종양 미세 환경을 포괄적으로 특성화하는 것은 면역 종양학 연구에서 필수적입니다. 이 분석체는 고형 종양 조직에서 면역 세포를 측정하기 위해 RNA 기반 건강 발현 모델을 사용하는 최초의 분석이다. 이 분석은 연구원이 FFB 고형 종양 조직에서 면역 결합의 매우 민감하고 특정 측정을 얻고 다차원 바이오 마커로 이러한 결과를 결합 할 수 있습니다.
면역 요법뿐만 아니라 모든 암 치료는 고형 종양 부위에 면역 반응을 유도합니다. 이 면역 반응을 측정하는 것은 질병 진행 및 치료 반응을 이해하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 기존의 RNA 라이브러리 준비 기술과 표적 캡처를 결합합니다.
시간이 많이 걸리는 동안, 세척 단계에 따라 제안 된 품질 관리 체크 포인트를 모니터링하는 것은 성공을 위해 매우 중요합니다. 포르말린 고정 파라핀 임베디드 샘플에서 고도로 저하된 RNA의 경우, 테이블에 따라 얼음에 대한 첫 번째 가닥 합성 반응을 조립한다. 미세 원심 분리기에서 시료를 잠시 회전하기 전에 여러 번 위아래로 피펫팅하여 반응을 철저히 혼합합니다.
원심분리가 끝나면 테이블에서 프로그램 번호 3에 따라 샘플을 예열된 열 순환기에 즉시 배치합니다. 고품질 의 그대로 RNA를 위해, 테이블에 설명된 대로 핵자유 PCR 관에 얼음에 대한 첫 번째 가닥 합성 반응을 조립한다. 이 절차를 시작하려면, COT-1 DNA의 두 마이크로 그램과 뉴클레아제없는 PCR 튜브에서 올리고를 차단하는 두 마이크로 리터와 관심의 바코드 라이브러리의 200 나노 그램을 혼합.
그런 다음 30 ~45도로 설정된 진공 농축기를 사용하여 튜브의 내용기를 건조시다. 혼성화 후 열 사이클러에서 샘플을 제거하고 열 사이클러를 섭씨 65도에서 배양하도록 설정하고 가열 된 뚜껑은 섭씨 70도로 설정됩니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 완전히 균질화된 구슬 17마이크로리터를 샘플및 파이펫으로 10회 위아래로 완전히 전송합니다.
비드에 DNA를 결합하려면 튜브를 열 순환기(10)에 따라 열 순환기에 넣고 10분마다 10분에서 12분마다 벗겨진 튜브를 3초동안 부드럽게 제거하여 구슬을 다시 매달아 두십시오. 결합 된 인큐베이션 직후 열 사이클러에서 튜브 한 스트립을 제거하고 예열 된 세척 버퍼 100 마이크로 리터를 튜브에 추가합니다. 파이펫을 10번 위아래로 철저히 위아래로 배치하여 튜브를 마그네틱 랙에 배치하여 구슬이 세척 용액과 완전히 분리된 후 상체가 포함된 무한DNA를 흡입할 수 있도록 합니다.
랙에서 튜브를 제거하고 거품을 피하기 위해 주의하는 구슬을 완전히 재연하기 위해 철저한 혼합과 함께 예열 된 엄격한 세척 버퍼 150 마이크로 리터를 추가하십시오. 튜브를 65도의 열 사이클러에 다시 넣고 튜브를 자기 랙에 다시 배치하여 구슬이 초월제와 완전히 분리되도록 합니다. 슈퍼나티가 함유된 언바운드 DNA를 버리고, 총 2개의 엄격한 세척을 위해 입증된 것처럼 예열된 엄격한 세척 버퍼로 구슬을 다시 한 번 씻으십시오.
