이 작품은 건강 교부금의 국립 연구소 # 1R01CA120825-01A1, 매사추세츠 애 머스트 대학의 공동 바이오 메디컬 연구 (CBR) 프로그램, 그리고 Bhushan J. Toley에 대한 Isenberg 장학금에 의해 지원되었다. 우리는 굉장히 제임스 Schafer, 비디오 기사를 고용, 나레이터,이 비디오 편집기의 귀중한 공헌을 인정합니다.

1. 장치 제작 탄성 재료의 마이크로 유체 기능을 복제 더피 외에 기술 된 방법에 따라되었습니다. 1 <ol><li> 믹스 엘라스토머 (polydimethylsiloxane, PDMS)과 9시 1분 무게 비율에 실리콘 엘라스토머 키트 (다우 코닝, 미들랜드, MI)에서 경화 에이전트와 4mm 두께의 층을 형성 할 수있는 마스터를 통해 부어. 가스를 제거하다 5 시간 동안 60 ° C에서 기포를 제거하고 혼합물을 치료합니다. 필은 탄성 중합체의 흐름 기능의 우표를 얻기 위해 금형에서 PDMS을 치료. </li><li> 1.5 mm 생검 펀치 (Miltex, 뉴욕, PA)를 사용하여 유입구 및 유출구를위한 펀치 구멍은 드릴 프레스에 장착. 모든 파편을 빼낸다. </li><li> 우표의 기능 측과 산소 플라즈마 식각 8 분 산소 플라즈마에 깨끗한 유리 슬라이드 될 수 있습니다. 그들 사이의 유대를 형성하기 위해 즉시 접촉 처리 표면을 가져와. 적어도 5 시간 동안 따뜻한 슬라이드 60 ° C에서 어셈블리를 유지s은 (는) 유대를 강화합니다. </li><li> 가시 여성 luer 잠금 커넥터 (Qosina, Edgewood, NY)에 첨부 된 남성 luer 자물쇠의 인터페이스 커넥터를 사용하여 유입구와 콘센트에 0.032 &quot;ID PTFE 관 (콜 Parmer, 버논 힐스, IL)를 연결합니다. </li><li> 차단 밸브와 Y-커넥터 (, 그림 1 Upchurch 과학, 오크 하버, WA)를 사용하여 흐름 어셈블리를 설정합니다. 현미경에 장치를 장착합니다. 20G 1.5 &quot;주사 바늘을 ​​(Bioscience BD, 락빌, MD)를 사용하여 튜브에 주사기를 연결합니다. </li></ol> 2. 통일 Spheroids의 형성 Spheroids이 매달려 드롭 방법 2,3에 의해 형성되었다. <ol><li> 무균 세포 배양 후드 아래에 세포를 Trypsinize. </li><li> 5 분 2000 rpm으로 trypsinized 세포를 원심 분리기 6 ML 신선한 매체에 resuspend. 원하는 최종 농도 (표 1)에 재고 솔루션을 희석. </li><li> 48 잘 접시의 덮개를 제거하고 (STE)에 거꾸로 넣고후드를 rilized. 각도에 해당하는 원형 지역은 커버에 분명합니다. 습도를 유지하기 위해 소독 물 1 ML과 판의 각 우물을 입력합니다. micropipette를 사용하여 각 원형 지역의 희석 세포 솔루션의 20 μl 소적을 놔. 조심스럽게 커버를 반전하고 물방울이 우물의 가장자리를 만지지 않도록 보장, 잘 판 위에 놓으십시오. </li><li> 일 지정 번호 (표 1)에 대해 37 ° C에서 잘 판을 품다. 회전 타원체는 각 매달려 드롭으로 구성됩니다. </li></ol> 3. 장치에 Spheroids 소개 해당 섹션에 대해 1 표 2 그림을 참조하십시오. <ol><li> 흐름 입구를 통해 소개 70 % 에탄올로 세정하여 장치를 검사. PBS는 세포 배양 매체를 버퍼 HEPES 다음과 후, 플러시. 튜브에 연결된 매체 주사기 S F 둡니다. </li><li> 주사기 S P에 2-3 spheroids을 끌어 기포를 제거하는 주사기를 누르고, 그리고장치의 포장 유입구에 연결합니다. </li><li> 오픈 유입 밸브 V 핀과 가까운 V 지느러미. 오픈 출구 밸브 V의 뿌루퉁과 가까이 V의 Fout. 아래 가리키는 바늘로 수직 포장 주사기를 잡고, spheroids는 바늘의 luer 잠금 커넥터에 주사기의 하단에 정착로 감상하세요. 포장 주사기와 감상 spheroids에 플런저를 밀어은 장치에 관 그리고 흐름을 입력합니다. 만 포장 출구 밸브가 열려 있기 때문에, 회전 타원체는 장치의 챔버를 입력하고 다시 (그림 2)에 게시하여 보관. </li><li> 닫기 입구 밸브 V 핀 및 출구 밸브 V의 입술을 삐쭉 거리다. 주사기 펌프에 주사기 S F를 탑재합니다. 오픈 밸브 V 핀과 밸브 V Fout. 3 μl / 분에서 장치로 흐름 매체입니다. </li></ol> 4. Apoptosis 감지 에이전트의 소개 (CaspGLOW) spheroids와 함께 방을 포장 한 후, U에 대한 평균을 허용검출 apoptosis 또는 치료 에이전트를 도입하기 전에, 영양 그라디언트 및 microenvironments를 구축 24 시간 P. 