We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.

참고 : 사용, 말초 폐 조직에서이 연구, 폐 중간 엽 기질 세포 (LR-중간 엽 줄기 세포)의 경우 분리되었다 중 자신의 세포 표면 마커의 발현 (CD45의 NEG, CD31의 NEG, 무서-1 고,는 EpCAM의 NEG) 14, 15을 기준으로 이식편 밖으로 성장 (16), 또는 효소 소화 (17)를 사용하여. 자기편 LR-중간 엽 줄기 세포는 높은 혈당없이 글루타민, 15 % FBS, 1X / 항생제 항진균제, 2 mM의 글루타민 (이제부터는 완전한 미디어)와 DMEM에서 배양하고, 37 ℃, 5 % CO 2에서 배양 하였다. LR-중간 엽 줄기 세포 마이그레이션 분석에 대한 상대적으로 균일 한 성장 특성과 세포 집단을 보장하기 위해 3 ~ 4 번 계대 하였다. 1. 합류 단층을 준비 <ol><li> 표준 100mm 배양 접시에서 중간 엽 줄기 세포를 분리하기 위해, 37 ° C 미리 예열 PBS의 10 ㎖로 세포를 씻어 PBS를 기음과 트립신의 4 ㎖ (0.25 %)를 추가합니다. 37 °의 C 배양기에서 3 ~ 5 분을 품어. C를 대기음5 분 세포를 펠렛하는 원뿔 튜브에 ELL 학생은 300 g에서 완전한 매체와 원심 분리기의 동일한 볼륨을 추가 할 수 있습니다. 주 : 트립신 길어 배양은 세포 표면 수용체를 변경 잠재적 이동에 영향을 미칠 수있다. </li><li> 기음 미디어와 신선한 전체 미디어에 resuspend 세포. 세포를 트리 판 블루 배제 개수를 사용하여 사균을 제외하고 60mm 세포 배양 접시에 완전한 미디어의 4 ml의 50 간엽 기질 세포를 접시. 주 : 세포의 소스에 따라, 테스트는 필요한 세포의 최적의 수를 결정하는 것이 필요할 수있다. </li><li> 플레이트는 최적의 세포 부착과 증식에 90 %의 합류, 중간 엽 줄기 세포에 대한 일반적으로 48 ~ 72 시간까지 세포를 품어. 참고 : 100 % 합류가 자신의 철새 용량을 변경할 수 많은 고정 의존 세포 경험 연락처 억제하기 때문에 사용하지 않는 것이 좋습니다. 이미지 분석 소프트웨어가 갭을 해석하기 때문에 80 % 미만의 합류점과 플레이트 불가능한 포토 초래할 것처음의 둘레의 한 부분으로 세포 사이의 (그림 1D 참조). </li><li> 세포가 90 % 합류에 도달 한 후에, 애플리케이션을위한 적절한 세포를 손상. 수용성 담배 연기 추출 (CSE)에 노출 된 후 세포 손상을 평가하기 위해, 2 분 18 세 이상 뷰 흐너 플라스크에 전체 미디어의 25 ml를 통해 1 켄터키 대학의 연구 담배 (3R4F)에서 연기를 그려 100 % CSE를 생성합니다. </li><li> 전체 미디어에 희석 4 ml의 1~4%의 CSE에서 24 시간 동안 세포를 품어. 배양 후, 4 ㎖의 신선한 완전한 매체와 교체하기 전에, 따뜻한 멸균 PBS의 4 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오. 참고 : 담배 연기 추출물의 높은 농도 (&gt; 5 %)에 손상을 입히는 세포를 실질적으로 합류를 줄일 수 있습니다. </li></ol> 2. 스크래치 만들기 <ol><li> 무균 환경에서 손상된 중간 엽 줄기 세포의 60mm 판에서 뚜껑을 제거하고 AC (예 : 멸균 플라스틱 통치자에 대한) 직선을 마련로스 플레이트의 상부 림. 미디어를 제거하지 않고, 약 5mm 간격 판에서 1-4 병렬 긁힌 자국과 긴 50mm를 만들기 위해 멸균 직선 가장자리에 의해 인도 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용합니다. 