한다. 이미지는 서로 다른 채널에서의 촬영과 세 채널의 직접 비교를 위해 오버레이 또는 두 채널 사이에있을 수있다. 많은 디지털 수집 소프트웨어 스위트는이 기능을 포함한다. 여기에 표시된 Iba1...

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Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.9K 조회수.  University of Arizona College of Medicine - Phoenix. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example. 

비디오: Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

연구

신경과학

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing patterns. The inclusion of biocytin/neurobiotin in the recording electrode permits post-hoc recovery of morphological details, which are necessary to determine the dendritic arborization and the regions targeted by the axons of the recorded neurons. However, given the presence of morphologically similar neurons with distinct neurochemical identities and functions, immunohistochemical staining for cell-type-specific proteins is essential to definitively identify neurons. To maintain network connectivity, brain sections for physiological recordings are prepared at a thickness of 300 &#181;m or greater. However, this thickness often hinders immunohistological postprocessing due to issues with antibody penetration, necessitating the resectioning of the tissue. Resectioning of slices is a challenging art, often resulting in the loss of tissue and morphology of the cells from which electrophysiological data was obtained, rendering the data unusable. Since recovery of morphology would limit data loss and guide in the selection of neuronal markers, we have adopted a strategy of recovering cell morphology first, followed by secondary immunostaining. We introduce a practical approach to biocytin filling during physiological recordings and subsequent serial immunostaining for the recovery of morphology, followed by the restaining of sections to determine the neurochemical identity. We report that sections that were filled with biocytin, fixed with paraformaldehyde (PFA), stained, and coverslipped can be removed and restained with a second primary antibody days later. This restaining involves the removal of the coverslip, the washing of sections in a buffer solution, and the incubation of primary and secondary antibodies to reveal the neurochemical identity. The method is advantageous for eliminating data loss due to an inability to recover morphology and for narrowing down the neurochemical markers to be tested based on morphology.

This protocol presents a method for the morphological recovery of neurons patched during electrophysiological recordings using biocytin filling and subsequent immunohistochemical postprocessing. We show that thick biocytin-filled sections that were stained and coverslipped can be restained with a second primary antibody days&#160;or months later.

신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia selectively), when combined with IBA1 (which provides an exceptional visualization of their morphology), allows investigation of changes in density, distribution, and morphology. Quantifying these parameters is important in providing insights into the roles exerted by microglia, the resident macrophages of the brain. Under normal physiological conditions, microglia are regularly distributed in a mosaic-like pattern and present a small soma with ramified processes. Nevertheless, as a response to environmental factors (i.e., trauma, infection, disease, or injury), microglial density, distribution, and morphology are altered in various manners, depending on the insult. Additionally, the described double-staining method allows visualization of infiltrating macrophages in the brain based on their expression of IBA1 and without colocalization with TMEM119. This approach thus allows discrimination between microglia and infiltrating macrophages, which is required to provide functional insights into their distinct involvement in brain homeostasis across various contexts of health and disease. This protocol integrates the latest findings in neuroimmunology that pertain to the identification of selective markers. It also serves as a useful tool for both experienced neuroimmunologists and researchers seeking to integrate neuroimmunology into projects.

This protocol describes a step-by-step workflow for immunofluorescent costaining of IBA1 and TMEM119, in addition to analysis of microglial density, distribution, and morphology, as well as peripheral myeloid cell infiltration in mouse brain tissue.

마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

면역학 및 감염병학

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Investigating Drivers of Antireward in Addiction Behavior with Anatomically Specific Single-Cell Gene Expression Methods

Increasing rates of addiction behavior have motivated mental health researchers and clinicians alike to understand antireward and recovery. This shift away from reward and commencement necessitates novel perspectives, paradigms, and hypotheses along with an expansion of the methods applied to investigate addiction. Here, we provide an example: A systems biology approach to investigate antireward that combines laser capture microdissection (LCM) and high-throughput microfluidic reverse transcription quantitative polymerase chain reactions (RT-qPCR). Gene expression network dynamics were measured and a key driver of neurovisceral dysregulation in alcohol and opioid withdrawal, neuroinflammation, was identified. This combination of technologies provides anatomic and phenotypic specificity at single-cell resolution with high-throughput sensitivity and specific gene expression measures yielding both hypothesis-generating datasets and mechanistic possibilities that generate opportunities for novel insights and treatments.