챔버의 조직은 상단과 하단의 뚫리지 벽과 접촉하기 때문에 조직의 두께를 따라 더 영양이 기울기 (0.15mm)가 없습니다. 부화 후 24 시간 후, 조직의 두께를 따라 모든 세포 레이어 따라서 동일하고 유일한 이질성까지는 흐름 채널의 방향에 있습니다. <ol><li> V 핀을 차단, 주사기 펌프를 중지 펌프에서 주사기 S F를 제거하고 0.25 μl / CaspGLOW 레드 활성 Caspase-3 마커 (적색 - DEVD-FMK의 ML을 포함하는 매체를 가진 주사기로 교체, Biovision, 마운틴 뷰, CA). </li><li> 수동으로 이전 매체의 변위를 보장하기 위해 장치를 통해이 솔루션의 0.7 ML를 플러시. , 펌프에 주사기를 장착 흐름을 다시 시작하고, 열린 V 지느러미. 5-8시간 기간 동안 apoptosis는 t에 에이전트 diffuses을 감지그는 조직과 apoptotic 지역의 밝은 fluoresces. 이 농도에서 Apoptosis 감지 에이전트는 장치로 이후의 모든 흐름 솔루션에 유지됩니다. </li></ol> 참고 : <ol class="lroman"><li> 조직 이질성은 제 6 항에 설명 된대로 형광의 선형 강도 프로파일을 얻어 확인 할 수 있습니다. 프로필 조직이 셀 가능성에 대해 이기종 것을 확인, apoptosis에서 공간적 그라디언트를 표시합니다. </li><li> CaspGLOW 그린 활성 Caspase-3 마커 (Fluorescein-DEVD-FMK, Biovision)도 apoptosis를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 이 아이콘 대신 붉은 색 형광을 rhodamine의 녹색 형광의 fluorescein이 포함되어 있습니다. </li></ol> 5. 치료 에이전트 소개 <ol><li> 에이전트를 감지 apoptosis를 포함, 10 μM의 doxorubicin 히드로 클로라이드를 (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO Dox) 도입 단계 4.1-4.2에있는 절차를 따르십시오. </li><li> therape의 흐름을 계속시간의 고정 기간 동안 utic 에이전트 솔루션입니다. 밸브 V의 핀을 종료하고 주사기 펌프를 끕니다. 에이전트를 감지 apoptosis가 포함 된 새로운 매체 주사기로 치료 주사기를 교체합니다. 지속적으로 현미경으로 조직을 모니터링하면서 24 -36 시간 동안 신선한 매체의 흐름을 허용합니다. </li></ol> 6. 약물 Diffusivity 계수의 시간 경과 현미경 및 추정 깨끗한 형광 데이터를 얻기 위해, 조직의 맨 아래 층에있는 현미경을 집중하여 모든 이미지를 획득. 수직 방향에 영양 기울기는 (제 4 참조)가 없기 때문에, 세포의 하단 레이어 위의 모든 다른 레이어의 좋은 대표입니다. <ol><li> 전체 수집 과정은 IPLab에 사용자 정의 스크립트를 (Bioscience BD, 락빌, MD)를 사용하여 자동화되었습니다. 10 배 배율의 포장 회전 타원체 매 30 분마다 (그림 3A)의 전송 빛과 형광 이미지를 취득. Acquir이전 Dox의 도입에 배경 형광의 전자 이미지입니다. 챔버의 대형 (1000 μm는 x 300 μm)를 수용 할 수 두 인접한 이미지와 함께 타일을 4 취득. </li><li> 약물 diffusivity 계수의 수학 평가를 들어, 첫 번째 단계는 ImageJ를 사용하여 Dox 형광의 평균 선형 강도 프로파일을 생성하는 것입니다. 챔버의 조직을 포함한 관심있는 직사각형 영역 (ROI)를 선택합니다. 유동 채널에서 도보의 함수로 평균 농도의 프로파일을 생성하기 위해 플롯 프로필 명령을 사용하십시오. 3까지 다른 시간 지점에 대한 반복합니다. </li><li> 조직에서 autofluorescence를 측정 할 수 Dox를 도입하기 전에 배경 형광 이미지를 얻을 수 있습니다. 획득 강도 프로필에서 평균 배경 형광 강도을 제거하고 얻기 위해 해당 최대 강도하여 각 프로파일을 정상화 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="C" /> (X, t) (도 3B). </li><li> 다음 단계는 종양 조직 내에서 Dox의 효과적인 확산 계수 D를 평가하는 것입니다. Dox 확산은 다음 방정식 (5)에 의해 표현 될 수있다 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="수식 1"/> erfc는 보완 에러 함수이고, x는 채널에서 조직으로 거리이며, t는 Dox의 도입 (그림. 3 참조) 후 시간입니다. 