주 : 직선 에지는 현미경 스테이지에있을 때 판에 필요한 회전 조정의 양을 최소화한다. 이는 상처가 화면에 완전하게 수직 (또는 수평) 표시하는 것이 필수적이다. 60mm 접시에 여러 상처 생성하는 세포 이동을 (데이터는 도시하지 않음)에 영향을 미치는 방식으로 미세 환경을 변경하지 않고, 다른 종류의 세포에 대한 고려 될 수있다. 우물의 가장자리에 성장하는 세포의 변화가 더욱 두드러지고 상처의 균일 한 세대에 영향을 미칠 수 있기 때문에 작은 우물의 사용은 권장되지 않습니다. </li><li> 미디어를 대기음 부드럽게 스크래치의 중심에 부착 세포를 방지하기 위해 미리 예열 전체 미디어의 2 ㎖로 접시를 세척하고, 세포를 제거하기 위해긁힘에 의해 완화 된의. 신선한 전체 미디어의 4 ㎖로 교체합니다. </li><li> 멸균 영구 마커를 사용하여 흠집을 이미징을 간섭하지 않는 위치에서 상기 플레이트의 밑면에 각각 1-4 스크래치 라벨. 참고 : 스크래치 폭의 변화가있을 수 있기 때문에 그것은, 같은 처음부터 이미지가 이전과 마이그레이션 후 비교하는 것이 중요하다. </li></ol> 3. 스크래치의 초기 이미지를 촬영 참고 : 스크래치 분석 여러 판에서 수행되는 경우,이 상처는 다음 접시에되기 전에 하나의 접시에 모든 상처의 초기 이미지를 촬영하는 것이 좋습니다. <ol><li> 분석에 필요한 이미지를 생성하는 카메라 역 위상차 현미경을 사용한다. </li><li> 현미경의 문화 판을 놓고 스크래치 번호를 찾기 위해 낮은 전력 목적 (10X)를 사용하여 1. 배양 접시의 뚜껑에 응축 맑은 IMAG을 방해하는 경우세포의 전자는 37 ℃로 가열 된 무대 세트를 사용합니다. </li><li> 필요한만큼의 화상을 얻기 완전히 수평 시야의 중심에 스크래치를 유지하는 스크래치의 길이의 90 %를 포함한다. 이미지 사이에 중복으로 스크래치의 서로 다른 부분의 이미지를 얻습니다. 참고 : 배양 접시의 가장자리에 빛의 굴절을 분석하기가 불가능하고, 이미지를 overexposes. 따라서, 처음부터 이미지를 가지고 스크래치의 길이의 5 %를 지속되지 않습니다. </li><li> 별도의 폴더에 각각 처음부터 이미지를 저장합니다. </li><li> 반복 흠집 2, 3 3.2-3.4, 4 단계를 반복합니다. </li><li> 즉시 초기 이미징 후 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. 세포가 4-7 시간 동안 이동하자. 참고 : CSE와 손상 중간 엽 줄기 세포를 평가할 때 7 시간이 최적입니다. 세포 증식은 세포의 이동에 대한 혼란 변수로 작용할 수 있기 때문에보다 7 시간 동안 세포를 배양 (아래 옵션 참고 8.2 참조)하지 않는 것이 좋습니다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. 초기 스크래치 이미지 분석 <ol><li> (재료 / 장비의 표 참조) ImageJ에 다운로드 및 상처 치유 도구 플러그인을 설치합니다. </li><li> ImageJ에있는 이미지 파일을 연 다음 상처 치유 도구 스크래치 영역 (그림 2B)을 계산하기위한 스크래치를 둘러싸고있는 세포를 강조하기 위해 &quot;가장자리 찾기&quot; &quot;프로세스&quot;를 클릭합니다. 다음, &quot;이미지&quot;, &quot;조정&quot;, &quot;컬러 임계 값&quot;과 &quot;임계 값 색상&quot;이라고 표시된 드롭 다운 메뉴에서 값 변경을 클릭합니다 &quot;B &amp; W를.