We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).

1. 세포 배양 <ol><li> 플라스미드의 선택 및 유지를위한 융합 및 (b) 추가의 대사 마커 -degron (a) URA3을 함유하는 플라스미드, 예컨대 Try467 (표 2)와 같은 적절한 영양 요 구성 효모 세포를 변형. . NOTE - 효모 전사로부터 유도 degron 적절한 플라스미드의 예는 YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 (LYS2) (Deg1- UV)이이 Deg1 구성된 융합 단백질을 함유하는 효모 통합 플라스미드이다 요인 Mat2 17 FLAG 에피토프 - 안정적인 ER 단백질 및 URA3 15,18 (그림 3A) - 면역, Vma12에 의해 감지. (본 연구에 적합한 플라스미드의 추가 예제에 사용되는 플라스미드는 표 3을 참조하십시오.) </li><li> 플라스미드의 선택과 유지 관리를 위해 정의 적절한 합성에서 한천 플레이트에 세포를 유지는 (SD) 매체는 아미노산 선택 마커 부족 <s&gt; 19까지 (예를 들어, Deg1-UV를 선택하고 SD-LYS 선택적 미디어에서 관리됩니다). </li><li> 정상기에 도달 할 때까지, 플라스미드 유지를위한 적절한 선택적 SD 배지에서 30 ° C에서 세포 O / N 성장. 샘플 수 (섹션 2) 피검에 따라 테스트 튜브 또는 96- 웰 플레이트에서 세포를 성장. </li></ol> 분석 2. 셀 준비 <ol><li> 샘플의 소수 (N≤15)를 분석 할 때, 세포를 희석하여 다음과 같이 매체를 교체 : <ol><li> 96 웰 플레이트 (일반 아래)에서 잘 당 SD 매체의 150 μL와 O / N 문화에서 세포의 50 μl를 희석. 빈은 매체를 포함로 첫 번째 샘플이 지정되어 있습니다. </li><li> 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 96- 웰 플레이트에 샘플의 OD 600의 값을 결정한다. </li><li> ㅁ에서 잘 희석 계수 (X4)에 의한 600 OD 판독을 곱하여 각 실제 OD 600 계산빈 독서의 가치를 무형 문화 유산하는 뺀​​다. 맥주 - 램버트 법칙에 따라 1cm의 계산 된 경로 길이를 얻기 위해 0.55으로 나눈 결과 값을 정규화. 표준 96 웰 플레이트에서 세포에 OD 600 200 μl를 측정 할 때,이 값이 일정한 참고. </li><li> 0.25 600 OD하고 에펜 도르프 튜브로 전송 상당액에서 효모 세포를 얻기 위해 필요한 정확한 부피를 계산. </li><li> 1 분 동안 고속 (12,000 XG)에서 세포를 스핀 다운. </li><li> 상등액을 제거하고 적절한 선택 배지 1 ㎖로 세포를 재현 탁 OD에게 0.25 600을 얻었다 (3.1 절 참조). </li><li> 96 웰 플레이트에 새 우물에 희석 된 균주의 200 μl를 전송합니다. </li></ol></li><li> 샘플들의 다수 (N&gt; 15)이 테스트 될 때, 다음과 같이, 세포를 희석 전에 OD 600 측정없이 매체를 교체 : <ol><li> 고정 된 세포의 10 μl를 전송적절한 선택 배지 190 μL (희석 1:20)를 포함하는 새로운 96 웰 플레이트에 96 웰 플레이트에서 자란 O / N (3.1 절 참조). </li></ol></li></ol> 선택적 조건에서 액체 배양 3. 성장 속도론 (GILS) <ol><li> URA3-degron 기자를 사용하여 성장 측정을 위해 다음과 같은 용지를 사용하십시오 : <ol><li> 비 제한 조건에서 효모의 성장, 사용 플라스미드 선택적 SD 미디어의 긍정적 인 컨트롤 (1.2 절 참조). 어떠한 플라스미드의 선택이 필요하지 않은 경우, 예를 들면 Deg1-UV, 필요한 모든 아미노산 (완전한 SD)를 함유하는 SD 배지로 통합 된 플라스미드를 사용하는 경우 사용할 수있다. </li><li> 제한적인 조건에서 성장을 측정하는 실험 샘플은, SD-URA 매체를 사용합니다. </li></ol></li><li> 멀티 마이크로 플레이트 리더로 설정 :. 15 분의 30 ° C, 600 OD 측정 간격의 배양 온도, 1 분 매 7 분의 궤도 및 선형 진탕 사이클 &lt;BR /&gt; 참고 :이 듀얼 모드는 세포의 균일 한 분포를 얻기 위해 최적화 된 진탕; 그러나, 다른 진동 모드 또는 어떠한 흔들림도 작동 할 수 있습니다. </li><li> 30 ° C에서 세포를 인큐베이션 마이크로 플레이트 리더 O / N 또는 세포 정지상 (12-24 시간)에 도달 할 때까지. </li><li> 스프레드 시트 파일에 원시 데이터를 내 보냅니다. </li><li> (; 자세한 내용은 4 절을 참조하십시오 최소 두배 시간 (MDT)) 세포가 인구의 크기를 두 배로 할 MDTcalc, (시간에) 최소한의 시간을 계산하는 사용자 정의 소프트웨어 프로그램을 사용하여 효모의 성장 속도론을 결정합니다. </li></ol> 최소 두배 시간 4. 계산 (MDT) : MDTcalc 알고리즘의 원리 NOTE : MDTcalc 알고리즘의 원리, SD 완전 배지에서 자란 Try467 효모 세포 (표 2)의 대표 샘플을 사용하여이 데이터를 스프레드 시트 및 성장 플롯을 보여주는 표 1 및도 1에 도시되어, 스펙상대적으로. <ol><li> 웰 샘플에서 얻어진 측정 값 각각으로부터, 각 웰에서 얻어진 OD 600 블랭크 값을 차감한다. 0.55에 의해 얻어진 차이 나눈다 (96 웰 플레이트의 경우)의 광로 길이를 보정한다. 최종 값을 (표 1, 트란스.) 시간에 대하여 플롯 실제 효모 성장 곡선 (OD 600 / 시간) (도 1a)을 생성한다. </li><li> 선형 곡선 (도 1B)으로 대수 증식기를 변환하는 변환 된 값 각각에 대한 2 로그 (OD 600)를 계산한다. </li><li> (도 1C 표 1, 경사) 10 시간 포인트 간격 (N = 10)는 시간 0에서 시작하여 N &lt;10까지 한 번에 하나의 시간 - 점을 이동의 기울기를 계산한다. </li><li> 배로 세포 집단에 필요한 시간 수득 각 슬로프의 역수를 계산 (표 1, 1 / 기울기도 1C). 최소한의 계산1 / 기울기 값은 MDT (; 그림 1C 표 1, 검은 사각형)을 결정합니다. 