저자는 전문적인 기술 지원을 제공한 Katherine Filpo Lopez에게 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH)(GM122589 및 AG051047)의 보조금으로 LP에 지원되었습니다.
이 연구는 컬럼비아 대학의 허버트 어빙 종합 암 센터(Herbert Irving Comprehensive Cancer Center)의 컨포칼 및 특수 현미경 공유 리소스(Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource)를 사용했으며, NIH/NCI 암 센터 지원 보조금 P30CA013696(Cancer Center Support Grant )을 통해 부분적으로 자금을 지원받았습니다.

mtHyper7을 사용한 살아있는 효모 세포의 미토콘드리아 과산화물 이미징

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 프로토콜에서는 살아있는 신진 효모 세포에서 미토콘드리아H2O2를 평가하기 위해 바이오센서로서 mtHyPer7을 사용하는 방법이 설명되어 있습니다. 바이오센서는 CRISPR 기반 방법을 사용하여 구성되며 선택 가능한 마커를 사용하지 않고 효모 게놈의 보존된 유전자가 없는 영역에 도입됩니다. 플라스미드 기반 바이오센서와 비교했을 때, 통합 바이오센서는 모든 세포에서 일관된 수준으로 발현되어 보다 신뢰할 수 있는 정량화 결과를 제공합니다. mtHyPer7 발현 세포를 생성하는 데 선택 가능한 마커가 사용되지 않아 더 넓은 범위의 균주 배경을 사용할 수 있고 바이오센서 발현 세포의 유전자 변형을 용이하게 합니다. mtHyPer7 단백질은 미토콘드리아 형태, 기능, 분포 또는 세포 성장률에 눈에 띄는 영향 없이 미토콘드리아를 정확하게 표적으로 합니다. mtHyPer7은 외부에서 첨가된H2O2에 대한 용량 의존적 반응을 나타낸다. 또한 mtHyPer7은 세포 내 분해능으로 미토콘드리아 품질의 이질성을 보고할 수 있습니다. 마지막으로, 미토콘드리아 표적 바이오센서를 이미징하기 위해 광시야 현미경이 아닌 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하면 형광단에 대한 광표백이 줄어들고 세포 내 차이를 분석하기 위한 고해상도 이미지가 생성됩니다.
한계 및 대안 접근 방식 이 방법은 세포가 커버슬립 아래에서 건조되기 때문에 10분 이상 세포를 이미징하는 데 적합하지 않습니다. 장기간의 이미징을 위해, 한천 패드 방법(46 )을 사용하거나 SC 배지로 채워진 유리-바닥 배양 접시에 세포를 고정시키는 것이 더 낫다.
바이오센서의 선택은 실험 조건 하에서 표적의 농도에 따라 결정되어야 합니다. HyPer7의 감도가 너무 높으면 HyPer3 또는 HyPerRed47,48과 같은 다른 HyPer 버전을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 다른 HyPer 프로브는 pH에 더 민감하다는 점에 유의해야 합니다. 더 높은 감도를 위해서는 퍼옥시레독신 기반 roGFP가 더 적합할 수 있습니다(roGFP2Tsa2ΔCR)27.
H 2 O2센서의 산화 정상 상태는 산화 및 환원 속도 모두와 관련이 있습니다. 바이오센서의 산화율은 주로H2O2에 의해 발생하지만, 환원율은 세포와 세포소기관에서 활성화되는 항산화 환원 시스템에 의존한다. HyPer7은 효모 세포질의 티오레독신 시스템에 의해 주로 감소되는 것으로 나타났으며, 그 환원은 roGFP2Tsa2ΔCR27보다 빠릅니다. 그러므로, 프로브의 상이한 환원 메카니즘 및 반응 동역학은H2O2바이오센서의 측정을 해석할 때 고려되어야 한다. 특히, 바이오센서 판독으로부터H2O2수준을 추론하기 위해서는, 환원 시스템이 실험 동안 일정한 용량을 유지한다고 가정해야 한다. 여기에 설명된 스크립트에 대한 대안으로서, 다양한 다른 소프트웨어가 산화 환원 센서(49)의 분석을 위해 자유롭게 이용가능하게 되었다.
