이 절차의 목적은 뼈 리모델링을 평가하고 암세포와 함께 칼바리아 배양 또는 공동 배양을 사용하여 종양 뼈 미세 환경을 재현하는 전 생체 모델입니다. 대부분의 calvaria 기술은 뼈 리모델링을 평가하기 위하여 신생아 마우스에서 calvaria 뼈를 사용하여 기관 배양 시스템입니다. 당신은 다양한 분자의 치료 잠재력을 테스트 할 수 있습니다, 또는 암세포와 공동 배양을 사용할 때 뼈 종양 미세 환경을 재현.
이 모든 것은 짧은 시간과 저렴한 비용으로 간단하고 쉬운 분석으로. 이 기술의 목적은 마우스 calvarial 장기 배양의 전 생체 모델을 사용하여 암 뼈 미세 환경에서 뼈 재생을 평가하는 도구를 갖는 것입니다. 먼저 마우스 새끼를 선택하고 후드 아래에 놓습니다.
우리는 5 일에서 7 일 된 마우스 새끼에서 calvaria를 사용합니다. 주사기로 머리를 가지고 피부를 잘라 내고 칼바리아를 해부할 만큼 두피 부위를 치웁울 수 있습니다. 두개골, 처상, 관상 및 람도이드의 봉합사를 식별합니다.
눈의 정도에 따라, 람도이드 봉합사를 따라 직선 컷을 합니다. 양두엽 봉합사에서 관상 봉합사쪽으로 양쪽을 잘라냅니다. 45 각도에서 전방 폰타넬의 컷으로 만든 컷의 끝을 연결하는 또 다른 컷을 만듭니다.
정확한 조직 포함 및 조직학 분석을 보장하기 위해 두개골 봉합사, 처진, 정면, 관상, 람도이드를 정의하는 것이 매우 중요합니다. 미세한 팁 집게로 칼바리아를 제거하고 페트리 접시 커버에 넣습니다. 메스를 사용하면 관상 봉합사를 통해 처진 봉합사를 따라 후방 폰타넬에서 직선으로 자른다.
두 개의 단면이 얻어진다. 각 칼바리아를 집게로 집어 들고 PBS가 있는 새로운 페트리 접시에 넣습니다. 문화의 경우, 24웰 조직 배양 판에 자단을 놓고 1밀리리터의 미디어가 들어 있고 37도에서 24시간 동안 배양합니다.
우리는 또한 뼈 재흡수를 위한 종양 뼈 미세 환경을 재현하기 위하여 1 차적인 calvarial 배양을 사용할 수 있습니다. 이를 위해, 우리는 암세포또는 암세포에서 조건부 된 매체와 calvarias를 공동 배양합니다. 24 시간 후, 미디어를 제거하고 테스트할 치료가 포함된 미디어로 대체하십시오.
암세포와 뼈 상호 작용을 평가하거나 종양 뼈 미세 환경을 재현하고자 하는 경우, 칼바리아를 낮은 세포 부착 판으로 전달하여 암세포의 부착을 플레이트에 부착하지 않도록 한다. 암세포를 트립시화하고, 계산하고, 자단변의 꼭대기에 조심스럽게 놓습니다. 또한 암세포에서 조건부 미디어를 사용하고, hemicalvaria를 배양하는 데 사용할 수 있습니다.
37도에서 6~7일 동안 인큐베이션을 하고, CO2는 5%입니다. 셋째 날에는 미디어를 변경하고 인큐베이팅을 계속합니다. 공동 배양에서 사용하는 세포의 수는 암 세포 라인에 따라 달라집니다.
먼저 하나에서 반응을 유도하는 데 필요한 셀 수를 최적화해야 합니다. 문화 가 끝난 후, 칼바리아는 고정, 탈화 및 파라핀 임베디드 과정을 통과합니다. 또한, 조직은 마이크로토메, 염색, 조직형태 분석으로 단면화된다.
칼바리아의 포함은 까다로울 수 있습니다. 조직이 포함 되는 동안 보호 되도록, 스폰지 사이 조직을 넣어 또는 카세트에 넣어 전에 티슈 종이 또는 다른 흡수 종이를 사용할 수 있습니다. 조직 처리를 위해, 조직 종이에 자단변이를 감쌉시다.
그런 다음 포함 된 카세트에 넣고 포르말린의 중립 버퍼로 4도에서 24 시간 동안 수정하십시오. 칼바리아를 탈칼로치하려면 카세트를 4도에서 48시간 동안 10%EDTA에 넣습니다. 자동 조직 프로세서에서 자단변과 조직 카세트를 처리합니다.
규칙적인 일일 회전 주기를 따라 파라핀에 포함하십시오. 단면을 위해 마이크로톤으로 4개의 미세한 부분을 자르고, 단면을 유리 현미경 슬라이드에 장착하고, 헤마톡슬린, 에오신을 사용하여 얼룩을 장착합니다. 히스토로지 분석은 뼈 표면과 뼈 리모델링 영역의 정량적 분석을 수행하기 위해 사용되었다.
7일 칼바리아의 이미지는 이미징 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 정량적 평가의 경우 먼저 분석 영역을 정의합니다. 4개의 X가 방향과 봉합사를 식별하는 텔로파의 섹션을 살펴봅니다.
관상 봉합사를 정의하고 한쪽의 긴 뼈 표면을 식별한 다음 다른 쪽의 짧은 표면을 식별합니다. 40X 배율 하에서 관상 봉합사를 식별하고 긴 표면을 따라 봉합사에서 두 개 또는 세 개의 광학 필드를 이동합니다. 분석을 위해 이 영역의 이미지를 캡처합니다.
이미지 소프트웨어를 사용하여 골격의 구조적 무결성을 분석할 수 있습니다. 자막변의 두께 및 뼈 영역에 대한 정량적 조직학적 분석을 수행할 수 있다. 올바른 calvaria 분석은 일관된 조직학적 결과를 위해 좋은 포함과 적절한 방향에 달려 있습니다.
실험 조건당 적어도 3개의 calvaria를 사용해야 합니다. 여기에서 뼈의 구조를 볼 수 있습니다. 주황색에서 뼈가 관찰됩니다.
우리는 또한 골막, ostocyte, 내스트리움 및 뼈의 다른 부분의 존재를 볼 수 있습니다. 우리의 경우, 우리는 뼈 리모델링을 증가시키기 위해 인슐린을 사용합니다. 대조군과 비교하여 뼈 부위가 크게 증가하는 것을 볼 수 있습니다.
여기서는 MDA-MB-231 세포주 모델 칼바리아의 효과를 확인할 수 있습니다. 우리는 암세포의 존재가 뼈 파괴를 자극하는 골성 계수를 유도한다는 것을, 대조군과 비교하는 것을 볼 수 있습니다. 우리는 암세포 및 히스토로지와의 공동 배양에 의한 뼈 재생 및 암 세포 뼈 상호 작용을 측정하기 위하여 calvaria 모형을 이용했습니다.
또한 정량적 실시간 PCR을 통해 데이터를 검증합니다. 이러한 전 생체 내 모델은 3차원 조직 및 뼈의 세포 다양성이 보존되고 실험 조건을 조절할 수 있는 등 많은 장점을 가지고 있다. 게다가, 모델은 간단하고, 짧은 시간 동안 결과를 볼 수 있으며, 저렴한 비용입니다.
그리고 정량적 실시간 PCR, 현미경 검사법 및 마이크로 CT와 같은 다른 기술과 결합 될 수 있습니다.