선택한 시간 간격에서 샘플에서 세포 (표 1, 1 / 기울기, 검은 사각형)에 대한 계산 된 MDT를 추출 (빨간색 사각형으로 설명 표 1, 1B, 1D도). NOTE : SD-URA 매체상의 세포 성장 속도는 MDT에 반비례한다. </li></ol> 5. MDTcalc 사용 <ol><li> 컴퓨터의 지정된 폴더로 보충 프로그램 파일을 복사합니다. </li><li> 성장 데이터가 포함 된 스프레드 시트 파일이 저장되고 폐쇄되어 있는지 확인합니다. 화면이 나타납니다 시작을 볼 수있는 MDTcalc 응용 프로그램을 엽니 다. <ol><li> 그림 2에서 입증 된 바와 같이, 필요한 정보를 삽입합니다 : <ol><li> &#39;파일 경로&#39;에서 스프레드 시트 파일을 찾으려면 오른쪽에있는 사각형을 클릭합니다. </li><li> 여기서 t &#39;시트 이름&#39;에서 스프레드 시트 이름을 쓰기그는 원시 데이터가 있습니다. </li><li> &#39;시작 위치&#39;에서 스프레드 시트가 첫 번째 샘플의 시간 0의 좌표를 삽입합니다. </li><li> &#39;시간 열&#39;에서 시점 컬럼의 위치 (시간은 초 단위로 제공되어야한다) 형성 문자를 삽입한다. </li><li> &#39;빈 열&#39;에서 빈 컬럼의 위치를​​ 정의하는 문자 삽입 (보통을하지만, 96 웰 플레이트의 반드시 잘 A1). </li><li> &#39;OD 값&#39;에서 MDT 계산의 시작 (일반적으로 0.15-0.25)에 필요한 최소한의 변형 OD 600 값을 선택합니다. MDT는 정의 된 OD 600 값 이상에 도달 샘플에 대해 계산 될 수 있도록이 값을 설정하면 과도한 희석 지연 단계에서 문화에 대한 MDT의 계산을 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 마지막 값이 입력되면, 화면 하단의 &#39;계산&#39;버튼을 누른다. 오른쪽에 진행 표시 줄이 점차 g로 변경되었는지 확인리엔. 계산 과정에서 스프레드 시트 파일을 열지 마십시오. </li><li> 스프레드 시트로 MDT 계산의 완료시 자동으로 화면에 나타나는 두 세트의 데이터 내보내기. (a) 최소 OD 값 (섹션 5.2.1.6에 설정된 바와 같이) 테스트 및 (b) MDT가 산출되는 구간의 초기 시점을 통과하는 각각의 웰에 대한 MDT 값 (시작 : 데이터가 포함되어 있는지 확인 시간). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li><li>Willems, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+ubiquitin+protein+ligases+and+phosphorylation-dependent+proteolysis.">SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).</li><li>Tyers, M., Jorgensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolysis+and+the+cell+cycle:+with+this+RING+I+do+thee+destroy.">Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).</li><li>Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+signal+masking+by+heterodimerization+of+MAT&#945;2+and+MAT+a1+blocks+their+mutual+destruction+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">Degradation signal masking by heterodimerization of MAT&#945;2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Cell. 94, 217-227 (1998).</li><li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum/nuclear+envelope.">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li><li>Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+recognition+in+nuclear+protein+quality+control+degradation+is+governed+by+exposed+hydrophobicity+that+correlates+with+aggregation+and+insolubility.">Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility.</a> J Biol Chem. 10, (2013).</li><li>Rosenbaum, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorder+Targets+Misorder+in+Nuclear+Quality+Control+A+Disordered+Ubiquitin+Ligase+Directly+Recognizes+Its+Misfolded+Substrates.">Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates.</a> Molecular cell. 41, 93-106 (2011).</li><li>Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heat-stable+polypeptide+component+of+an+ATP-dependent+proteolytic+system+from+reticulocytes.">A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes.</a> Biochemica., &amp; Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).</li><li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li><li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 185-202 (2006).