&quot; </li><li> 스크래치 및 세포 앞 사이의 최적의 대비가 달성 될 때까지 &quot;컬러 임계 값&quot;메뉴 내에서 모두 밝기 임계 값 슬라이더를 조정합니다. 이미지의 대비를 만들 수있는 권리 (완전히 검은 이미지) 완전히 바닥 슬라이더를 이동 한 다음 최대 대비를 생성하기 위해 상단 슬라이더를 조정하려는 가장 큰 범위를 허용합니다. </li><li> 천천히 상단 BRI를 조정이미지가 깨끗하게 스크래치 (그림 2C)의 윤곽이 표시 될 때까지 왼쪽에서 오른쪽으로 ghtness 슬라이더. 스크래치의 가장자리가 확인되고 나면, 스크래치 영역을 강조하기 위해, 드롭 다운 메뉴에서 &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot;를 선택하고 &quot;M&quot;버튼 (즉 ImageJ에 도구 모음에 나타납니다)를 누르면 ImageJ에 툴바에서 &quot;추가 도구&quot;를 클릭 출력 결과 팝 아웃 창 (그림 2D)에서 계산 된 영역입니다. </li><li> 복사 및 엑셀 스프레드 시트에 결과 창 (그림 2E)의 모든 번호를 붙여 넣습니다. 개인의 상처에서 데이터를 분리해야합니다. </li></ol> 5. 스크래치의 최종 이미지를 촬영 <ol><li> 세포 (4-7 시간) 마이그레이션 한 후, 반복 3.2-3.4 단계를 반복합니다. 이미지 각 접시에 세포가 이동하는 동일한 시간을 준 있도록 그들이 긁힌 것과 같은 순서로 판. 주 : 세포를 여러 시점에서 이미징 될 수있는, 그들의 SENSI에 따라모두 온도와 pH를 변화 tivity. 대안 적으로, 생균 촬상 그들이 마이그레이션 실시간으로 세포를 수행하는데 사용될 수있다. </li></ol> 6. 최종 스크래치 이미지 분석 <ol><li> 반복 최종 스크래치 이미지 4.2-4.5 단계를 반복합니다. </li></ol> 7. 마이그레이션을 정량화하기 위해 스크래치 영역을 계산 <ol><li> 각 스크래치의 초기 면적 값을 평균함으로써 평균 사전 이주 면적을 계산한다. </li><li> 평균 사전 이주 영역 (단계 7.1)에서, 단계 6에서 계산 된 각 이미지에 대한 최종 이동 영역을 빼서 이주의 총량을 계산한다. 마이그레이션의 변화를 나타내는 각 스크래치의 값의리스트를 생성한다. </li><li> (즉, 셀의 모든 판과 모든 상처 0 %에 노출 CSE) 동일한 시험 군 내에서 여러 상처로부터 데이터를 풀. 실험 그룹 간의 차이를 분석하기 위해 분산 시험의 분석을 사용한다. </li><li> 세포는 이동 속도가 느린 경우및 (보다 10-12 시간 이하) 긁 후 긴 배양 시간을 필요로, 세포 이동 분석법이 발생하는 기간 중에 증식을 겪고 있는지의 BrdU 또는 듀 혼입 분석 (19)를 결정하기 위해 수행. 상당한 세포 증식을 방지하기 마이그레이션 분석 시간을 선택한다. </li></ol> 선택 (8) <ol><li> 중요한 세포 노화가 찰 절차의 결과로 발생 여부를 평가하기 위해, 19 긁힘 후 미리 정해진 시간에 시험 접시에 노화 관련 베타 - 갈 락토시다 분석을 수행합니다. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에 설명 된 프로토콜을 수행하고 스크래치 시험 법을 정량적으로 분석 할 수있는 견고하고 표준화 된 방법을 제공한다. 간단한 스크래치 분석은 정기적으로 세포의 이동을 조사하는 연구의 다양한 분야에서 사용된다. 그러나 전통적으로 스크래치 분석은 재현성 7,10에 문제하게되었다 표준화 된 설정 및 정량 프로토콜을 결여하고있다. 변형 및 스크래치 시험을 향상 최적화 많은 개?...