고려 때마다 시점에서 다음과 같은 반복 구조를 사용하여 <ul><li> D에 대한 값을 추측 </li><li> 각 위치 X에있는 방정식의 오른쪽을 계산 </li><li> 양측 사이의 제곱 오류의 합을 (잔류) 계산 </li><li> 잔여을 최소화하기 위해 D를 수정 </li></ul></li><li> 평균 조직의 Dox의 평균 유효 확산 계수를 추정하기 위해 각각의 시점에서 입수 D의 최적 값입니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : &lt;P 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 마이크로 유체 장치는 1mm를 제공 X 0.3mm X 0.15mm 광학 입체 종양 조직의 성장에 대한 접근이 문화 챔버. 다세포 종양의 spheroids는이 방에 도착했는데, 다시 두 개의 필터 게시물에 의해 유지되었다. 매달려 드롭 방식은 일관 크기와 여러 세포 라인에서 모양의 spheroids의 빠른 형성을 허용했다. 최대 3 일에 Spheroids이 성공적으로 장치에 성장했다. 챔버의 성장은 spheroids 내 microenvironments의 재현 수정과 관련된되었습니다. Apoptosis는 유동 채널 및 조직에 높은 깊이의 가까이에 세포에 덜 발생했습니다. 장치는 종양 조직에서 doxorubicin의 확산 계수를 추정하는 데 사용되었습니다. 8.75 × 10 -7 cm 2의 -1의 획득 값은 9.1의 값에 동의 × 10 -7 cm 2의 -1은 인간의 유방암에 이전 6 전했다. <table border="1"><tbody><tr><td> 셀 라인 </td><td> 필수 세포 농도 </td><td> 부화 시간 </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 세포 / μL </td><td> 2~3일 </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 세포 / μL </td><td> 3-4일 </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 세포 / μL </td><td> 5~6일 </td></tr></tbody></table> 공중 드롭 Spheroids에 대한 표 1. 매개 변수 <table border="1"><tbody><tr><td> 부분 </td><td> 기술 </td></tr><tr><td> S F </td><td> 흐름 주사기 </td></tr><tr><td> S P </td><td> 주사기를 포장 </td></tr><tr><td> V 핀 </td><td> 흐름 입구 밸브 </td></tr><tr><td> V 핀 </td><td> 입구 밸브를 포장 </td></tr><tr><td> V Fout </td><td> 유동 출구 밸브 </td></tr><tr><td> V의 입술을 삐쭉 거리다 </td><td> 출구 밸브를 포장 </td></tr></tbody></table> 흐름 설정에 표 2. 주사기와 밸브 <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1의 흐름 설정 V 핀과 V Fout의 도식 :. 흐름 입구와 출구 밸브, V 핀과 V의 입술을 삐쭉 거리다 : 포장 입구와 출구 밸브, S F와 S P : 흐름, 포장 주사기. 회전 타원체가 챔버 내로 비행 할 때 포장 주사기와 입구와 출구 밸브 패킹이 사용됩니다. 흐름 주사기와 흐름 입구와 출구 밸브는 이후 매체를 흘러하기 위해 사용됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 장치의 챔버에 갇혀있는 회전 타원체의 개략적가. 회전 타원체는 장치의 챔버로 흘러되어 두 개의 필터 POS에 의해 차단되어챔버의 뒷면 TS. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 장치의 종양 조직에서 Doxorubicin 확산. A.은 doxorubicin의 위치와 농도를 (빨간색) 표시, 조직의 전송 빛과 붉은 형광 이미지를 흡수 합병. 스케일 바는 250 μm를 나타냅니다. doxorubicin의 형광에서 B. 정규화 된 선형 강도 프로필.