중요 단계 모든 바이오센서의 경우, 바이오센서 자체가 측정 공정에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하는 것이 중요합니다. 따라서 각 실험 조건에서 균주의 성장과 미토콘드리아 형태를 비교하는 것이 중요합니다. 여기에서 미토콘드리아 형태는 막 전위 의존적 방식으로 미토콘드리아를 염색하는 MitoTracker Red를 사용하여 평가됩니다. 그러나 변형되지 않은 세포와 바이오센서로 변형된 세포의 미토콘드리아를 비교하려면 대체 막 전위 감지 미토콘드리아 필수 염료인 테트라메틸로다민 메틸 에스테르(TMRM) 또는 막 전위와 무관하게 미토콘드리아를 염색하는 MitoTracker Green을 사용하여 염색할 수 있습니다. 유해한 영향이 의심되는 경우 표현 수준을 줄이거나 통합 사이트를 변경하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
프로브의 선량-반응 거동과 이미징 기법의 신호 대 노이즈 비율을 검증하는 것도 확실한 결과를 수집하는 데 필수적입니다. 그룹 내의 변동성이 그룹 간의 변동성을 초과하면 차이를 탐지하기가 어려워집니다. 집단 내 변동성은 실제 모집단 변동 또는 검출 과정의 잡음으로 인해 발생할 수 있습니다. 신호:노이즈 비율을 높이는 주요 단계는 이미지 획득(픽셀 값 범위 및 노이즈), 배경 빼기 및 임계값입니다.
계산 단계에서 노이즈 효과를 줄일 수도 있습니다. 가장 간단한 방법은 비율 이미지 측정(Results.csv)에서 가중 평균 강도를 계산하는 것이며, 여기서 각 픽셀은 여기 효율 간의 국소 비율을 나타냅니다. 이렇게 하면 "픽셀 단위" 비율이 생성됩니다. 그러나 영상 신호:잡음 비율이 낮으면 분자 채널과 분모 채널 모두에서 ROI에 대한 가중 평균 강도를 계산한 다음 이 두 가중 평균 간의 비율("지역별" 비율)을 계산하여 보다 강력한 결과를 얻을 수 있습니다.
이진화 방법을 선택하려면 피지 명령 이미지 | 조정 | 자동 임계값 을 사용하여 내장된 모든 피지 방법을 자동으로 시도할 수 있습니다. 세그멘테이션(임계값 설정)을 평가하기 위해 저장된 마스크는 Edit | 선택 | Create Selection을 ROI Manager에 추가하고( T 키를 눌러) Raw 이미지 파일에서 활성화합니다. 미토콘드리아가 적절하게 검출되지 않으면 다른 분할 방법을 시도해야 합니다.
이미지를 비교할 때는 동일한 이미징 조건으로 모든 이미지를 획득하고 동일한 대비 향상으로 모든 이미지를 표시하는 것이 중요합니다.
이미징 조건을 최적화할 때 미토콘드리아 이동을 고려해야 합니다. 미토콘드리아가 405nm와 488nm에서 여기 사이에서 크게 이동하면 비율 이미지가 정확하지 않습니다. 노출 시간을 <500ms로 유지하고 사용 가능한 가장 빠른 방법(예: 트리거 펄스 또는 음향 광학 조정 가능 필터)으로 여기를 변경하는 것이 좋습니다. Z 스택을 캡처할 때 다음 Z 단계로 이동하기 전에 각 Z 단계에 대해 두 가진을 모두 수행해야 합니다.