</li><li>Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analyses+of+sumoylated+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Induction+of+protein+sumoylation+by+cellular+stresses.">Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses.</a> J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).</li><li>Alani, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+type+of+fusion+analysis+applicable+to+many+organisms:+protein+fusions+to+the+URA3+gene+of+yeast.">A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast.</a> Genetics. 117, 5-12 (1987).</li><li>Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+ubiquitin+ligase+of+the+nuclear+envelope/endoplasmic+reticulum+that+functions+in+both+ER-associated+and+Matalpha2+repressor+degradation.">A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation.</a> Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).</li><li>Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+and+soluble+substrates+of+the+Doa10+ubiquitin+ligase+are+degraded+by+distinct+pathways.">Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways.</a> EMBO J. 25, 533-543 (2006).</li><li>Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+signals+for+ubiquitin+system+proteolysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Embo J. 17, 2759-2766 (1998).</li><li>Hochstrasser, M., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+degradation+of+a+transcriptional+regulator:+the+yeast+2+repressor.">In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor.</a> Cell. 61, 697-708 (1990).</li><li>Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+a+cytosolic+protein+requires+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+machinery.">Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery.</a> J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).</li><li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).</li><li>Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ubiquitin-ligase+complexes+define+convergent+pathways+for+the+degradation+of+ER+proteins.">Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins.</a> Cell. 126, 361-373 (2006).</li><li>Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+luminal+surveillance+complex+that+selects+misfolded+glycoproteins+for+ER-associated+degradation.">A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation.</a> Cell. 126, 349-359 (2006).</li><li>Wu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family.">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li><li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics.">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li><li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation.">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li><li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein.">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에서 우리는 (GILS) &#39;선택적 조건에서 액체 배양에서 성장 속도론&#39;라고 상대 단백질 분해 속도를 결정하는 세포의 성장을 기반으로 분석을 설명합니다. 그것은 설정하는 간단한 데이터 수집 및 분석은 간단하고 매우 모듈 형 : GILS 분석은 몇 가지 장점이 있습니다. 따라서, 높은 처리량 GILS 애플리케이션을위한 자동화하도록 적응 될 수있는 사용자 친화적 인 멀티 웰 플레이트 형식으로 여...