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	<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly(dimethylsiloxane).">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro.">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li><li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics.">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li><li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer.">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li><li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma:+branching+patterns+and+vessel+dimensions.">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li><li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+physiology+of+solid+tumors:+opportunities+(and+problems)+for+cancer+therapy.">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li><li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy.">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

종양의 vasculature은 희박한하고 병 7,8를 개발했다. vasculature 9 불구하고 공급 영양분과 약물에 액세스 할 수있는 혈관에서 (&gt; 100 μm)까지 위치한 지역이 있습니다. 그 결과 이기종 microenvironment는 많은 chemotherapeutics (10)의 제한된 효과에 기여하고있다. 여기에 개발 된 마이크로 유체 장치는 체외에서, 동작 및 apoptotic 또는 괴사 세포를 proliferating 특징으로 이기종 종양의 microe...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 코멘트 </th></tr><tr><td> 실리콘 엘라스토머 키트 </td><td> 엘스 워드 접착제 </td><td> 184 실 Elast 키트 </td><td></td></tr><tr><td> Miltex 생검 펀치 </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31AA </td><td> 1.5 mm </td></tr><tr><td> PTFE 관 </td><td> 콜 Parmer </td><td> EW-06417-31 </td><td> 0.032 &quot;ID </td></tr><tr><td> 남성 luer 잠금 커넥터 </td><td> Qosina </td><td> 65,111 </td><td></td></tr><tr><td> 가시 여성 luer 잠금 커넥터 </td><td> Qosina </td><td> 11,556 </td><td></td></tr><tr><td> 차단 밸브 </td><td> Idex 보건 및 과학 </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Y-커넥터 </td><td> Idex 보건 및 과학 </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1.5 &quot;바늘 </td><td> BD Bioscienc전자 </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW Fluorescein </td><td> Biovision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW 레드 </td><td> Biovision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> Doxorubicin 염산염 </td><td> 시그마 </td><td> 44,583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> 인간 대장 암 세포 라인 </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> 인간 Ductal 암 세포 라인 </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> 인간 유방 암종 세포 라인 </td></tr></tbody></table>