The combination of laser capture microdissection and microfluidic RT-qPCR provides anatomic and biotechnical specificity in measuring the transcriptome in single neurons and glia. Applying creative methods with a system's biology approach to psychiatric disease may lead to breakthroughs in understanding and treatment such as the neuroinflammation antireward hypothesis in addiction.

해부학적으로 특이적인 단일 세포 유전자 발현 방법을 사용한 중독 행동의 반보상 동인 조사

Increasing rates of addiction behavior have motivated mental health researchers and clinicians alike to understand antireward and recovery. This shift ...

<meta charset="utf8"></head><body>쥐 MCAO 뇌졸중 모델의 세포 사멸을 연구하기 위한 면역형광 염색

Evaluating Cell Death Signaling by Immunofluorescence in a Rat Model of Ischemic Stroke

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery (MCA). Current pharmacological approaches for the treatment of ischemic stroke are limited; therefore, novel therapies providing effective neuroprotection against ischemic injury following stroke are urgently needed. In the brain tissue following ischemic stroke, the area of the ischemic penumbra is salvageable but at risk of progressing to irreversible damage. The penumbral area surrounding the infarcted core is a conceptual target for neuroprotection. Since the blood flow is partially maintained in the penumbral area, neuronal and non-neuronal cells in this area transiently survive after stroke, and these cells that are still viable may be rescued by appropriate medical interventions. Understanding the pathophysiology of the penumbra is important in the development of neuroprotective therapies because the cell death pathways activated in the ischemic penumbra may indicate therapeutic targets, such as RUNX1 and cathepsins. These protein targets functioning as mediators of programmed cell death can be further exploited in translational research. With moderate size and similarity to the human brain, the in vivo rat model of MCA occlusion (MCAO) mimics the human ischemic stroke and offers an applicable tool to investigate the penumbral pathology, examine the cell death signaling, and evaluate the effects of potential targets in the context of MCAO. Here, we describe how to induce MCAO in rats and how to perform immunofluorescence staining for the detection of cell death signaling in the rat brain following MCAO.

<meta charset="utf8"></head><body>허혈성 뇌졸중의 쥐 모델에서 면역형광에 의한 세포 사멸 신호 평가

Rat in vivo models are indispensable tools to investigate the pathological mechanisms and therapeutic targets for ischemic stroke. This work will describe performing immunofluorescence staining in infarcted brain slices following middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats.

허혈성 뇌졸중의 쥐 모델에서 면역형광에 의한 세포 사멸 신호 평가

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery ...

Immunohistochemical Staining of Rat Coronal Tissue Cryosections for Microglia and Neurons

<a href='https://app.jove.com/v/52293/primer-for-immunohistochemistry-on-cryosectioned-rat-brain-tissue'>Source: Evilsizor, M. N., et. al., Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J. Vis. Exp. (2015)</a>This video demonstrates a step-by-step immunohistochemistry staining procedure on cryosectioned rat brain tissue to visualize the spatial arrangement of microglia and neurons.

Source: Evilsizor, M. N., et. al., Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J. Vis. ...

미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

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Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색

마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색

근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정

해부학적으로 특이적인 단일 세포 유전자 발현 방법을 사용한 중독 행동의 반보상 동인 조사

허혈성 뇌졸중의 쥐 모델에서 면역형광에 의한 세포 사멸 신호 평가

허혈성 뇌졸중의 쥐 모델에서 면역형광에 의한 세포 사멸 신호 평가

허혈성 뇌졸중의 쥐 모델에서 면역형광에 의한 세포 사멸 신호 평가

Immunohistochemical Staining of Rat Coronal Tissue Cryosections for Microglia and Neurons