유비퀴틴 - 프로 테아 분해 시스템은 모든 진핵 세포에서 단백질의 항상성 유지에 관여한다 주요 조절 시스템이다. UPS는 처음에 폴리 - 유비퀴틴 태그 단백질 26S 프로 테아 좀에 의해 분해 된 후, 표적 단백질에 여러 유비퀴틴 분자 공액. 대부분의 경우, 유비퀴틴 매개 된 분해에 대한 속도 제한 단계가 E2 효소 컨쥬 게이트 및 E3 효소 결찰에 의해 매개되는 기판 ubiquitylation (E3 리가 제) 1이다. 결과적으로, 특정 단백질의 세포 내 안정성은 유비퀴틴 접합 감수성과 동족 ubiquitylation 효소의 활성을 반영한다. E3 리가 제는 UPS의 주요 기판 인식 구성 요소입니다. 따라서,이 효소가 없거나 자신의 안정적인 대응이 노출되지 중 하나 그들의 기판 내 degrons을 인식하고 있습니다. 세포주기 m의 예를 들면, 많은 레귤레이터UST 합성 순서 세포주기 진행을 유지하기 위해 시간적으로 특이 적으로 분해 될 수있다. 이러한 단백질의 분해는 종종 세포 시그널링 조절 키나아제에 의해 매개되는 3,4-, 인산화에 의해 제어된다. 반면에, 비정상적으로 접힌 단백질 애매한 degrons 통해 인식된다. 이들은 일반적으로 기본 구조에 숨겨진 구조의 교란에 노출되는 지역이다. 이러한 degrons 소수성 도메인 5-7과 본질적으로 무질서 세그먼트 (8)을 포함한다. 망상 적혈구 용 해물 (9)에서 단백질 분해 및 펀더멘털 특성화 유비퀴틴 시스템의 정액 발견 이래, 효모는 유전학 유비퀴틴 시스템 (10)의 많은 구성 요소를 발견하는 수단이되었다. UPS에 의한 단백질 분해에 대한 체계적인 분석 모델 생물로서 효모의 성공은 UPS가 높다는 사실에 주로 기인LY는 실험 시스템으로 그들의 복종 할 의무와 결합, 모든 진핵 생물 4 보존. 실제로, 효모 기반 시스템은 일반적으로 ubiquitylation 기계의 작용 메커니즘을 해독하기 위해 사용된다. 생화학 적 수단에 의한 단백질 분해를 공부하는 것은 일반적으로 세포 추출물의 준비가 필요합니다. 동물 세포 단백질 단백질 상호 작용 및 기능을 보존 비교적 온화한 조건에서 추출 될 수있는 반면, 효모 11 튼튼한 세포벽의 존재는 단백질의 복구에 영향을 미칠 수있는 붕괴 상당히 엄격한 조건이 필요하다. 실제로, 효모 세포 파괴에 대해 서로 다른 절차가 제대로 상대적인 세포 풍부을 나타내는 양 그대로 단백질을 복구하는 능력에 상당히 다릅니다. 또한 부정확 특정 단백질의 분해 속도를 결정하기 위해 사용되는 다양한 방법에 내재 : IM 다음 대사 라벨 기반의 &#39;펄스 체이스&#39;실험munoprecipitation, 특정 단백질 (12)을 분리, 자주 엄격하게 정량적 없습니다. 단백질 분해가이 방법에 의해 비교 될 때 따라서, 특별한주의는 결과를 해석에서 수행되어야한다. 이러한 결점을 회피하기 위해, 대안 사이클로 헥시 미드 (CHX) 체이스 분석은 (12)를 채용 할 수있다. 이 분석에서, 번역 억제제는 이후 모니터되는 세포 배양 및 단백질 정상 상태 수준의 시간 변화에 첨가된다. 그럼에도 불구하고, CHX의 사용은 비교적 짧은 반감기 (&lt;90 분), 단백질 합성의 장기 억제 세포 독성 인 단백질로 한정한다. 특히, 상술 한 분석법 둘 항상 사용할 수없는 단백질 - 특이 적 항체의 사용을 필요로한다. 이러한 기술적 한계를 극복하기 위해, 연구자들은 세포 추출 및 직접 단백질 처리를 필요로하지 않는 여러 가지 방법을 개발했다. 하나의 접근법은 영양 요 참의 확립에 기초필수적인 대사 효소를 코딩하는 유전자의 결실에 의해 얻어진 세인트 균주. 이러한 유전자는 OMP 디카 르 복실 라제를 코딩 HIS3,는 Leu2, LYS2 및 TRP1, 아미노산 생합성에 필요한 효소 부호화뿐만 아니라 URA3 (URA3), 피리 미딘 리보 뉴클레오티드 생합성 필수적인 효소를 포함한다. URA3 광범위 단백질 분해 연구에서 사용되어왔다. 상기 분석에서, URA3의 구성 적 발현이 우라실 - 결핍 배지 13 URA3 세포의 성장을 구출. 따라서, degron의 융합을 통해 URA3를 불안정화하는 최소 배지에 우라실 결핍 세포의 성장을 감소시킬 수있다. 이 방법은 성능 저하의 식별을 포함하여 다양한 단백질 분해 연구에서 5 결정 사용되고, E3는 14 리가 및 보조 ubiquitylation 15 요인과 새로운 UPS의 degrons (16)의 발견. 이 모든 방법은 분석 판독 등의 한천 플레이트에 세포 성장을 고용했다. 그러나, t그 성장 조건 (양 / 음의 성장), 견고하고 효율적인 주로 질적이며 degron의 효능 또는 다양한 보조 열화 요인의 상대적 기여도를 평가하는 것이 중요하다 정량적 정보를 제공하지 않고있다. 따라서 우리는 개발 및 융합 시스템 -degron URA3에 의해 단백질 분해 체계적이고 정량적 인 분석을 가능하게 효모 벡터 및 심사 방법을 활용했다. 프로토콜은 선택적 조건 하에서 액체 배양 (GILS)과 표준 성장 곡선의 생성에 성장 동역학을 측정하기 쉬운 핸들 분석에 기초한다. 지연, 지수 (로그)과 정지상 - 효모 성장 속도론은 세 가지 주요 단계를 특징으로한다. URA3-degron의 발현의 수준에 의해 결정되는 조건 하에서 선택적 로그 단계 동안 효모 복제 동력학 계산, 공평 정량적 측정을 제공 오F 단백질 분해. 이 방법은 측정하고 동시에 다수의 변형 및 다양한 조건 하에서 여러 UPS 기판의 분해율을 비교에 적용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:339px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:184px;">Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>233520</td>
			<td rowspan="6" style="width:339px;">For yeast growth on SD minimal media.&#160; Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>16325</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8626</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amino acids</td>
			<td>Highest purity available&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">96 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;">167008</td>
			<td>Any other compatible brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Cyclohexamide&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Sigma - Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>Working conc. 0.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:184px;">Infinite 200 PRO series</td>
			<td style="width:149px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;">For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">MDTcalc</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Experimental software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation

유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (UPS)에 의한 단백질 분해는 모든 진핵 생물의 단백질 항상성의 주요 규제 메커니즘입니다. 세포 내 단백질 분해를 결정하는 표준 접근 방식은 단백질 감소의 반응 속도를 다음과 같은 사항에 대해 생화학 적 분석에 의존합니다. 이러한 방법은 종종 시간과 노력이 소요되고 여러 기판 및 분해 조건을 평가하기위한 실험을하는 것이 의무가 없습니다. 대안으로, 세포 성장 기반 분석은 정량적 단백질 수준에서의 상대적인 변화를 결정할 수있는 그들의 종래의 형식, 종점 분석법이다이 개발되고있다. 여기에서 우리는 충실하게 효모 세포 성장 속도론에 결합하여 단백질 분해 속도의 변화를 결정하는 방법을 설명합니다. 방법은 URA3의 우라실 영양 요구 효모 세포 외 인적으로 발현 리포터 단백질에 의해 구출 -deleted 확립 선택 시스템에 기초, 필수적인 URA3 유전자 및 열화 행렬식 (degron) 간의 융합 구성. 리포터 단백질의 분해 속도가 degron 의해 결정되는 반면 그 합성 속도가 일정하게되도록 설계된다. 우라실이 결핍 된 배지에서 세포 성장이 URA3의 상대적 수준에 비례하기 때문에, 성장 속도론은 리포터 단백질 분해에 전적으로 의존한다. 이 방법은 정확하게 세포 내 단백질 분해 반응 속도의 변화를 측정한다. (a) E2 효소 컨쥬 게이트 구조 - 기능 (c) 식별 및 신규 degrons의 특성을 분석하여 단백질 분해 (b)에 공지 유비퀴틴 공역 요인의 상대적 기여도를 평가 : 그것은 적용 하였다. 그것은 또한 다른 세포질 통로의 기능과 연관된 단백질 수준의 변화를 모니터링하도록 구성 될 수 degron- URA3 기반 시스템의 적용은, 단백질 분해 필드를 초월.