microfluidic device for recreating a tumor microenvironment in vitro

우리는 체외에서 이기종 입체 종양 조직에 대한 전달 및 약물의 전신 등급을 모방 마이크로 유체 장치를 개발했습니다. vasculature에 의해 전달 영양소가 가능한, 동작 및 괴사 세포 유형으로 구성된 이기종 microenvironments에 상승을주는, 종양의 모든 부분에 도달 실패합니다. 많은 암 약물은 효과적으로 세포의이 때문에 이질성의 모든 유형을 관통하고 치료하기 위해 실패합니다. 암 세포의 Monolayers는 어려운 체외 모델에 적합한 암 약물을 테스트하고,이 이질성을 모방하지 않습니다. 우리 마이크로 유체 장치는 소프트 리소그래피를 사용하여 PDMS에서 가공되었습니다. 매달려 드롭 방식에 의해 형성된 다세포 종양 spheroids은, 삽입 구속 장치에 직사각형 방에 한면에 연속 매체 재관류로 유지했다. 장치의 챔버의 사각형 형태는 조직 내에서 선형 그라디언트를 만들었습니다. 형광 얼룩은 일을 수량​​화하는 데 사용 된조직 내에서 apoptosis의 전자 다양성. 장치의 종양은 형광 chemotherapeutic 약물 doxorubicin, 시간 경과 현미경은 조직으로의 확산을 모니터링하는 데 사용하고, 효과적인 확산 계수가 추정되었다로 치료했다. 매달려 드롭 방법은 여러 암 세포 라인의 균일 한 spheroids의 빠른 형성을 허용했다. 이 장치는 최대 3 일에 spheroids의 성장을 활성화. 매체를 흐르는의 가까이에있는 세포 최소한 apoptotic이었고 그까지 채널에서이를 정확하게 혈관에 인접한 종양의 지역을 모방, 더 많은 apoptotic했다. doxorubicin 확산 계수의 추정 값은 인간의 유방암에서 이전에보고 된 값으로 동의했다. 고체 종양의 약물의 침투 및 유지가 효능에 영향을 미치는 때문에, 우리는이 장치가 약물의 행동을 이해하고, 새로운 암 치료학 개발에 중요한 도구입니다 있다고 생각합니다.

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

우리는 이기종 종양 microenvironments를 재현 마이크로 유체 장치의 제조 및 운영을위한 절차를 제시<em&gt; 체외에서</em&gt;. 종양 조직에서 apoptosis의 다양성이 평가 된 형광 얼룩과 종양 조직에 chemotherapeutic 약물 doxorubicin의 효과적인 확산 계수를 사용하여 정량되었다.

종양 Microenvironment를 재현을위한 마이크로 유체 장치<em&gt; 체외에서</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

11.5K 조회수.  University Of Massachusetts Amherst. 우리는 이기종 종양 microenvironments를 재현 마이크로 유체 장치의 제조 및 운영을위한 절차를 제시 체외에서. 종양 조직에서 apoptosis의 다양성이 평가 된 형광 얼룩과 종양 조직에 chemotherapeutic 약물 doxorubicin의 효과적인 확산 계수를 사용하여 정량되었다.

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A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

여러 고유 긴장 유학을위한 마이크로 유체 장치

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

연구

생체공학

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

암 세포의 침략에 응용 프로그램을 사용하여 종양의 기질 미시의 조직 공학

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

마이크로 스케일 슐 리렌 기술에 의해 미세 유체 소자 믹싱 비균질성 분석

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

미세 소자에서 조직 모델 perfusable 혈관 네트워크

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

장기 나노 물질 노출 다음 체외 물질 독성 테스트를 위한 고급 3D 간 모델

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

조합 플러그 생산을 위한 미세유체 장치 설정

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

저자 스포트라이트: Integrating Computational and Experimental Approaches in Precision Oncology

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

조합 플러그 생산을 위한 이중층 미세유체 장치

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...