파이로시퀀싱은 미토콘드리아 DNA에서 단일 뉴클레오티드 다형성의 유전자형을 분석하는 데 사용할 수 있는 합성 기술에 의한 시퀀싱입니다. 이 방법은 다른 시퀀싱 방법과 비교할 때 구현이 쉽고 비용 효율성이 유리합니다. 미토콘드리아 DNA에서 병원성 변이체의 이형질 값을 결정하여 특정 미토콘드리아 질환의 진단 방법으로 쉽게 사용할 수 있습니다.
시작하려면 유전자형 분석되는 종에 대한 미토콘드리아 DNA 서열 파일을 얻고 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 SNP의 위치를 식별합니다. 사용된 참조 서열이 SNP의 위치를 쉽게 식별할 수 있도록 연구된 돌연변이에 대해 적절한 염기 번호를 사용하는지 확인합니다. SNP 부위의 상류 및 하류에 1, 000 염기쌍을 복사하고 절단된 서열을 파이로시퀀싱 프라이머 설계 소프트웨어에 붙여넣습니다.
다형성 염기를 강조 표시하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 대상 영역 설정을 선택하여 분석된 SNP 염기를 파이로시퀀싱 분석의 대상으로 설정합니다. 인터페이스의 오른쪽 상단 모서리에 있는 재생 아이콘을 눌러 프라이머 선택을 시작하고 소프트웨어가 프라이머 트리오, 템플릿 DNA의 사전 증폭을 위한 프라이머 2개, 파이로시퀀싱 기계에서 합성하여 시퀀싱을 위한 세 번째 프라이머를 자동으로 생성할 때까지 기다립니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Copy All Primer Sets(모든 프라이머 세트 복사)를 선택하여 모든 프라이머 세트를 유지합니다.
pyrosequencer와 함께 제공된 실행 소프트웨어를 열고 New Assay(새 분석)를 선택한 다음 대립유전자 정량화 분석 템플릿을 선택합니다. 분석하고자 하는 염기서열을 해당 박스에 입력하여 염기서열 분석 프라이머의 바로 하류에 입력한다. 변수 위치의 경우 슬래시로 구분된 두 개의 가능한 밑을 나타냅니다.
Generate Dispensation Order(분배 순서 생성)를 누르고 소프트웨어가 합성 반응에 의한 시퀀싱에서 분배할 뉴클레오티드에 적합한 순서를 자동으로 결정하도록 합니다. 저장하고 분석의 이름을 제공합니다. 다음으로, 분석할 DNA를 마이크로리터당 5나노그램으로 희석하여 실행을 실행합니다.
첫 번째 실행에서는 알려진 이질형질 샘플을 참조 및 야생형 샘플로 포함해야 합니다. 그런 다음 증폭 프라이머 및 파라미터를 사용하여 희석된 DNA 5마이크로리터와 반응물 25마이크로리터의 사전 시퀀싱 PCR을 수행합니다. 파일 설정을 실행하려면 pyrosequencer 소프트웨어에서 New Run(새 실행)을 선택합니다.
파이로시퀀서는 파이로시퀀싱 디스크에서 단일 시퀀싱 웰을 나타내는 빈 사각형으로 48개의 개별 사전 증폭 반응을 동시에 시퀀싱할 수 있습니다. 사각형을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Load Assay(어세이 로드)를 선택하여 어세이를 로드합니다. 필요한 경우 서로 다른 염기서열 분석 프라이머를 사용하여 최대 4개의 개별 분석을 시퀀싱합니다.
프라이머 분배 모드를 자동으로 설정하여 실행에 사용되는 각 시퀀싱 프라이머에 대해 주입 챔버를 자동으로 할당합니다. 하나의 염기서열분석 디스크에서 4가지 다른 유형의 분석을 실행하지 않는 한 실행 모드를 표준으로 설정합니다. 실행 템플릿 파일의 분석 수가 증폭되는 PCR 반응의 수와 일치하는지 확인합니다.
그런 다음 실행 파일을 USB 드라이브에 저장합니다. 파이로시퀀서를 프라이밍하려면 장치의 메인 터치스크린에 있는 청소 버튼을 누르고 화면의 지시에 따라 모든 인젝터를 고순도 물로 청소하십시오. 흡수 스트립을 기계에 삽입할 때 끝이 9시 위치에서 만나는지 확인하십시오.
USB 스틱을 꽂은 후 시퀀스 버튼을 눌러 이전에 준비한 실행 파일을 로드합니다. 장치의 지침에 따라 필요에 따라 시약을 기계의 해당 인젝터에 로드하고 프라이밍합니다. 3 마이크로리터의 비드를 웰에 로드한 다음 각 PCR 반응의 10 마이크로리터를 로드하여 해당 샘플로 시퀀싱합니다.
샘플을 마그네틱 비드와 혼합하기 위해 위아래로 피펫을 사용합니다. 프라이밍된 파이로시퀀서에서 디스크를 기계에 로드할 수 있다는 표시를 찾으십시오. 플레이트 고정 너트의 나사를 풀고 로드된 샘플 플레이트를 디스크 구획의 금속 핀에 맞춥니다.
플레이트가 플레이트 구획에 단단히 고정되면 터치스크린 인터페이스의 시작 버튼을 눌러 시퀀싱 실행을 시작합니다. 실행이 완료되면 컴퓨터에서 USB 드라이브를 제거하고 파이로시퀀서 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 다시 연결합니다. 새로 생성된 실행 파일이 USB 드라이브에 나타나면 실행 결과 파일을 두 번 클릭합니다.
이것은 뉴클레오티드 혼입 시 각 웰의 루시페라아제 출력을 자동으로 분석하고 관심 있는 미토콘드리아 대립유전자를 정량화합니다. 판독 품질에 따라 소프트웨어가 표시하는 색상 점수를 찾습니다. 결과를 저장하려면 위쪽 창에서 보고서를 선택한 다음 전체 보고서를 선택하여 실행의 각 웰에서 파이로그램 및 결과가 포함된 PDF 파일을 생성합니다.
또는 보고서 탭에서 다른 형식으로 결과를 다운로드합니다. 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 m. 3243A>G 돌연변이에 대해 선택된 두 세트의 증폭 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 본 그림에 나타낸 바와 같다.
여기서, Het는 분석할 거의 동질적인 m. 3243A>G 샘플을 나타낸다. 보정을 위해 몰 표준물질을 사용하는 두 프라이머 세트의 성능 비교가 이 그림에 나와 있습니다.
측정값은 수직 점선으로 표시됩니다. X=Y 선형 함수는 테스트된 두 분석 각각이 이상적인 측정에 얼마나 가까운지를 보여주기 위해 표시됩니다. X축에 있는 세포주의 이름은 이 분석을 사용하여 유전자형이 분석된 다양한 사이브리드 클론의 이름입니다.
두 분석을 모두 사용하여 알려지지 않은 m. 3243A>G 이형질의 4개의 사이브리드 클론에 대한 유전형 분석 결과가 여기에 나와 있습니다. 시퀀싱은 기술적 삼중으로 수행되었습니다.
미토콘드리아 징크 핑거 뉴클레아제 처리 세포와 미처리 및 모의 처리 대조군의 유전형 분석 결과, 결과를 생성하는 데 사용된 두 개의 MEF 세포 샘플 PCR 복제물 및 야생형 유전형 분석 대조군의 파이로그램이 여기에 표시됩니다. 파이로시퀀싱은 미토콘드리아 DNA의 다양한 유전자 치료 기술을 평가하기 위한 유전자 치료 실험의 판독값으로 사용할 수 있습니다.