결과를 표시하기 위해 색조(색상)의 변화는 강도의 변화보다 사람의 눈에 더 분명합니다. 따라서 비율 값은 더 쉽게 시각적으로 해석할 수 있도록 색상 눈금으로 변환됩니다. 컬러화된 이미지는 모든 미토콘드리아 픽셀이 동일한 밝기로 나타나는 비변조 또는 원본 이미지의 픽셀 강도를 사용하여 컬러화된 이미지의 강도를 설정하는 강도 변조될 수 있습니다.
수정 및 문제 해결 파라콰트에 대한 챌린지를 통해 미토콘드리아 기능을 확인하는 대안으로, 세포는 복제 도금되거나 발효성 및 비발효성 탄소원에 접종될 수 있습니다.
배경 빼기의 경우 롤링 볼 빼기( Process | 배경 빼기...) 조명 불균일성을 제거하는 데에도 사용할 수 있습니다. 셀이 있어도 빼는 배경이 변경되지 않는지 확인해야 합니다( 배경 만들기 옵션을 선택하고 결과 검사).
요약하면, mtHyPer7 프로브는 살아있는 세포에서 효모 미토콘드리아의 형태학적 및 기능적 상태를 관련시키기 위한 일관되고 최소 침습적인 방법을 제공하며, 유전적으로 다루기 쉽고 쉽게 접근할 수 있는 모델 시스템에서 중요한 세포 스트레스 요인 및 신호 분자를 연구할 수 있습니다.

미토콘드리아는 산화적 인산화와 전자 수송을 통해 ATP를 생성하는 기능으로 잘 알려진 필수 진핵 세포 소기관이다1. 또한 미토콘드리아는 칼슘 저장, 지질, 아미노산, 지방산 및 철-황 클러스터의 합성, 신호 전달 2,3을 위한 장소입니다. 세포 내에서 미토콘드리아는 세포 유형과 대사 상태에 따라 달라지는 특징적인 형태와 분포를 가진 동적 네트워크를 형성합니다. 또한 미토콘드리아는 융합하고 분열할 수 있지만 세포 내의 모든 미토콘드리아가 동일한 것은 아닙니다. 수많은 연구에서 막 전위 및 산화 상태 4,5,6과 같은 속성에서 개별 세포 내에서 미토콘드리아의 기능적 이질성을 문서화했습니다. 이러한 미토콘드리아 기능의 변화는 부분적으로 mtDNA 돌연변이(핵 DNA보다 더 빠른 비율로 발생)로 인한 세포 소기관의 손상과 세포 기관 내부 및 외부에서 생성된 활성 산소 종(ROS)에 의한 산화 손상에 기인합니다 7,8,9. 세포소기관의 손상은 손상을 복구하거나 수리할 수 없을 정도로 손상된 미토콘드리아를 제거하는 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘에 의해 완화됩니다10.
과산화수소(H2O2)는 세포 단백질, 핵산 및 지질에 대한 산화적 손상의 원인인 활성 산소종입니다. 그러나,H2O2는 표적 단백질(11,12)에서 티올의 가역적 산화를 통해 세포 활동을 조절하는 신호 분자로서도 작용한다. H2 O2 는 미토콘드리아 전자 수송 사슬에서 누출되는 전자와 NADPH 산화 효소 및 모노 아민 산화 효소 13,14,15,16,17,18,19,20과 같은 특정 효소에 의해 생성됩니다. 또한 티오레독신과 글루타티온21,22,23을 기반으로 하는 항산화 시스템에 의해 비활성화됩니다. 따라서 미토콘드리아 H2O2 수준의 분석은 정상적인 미토콘드리아 및 세포 기능과 산화 스트레스 조건에서이 대사 산물의 역할을 이해하는 데 중요합니다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 세포 기관(mtHyPer7)을 표적으로 하는 유전적으로 인코딩된 비율계량 H2O2 바이오센서인 HyPer7을 사용하여 미토콘드리아H2O2를 검출하는 것입니다. mtHyPer7은 녹색 형광 단백질(GFP)의 원형 치환 형태인 ATP9의 미토콘드리아 신호 서열(Su9 전서열)과 Neisseria meningitidis24의 OxyR 단백질의 H 2 O2결합 도메인으로 구성된 키메라입니다(그림 1). 