마지막 세척 후, 상체를 제거하고 실내 온도 세척 버퍼 150 마이크로 리터를 튜브에 추가합니다. 파이펫은 구슬을 완전히 재닫고 30초 동안 소용돌이를 번갈아 가며 30초 동안 쉬며 2분 동안 밀봉된 뚜껑으로 샘플을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서 원심분리기는 간단히 원심분리기를 짧게 놓고 튜브를 자기 랙에 놓고 구슬이 자석에 완전히 부착되면 상퍼를 제거합니다.
캡을 닫고 샘플을 자기 랙으로 되돌리면 튜브를 간략하게 원심분리합니다. 10 마이크로리터 파이펫을 사용하여 잔류 세척 버퍼를 제거하고 실온 세척 버퍼 2의 150 마이크로리터를 추가하십시오. 파이펫은 구슬을 완전히 재닫고 30초 동안 소용돌이를 번갈아 가며 30초 동안 쉬며 2분 동안 밀봉된 뚜껑으로 샘플을 배양합니다.
간단한 원심 분리 후 각 튜브의 구슬 전체 부피를 깨끗한 핵자유 PCR 튜브로 옮기고 튜브를 자기 랙에 놓습니다. 슈퍼나티가 포함된 언바운드 DNA를 폐기한 후, 샘플을 다시 원심분리하고 10 마이크로리터 파이펫을 사용하여 자기 랙에 있는 동안 구슬에서 잔류 세척 버퍼를 제거합니다. 150 마이크로리터의 워시 버퍼 3을 튜브에 넣고 파이펫을 10~20회 위아래로 추가하여 구슬을 완전히 재보페합니다.
튜브를 2분간 배양하여 30초 간 부드러운 소용돌이와 30초 간 휴식을 취한 후 잠시 원심분리합니다. 튜브를 자기 랙에 놓고 슈퍼네이넌트를 흡인시키고 비드 샘플을 다시 원심분리합니다. 10 마이크로리터 파이펫을 사용하여 랙에서 튜브를 제거하고 튜브 당 뉴클레아스없는 물 20 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단하기 전에 자기 랙에있는 동안 구슬에서 잔류 세척 버퍼를 제거하십시오.
그런 다음 구슬을 10번 피펫하여 튜브 측면에 붙어있는 구슬이 다시 중단되었는지 확인합니다. 어댑터 디머의 존재를 평가하여 추가 정리가 필요한지 확인해야 합니다. 예를 들어, 이 전기페로그램은 128개의 기본 쌍 주위의 날카로운 피크로 나타나는 허용 가능한 어댑터 디머 수준을 나타내며, 이 전기페로그램은 받아들일 수 없는 수준의 어댑터 디머를 나타낸다.
상기 면역 프로파일전 및 사후치료는 관심있는 각 면역세포에 대한 백분율의 변화와 총 면역 함량이 단일 환자에 대한 화학요법 전 및 후화학요법을 나타내는 대표적인 분석에서와 같이 종양 미세 환경에 대한 특정 치료법의 효과를 이해하는 데 사용될 수 있다. 이 분석에서 환자 그룹 간의 샘플은 치료 후 질병 진행 시간에 따라 비교되었습니다. 환자의 하위 집합은 18 달 후에 질병 재발을 보여주었고 다른 하위 세트는 18 달 이하에서 더 빨리 진행되었습니다.
중앙델타 값은 각 시료에 대해 비교하여 질병 진행의 바이오마커를 식별할 수 있습니다. 예를 들어, 여기서 2개의 면역 탈출 유전자는 견본 군진의 통계적으로 유의한 분화기로 확인되었습니다. 개별 유전자 바이오마커는 명확한 통계적 유의성을 가지고 견고했기 때문에 다차원 바이오마커는 상당한 예측 가치를 추가하지 않았다.
시료 냉각을 방지하기 위해 한 번에 하나의 스트립을 가열한 세체를 수행하고 비드를 신선한 튜브로 옮겨 표적 오염을 피해야 합니다. 이 프로토콜은 면역 세포와 종양 조직을 정량화하기 위해 유전자 발현 모델의 사용을 보여줍니다. 새로운 모델은 피로 또는 활성화와 같은 세포 상태를 측정하기 위해 개발되고 있습니다.