세포 이동은 조직 개발, 수리 및 재생뿐만 아니라, 암의 전이 및 동맥 경화 1과 병리학 적 과정 등 많은 생리 학적 과정에 매우 조정 및 중요합니다. 세포 이동의 이해는 손상된 조직을 복구하고 세포 이식 기술과 인공 조직 2 접목을 포함한 병리학 적 조건을 치료하는 데 사용 신흥 치료에 특히 관련이있다. , 조직 복구 3을 매개 엄격 정량화 적응 및 경제적 인 관심의 분석을 이용하여 이들 세포의 이주 능력을 정량화 간엽 기질 세포 (MSC들)의 역할에 관심을 주어 현재. 중요한 것은, 이러한 분석은 손상 후 세포의 철새 용량 상대적으로 미묘한 변화를 감지 할 수있을만큼 충분히 민감해야합니다. 스크래치 분석, 트랜스 웰 마이그레이션 분석을, 세포 이동을 정량화 포함한 현재의 방법 (보이든의 채널ambers) micropillar 어레이 및 셀 배제 영역 분석법은 재현성, 커스터마이즈, 정량화 및 경제성 1,4,5 한계의 범위를 갖는다. 여기에 설명 된 최적화 된 스크래치 분석은 강력한 결과, 정량화 및 이미지 기반 분석 기능, 비용 효율성 및 기타 응용 프로그램에 대한 적응성을 보여줍니다. 스크래치 분석은 다른 실험 조건 하에서 5 세포 이동과 증식을 평가하기 위해 여러 용량으로 사용되어왔다. 분석은 또는 가까운 합류를 완료하기 위해 그들을 성장, 지정된 세포를 파종하고, 멸균 바늘 또는 피펫 팁 6 결과 단층를 긁적 수반한다. 분석은 가장 일반적으로 무작위로 위치 7-9에서 여러 시간 지점 위에 스크래치의 폭을 비교함으로써 수행된다. 그것의 저명한 사용에도 불구하고, 스크래치 분석은 재현성과 정량 문제에 의해 혼동된다. 의 변동성흠집의 발생뿐만 아니라, 세포의 미세 환경을 변화뿐만 아니라, 플레이트 표면과 기저 세포 외 매트릭스 (5)의 손상에 의해 세포 이동을 저해 할 수있다. 분석법 빈번 그러나 느린 이동 및 더 긴 분석 시간을 표시하는 세포주에 대해, 12 시간에 걸쳐 진행되는 7, 증식 교란 변수 7,10된다. 마지막으로, 찰과 공정에 의해 생성 된 노화 세포는 단층 1 격차를하는데 필요한 세포 외 신호에 방해 요인을 해제 할 수있다. 스크래치 시험을 최적화하면 분석 시간 길이를 최소화하고, 조작 동안 원치 않는 세포 사멸을 방지하는 표면 특성을 방해하지 않는 일관 갭의 생성을 필요로한다. 스토퍼 기재 분석법은 세포 배제 영역 분석법의 최적화이다. 이 분석은 세포 성장을 배제 웰의 중앙에 배치 된 스토퍼를 이용하지만, 세포가 배제 중앙 영역의 주위에 도금 될 수있다.마이그레이션을 평가하기 위해, 스토퍼가 제거되며, 생성 된 배타 존은 마이그레이션이 발생하기위한 표면을 제공한다. 그러나 이러한 분석은 사용자 또는 10 적응 어렵고 일부 애플리케이션의 경우,이 기술은 엄청난 비용이 될 수있다. 스크래치 시험 법 및 이들의 유도체, 트랜스 웰 마이그레이션 분석 (또는 보이든 챔버 분석법) 대조적 화성 제 8,11 함유 챔버에, 미 공성 여과막을 통해, 하나의 챔버로부터 이동 세포 수를 정량함으로써 마이그레이션을 평가 (12). 다공성 막을 통한 마이그레이션 다음, 세포가 주 화성 제제에 노출 막 측에 부착하고 정확하게 정량화하기 어려울 수 있기 때문에 이러한 기술은 중간 엽 줄기 세포에 대한 부착 성 등 유틸리티를 한정 하였다. 분석은 어떤 입체 이주 패턴을 검사 할 수 있지만, 제한된 세포 유형은 그것을 정확하게 세포 이동 한계는 유틸리티를 정량화 할 수있다 (10). 스크래치 시험 법에 대한 다른 대안은 변형 및 대리 배열에 마이그레이션하는 세포의 능력을 이용하여 3 차원 공간을 통해 세포 운동성을 측정 마이크로 필러 배열을 사용한다. Polydimethlysiloxane (PDMS) 엘라스토머는 정밀 몰드 위에 경화와 오존으로 처리하고 피브로넥틴이 균일 및 비 분해성 미세 환경을 생성한다. 어레이 (4)를 입력하는 세포의 능력을 측정하기 위해 필요에 따라 마이크로 필러 간격 또한 변경 될 수있다. 주형은 높은 종횡비의 어레이 (13)의 음의 버전을 생성하도록 실리콘 웨이퍼의 깊은 반응성 이온 에칭을 통해 생성된다. 그 분석은 커스터마이즈에 의해 강화되지만, 이주 능력 세포 직접적인 시각화를 통해 입체 마이그레이션 및 분석을 모델링하는, 마이크로 필러 어레이를 생성하는데 어려움이 경제적으로 널리 사용을 방해한다. 이 프로토콜에 설명 된 최적화 스크래치 분석은 효율적 COS를 제공자유롭게 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 분석 될 수 일관된 흠집 제조 t 효율적인 방법. 대신 전 세포 이동 후 스크래치 걸쳐 만든 단순한 폭 측정, 소프트웨어는 마이그레이션 전과 후의 총 스크래치 영역을 결정하기 위해 사용자를 가능하게한다. 이 진보가 여기서 폭 측정들이 취해 져야한다 스크래치 판단하려고하는 문제를 제한하고, 스크래치의 폭의 여부의 길이를 따라 균일하다. 또한, 세포 수, 세포 유형과 합류하고 세포에 가해진 손상의 정도는 더욱 신중한 최적화 분석을 최적화하기 위해 논의된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1143">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">DMEM (high glucose, no added glutamine)</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">31053-036</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3091002</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SV3007901</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:527px;">Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3003401</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">TypeLE cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:221px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">12563-01</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">SH3002802</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Falcon standard 60mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">08-772B</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips</td>
			<td style="width:221px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-502</td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Inverted light microscope with camera attachment</td>
			<td style="width:221px;">Variable</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:527px;">ImageJ software&#160;</td>
			<td style="width:221px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:527px;">MRI_Wound_Healting plugin</td>
			<td style="width:221px;"><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:527px;">Statistical analysis software</td>
			<td style="width:221px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:307px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of the wound scratch assay to detect changes in murine mesenchymal stromal cell migration after damage by soluble cigarette smoke extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

