Orthotopic PD L1 식 공부 Syngeneic 폐 선 암 세포의 이식

마우스 폐 아데노시스종 세포의 직교 이식은 생리적 조건 하에서 완전히 활동적인 면역 계통의 존재하에 종양 발생의 연구를 허용한다. 물론, 종양은 면역 능력 마우스로 발전하고 이것은 면역 결핍 마우스에서 이식을 수행하는 경우 훨씬 더 생리적이다. 이식 전에 종양 세포의 유전자 편집은 이 모형이 종양 성장 및 유전자 발현 단면도에 유전 요인의 충격을 공부하기 위한 직접적이고 시간 절약적인 접근법입니다.

유도성 자가폐 종양 모델과 비교하여, 이 방법은 마우스의 광범위한 사육을 피하고, 따라서 이전 폐암 마우스 모델의 정제를 나타낸다. 절차를 시작하기 전에 가위를 사용하여 카테터 바늘의 끝을 제거하고 카테터를 바늘 끝까지 완전히 밀어 넣습니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 마취, 시너지 8 ~ 12 주 된 마우스의 눈에 연고를 적용하고 봉합사에 수직 가슴과 삽관 플랫폼을 가로 질러 봉합장 위에 상부 절개를 연결합니다.

앞팔사이에 광섬유 케이블을 놓고 가슴을 비추고 불감염된 평평한 집게를 사용하여 조심스럽게 입을 열어 혀를 추출합니다. 후두, 후두, 후두및 아티노이드 연골을 찾기 위해 백색광의 방출을 찾습니다. 기관의 개구부가 명확하게 드러나면 카테터를 기관으로 부드럽게 밀어 넣고 분기를 넘어서는 것이 아니라 폐 내의 폐 선암종 세포의 균등한 분포를 보장합니다.

카테터의 삽입이 매우 부드럽다는 것을 주의하십시오. 저항이 느껴지면 카테터를 제거하고 마우스를 손상시키지 않도록 기관을 다시 노출하십시오. 카테터에서 바늘을 빠르게 제거하고 카테터를 통해 빛나는 백색광을 관찰 할 수 있는지 확인하십시오.

기관 내에 카테터의 적절한 배치를 확인하려면 카테터에 1 밀리리터 주사기를 부착하십시오. 주사기의 물은 호흡과 함께 빠르게 위아래로 움직여야 합니다. 세포 현탁액을 전달하기 전에, 손으로 세포를 따뜻하게하고 카테터에 세포의 50 마이크로 리터를로드합니다.

서스펜션이 흡인되는 즉시, 카테터에 빈 1밀리리터 주사기를 부착하고 300마이크로리터의 공기를 카테터에 분배하여 폐 내종양 세포의 완전한 분포를 보장한다. 그런 다음 카테터를 부드럽게 제거하고 전체 침전이 될 때까지 모니터링하여 열 패드에 마우스를 놓습니다. 적절한 실험 적 종점 후, 70 %에탄올에 시체를 흡수하고 해부 보드에 동물을 고정.

복부 중간 부절을 만들고 피부를 부드럽게 반전하여 흉부 벽 근육과 복부 장기를 노출시십시오. 가위를 사용하여 다이어프램에 구멍을 뚫고 갈비뼈를 자르고 흉부 구멍을 노출시하십시오. 좌심실의 작은 개구부를 자르고 27 게이지 바늘을 사용하여 주입 당 6~8밀리리터의 얼음 차가운 PVS를 우심실을 통해 폐를 세 번 견딜 수 있습니다.

마지막 관류 후, 폐는 혈액의 완전히 명확하고 흰색 나타납니다. 수확 후 가위를 사용하여 폐 조직을 작은 조각으로 다진다. 폐 조각을 37°C에서 30~60분 동안 폐 소화 완충제 1.5밀리리터를 함유한 2밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기십시오.

소화가 끝나면 70미크론 세포 스트레이너를 통해 50 밀리리터 튜브로 세포 현탁액을 옮기고 멸균 10 밀리리터 주사기 플런저의 끝을 사용하여 필터를 통해 남은 조직 조각을 누릅니다. 2%의 FCS를 보완한 15밀리리터의 PVS로 스트레이너를 헹구세요. 그리고 원심분리에 의해 세포를 수집한다.

실온에서 5분 동안 염화칼륨 용해 완충제의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 2%FCS로 보충된 PVS의 1밀리리터에서 백혈구 펠릿을 다시 중단하고 실험 프로토콜에 따른 유동 세포 측정 분석을 위해 세포를 얼룩지게 한다. 예상대로, 수신자 마우스의 생존은 이식된 세포의 수와 상관관계가 있다.

그리고 죽음의 시간에 수확된 폐는 모든 엽 전체에 종양 요절의 균등한 분포를 보여줍니다. 충청 종양을 품고 있는 폐에서 단면을 비교할 때, 정형소이식된 폐 종양 세포를 따르는 종양과, 형태학적 차이는 관찰되지 않습니다. 정형소 종양 세포이식 후 3주 후에 분리된 폐 세포의 PD-L1 발현의 유동 세포 분석은 방금 입증된 바와 같이, PD-L1 세포 표면 마커 발현에서 의상 조절을 드러내며, 체외 배양폐 종양 세포에 비해.

직교 이식에 이어, 면역화학적 분석, mRNA 프로파일링을 포함한 다른 분석 방법을 적용하여 추가적인 실험적 질문을 해결할 수 있다.