리포터 기판의 열화 Doa10 경로의 효소의 역할을 조사 그것이 전통적인 분해 분석과 비교 하​​였다 GILS 방법의 유효성을 테스트한다. 이 실험은 ER-막의 성분의 상대적 기여도를 평가 지역화 단백질 품질 관리 리포터 기판 Deg1- VU (도 3A)의 열화에 20,21 복잡한 Doa10 E3-리가. Deg1- VU 플라스미드 야생형 세포 내로 또는 E2 공역 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation at JoVE.com

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

reporter-based-growth-assay-for-systematic-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K 조회수.  The Hebrew University of Jerusalem. Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

비디오: Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

연구

생물학

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

단백질 분해에서의 사이클로 헥시 미드 체이스 분석<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens provides an excellent model system to study bacterial pathogenesis and plant interactions. Previous studies of plant-Agrobacterium interactions have largely relied on plant cell suspension cultures, the artificial wounding of plants, or the artificial induction of microbial virulence factors or plant defenses by synthetic chemicals. However, these methods are distinct from the natural signaling in planta, where plants and microbes recognize and respond in spatial and temporal manners. This work presents a hydroponic cocultivation system where intact plants are supported by metal mesh screens and cocultivated with Agrobacterium. In this cocultivation system, no synthetic phytohormone or chemical that induces microbial virulence or plant defense is supplemented. The hydroponic cocultivation system closely resembles natural plant-microbe interactions and signaling homeostasis in planta. Plant roots can be separated from the medium containing Agrobacterium, and the signaling and responses of both the plant hosts and the interacting microbes can be investigated simultaneously and systematically. At any given timepoint/interval, plant tissues or bacteria can be harvested separately for various &#34;omics&#34; analyses, demonstrating the power and efficacy of this system. The hydroponic cocultivation system can be easily adapted to study: 1) the reciprocal signaling of diverse plant-microbe systems, 2) signaling between a plant host and multiple microbial species (i.e.&#160;microbial consortia or microbiomes), 3) how nutrients and chemicals are implicated in plant-microbe signaling, and 4) how microbes interact with plant hosts and contribute to plant tolerance to biotic or abiotic stresses.

The described hydroponic cocultivation system supports intact plants with metal mesh screens and cocultivates them with bacteria. Plant tissue, bacteria, and secreted molecules can then be separately harvested for downstream analyses, simultaneously allowing for the molecular responses of both plant hosts and interacting microbes or microbiomes to be investigated.

식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...