여기에 제시된 스크래치 분석은 쥐의 폐 상주 중간 엽 기질 세포를 (LR-중간 엽 줄기 세포)를 사용하여 수행 및 프로토콜 노트에서 참조로 분리되었다. LR-엽 줄기 세포는 60mm 조직 배양 접시에서 500,000 세포의 밀도로 시딩하고, 48 시간에 90 % 합류로 성장시켰다. 손상을 생성하기 위해 4 % CSE는 (상술 한) 초기 시드 기간 다음 24 시간 동안이지만 스크래치 시험 전에 세포와 함께 배양 하였다. 각각의 분...

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Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

상처 스크래치 분석의 최적화 가용성 담배 연기 추출물에 의한 손상 후 쥐 중간 엽 기질 세포 이동의 변화를 감지 할

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.8K 조회수.  College of the Holy Cross. The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Zebrafish의 각막 실질 세포의 Explants는 피부 상처 치유에 집단 셀 마이그레이션 및 재 상피화을 연구하는

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

연구

발생학

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via their strong adherence to tissue culture plastic and then further expanded in vitro, most commonly using fetal bovine serum (FBS). Since FBS can cause MSCs to become immunogenic, its presence in MSC cultures limits both clinical and experimental applications of the cells. Therefore, studies employing chemically defined xeno-free (XF) media for MSC cultures are extremely valuable. Many beneficial effects of MSCs have been attributed to their ability to regulate inflammation and immunity, mainly through secretion of immunomodulatory factors such as tumor necrosis factor-stimulated gene 6 (TSG6) and prostaglandin E2 (PGE2). However, MSCs require activation to produce these factors and since the effect of MSCs is often transient, great interest has emerged to discover ways of pre-activating the cells prior to their use, thus eliminating the lag time for activation in vivo. Here we present protocols to efficiently activate or prime MSCs in three-dimensional (3D) cultures under chemically defined XF conditions and to administer these pre-activated MSCs in vivo. Specifically, we first describe methods to generate spherical MSC micro-tissues or &#39;spheroids&#39; in hanging drops using XF medium and demonstrate how the spheres and conditioned medium (CM) can be harvested for various applications. Second, we describe gene expression screens and in vitro functional assays to rapidly assess the level of MSC activation in spheroids, emphasizing the anti-inflammatory and anti-cancer potential of the cells. Third, we describe a novel method to inject intact MSC spheroids into the mouse peritoneal cavity for in vivo efficacy testing. Overall, the protocols herein overcome major challenges of obtaining pre-activated MSCs under chemically defined XF conditions and provide a flexible system to administer MSC spheroids for therapies.

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

제노없는 조건에서 3-D 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (MSC) 타원체 뇌관

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

96 웰 플레이트에 세포 마이그레이션 / 상처 치유를 수행하기위한 장치

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

연골 세포 분열 분열의 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 5-mC Dot Blot Assay<em&gt; 체외에서</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...