원형으로 치환된 GFP에서는, 본래 GFP의 N- 그리고 C 말단은 융합되고 새로운 말단은 본래 GFP25와 비교된 그것의 괴기한 특성의 단백질 그리고 더 중대한 lability에 단백질에 더 중대한 기동성을 나누어 주는 발색단의 가까이에 형성됩니다. mtHyPer7의 OxyR 도메인과 H2O2의 상호 작용은 친화성이 높고H2O2선택적이며보존된 시스테인 잔기 및 이황화물 브리지 형성의 가역적 산화를 유도합니다. OxyR의 산화와 관련된 구조적 변화는 mtHyPer7에서 원형으로 치환된 GFP로 전달되며, 이는 환원 상태의 405nm에서H2O2-산화 상태(26)의 488nm로 mtHyPer7 발색단의 최대 여기의 스펙트럼 이동을 초래한다. 따라서 488nm 대 405nm에서 여기(excitation)에 대한 반응으로 mtHyPer7로부터의 형광 비율은H2O2에 의한 프로브의 산화를 반영합니다.
이상적으로, 바이오센서는 표적 분자에 대한 실시간, 절대적, 정량적 판독값을 제공해야 합니다. 그러나 불행히도 실제 측정에서 이것이 항상 가능한 것은 아닙니다. mtHyPer7과 같은 산화 센서의 경우 실시간 판독값은 이황화 브리지의 감소 속도에 영향을 받습니다. ROS 바이오센서에 의해 사용되는 환원 시스템은 서로 다르며, 이는 티오레독신 시스템에 의해 환원된 HyPer7과 효모 세포질27의 글루타티온에 의해 환원된 roGFP2-Tsa2ΔCR의 비교에서 볼 수 있듯이 프로브 반응 역학을 극적으로 변화시킬 수 있습니다. 따라서 mtHyPer7 비율로부터 상대적인H2O2농도에 대한 결론을 도출하려면 환원 시스템이 실험 중에 일정한 용량을 유지한다고 가정해야 합니다. 이러한 고려사항에도 불구하고, HyPer7 및 관련 프로브는 살아있는 세포(25,28,29)에서H2O2에 관한 정보를 획득하기 위해 다양한 맥락에서 사용되어 왔다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg"> 그림 1: H 2 O2바이오센서 mtHyPer7의 설계, 분자 메커니즘 및 여기/방출 스펙트럼. (A) mtHyPer7 프로브는 Neisseria meningitidis의 OxyR-RD 도메인에 원형 치환된 GFP를 삽입하여 유도됩니다. 그것은 Neurospora crassa (Su9)의 ATP synthase의 subunit 9에서 미토콘드리아 표적화 서열을 포함합니다. (B) mtHyPer7의H2O2-감지 메커니즘의 그림. RD 영역에서 시스테인이 산화되면 488nm에서 여기(excitation) 시 형광 방출이 증가하고 405nm에서 여기(excitation)에 의해 생성된 방출이 감소합니다. (C) 산화 및 환원 형태의 HyPer7의 여기 및 방출 스펙트럼. 이 그림은 Pak et al.24의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; cpGFP = 원형으로 치환된 GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
mtHyPer7의 이러한 비율계량 이미징은 미토콘드리아H2O2정량 분석에 중요한 이점을 제공합니다24,27; 프로브 집중을 위한 내부 제어를 제공합니다. 또한, H2O2 노광에 의해 생성된 여기 피크의 이동은 H2O2의 포화 농도에서도 완전하지 않다. 따라서 비율 이미징은 분석에 두 개의 스펙트럼 포인트를 통합하여 감도를 높일 수 있습니다.
여기에 사용된 mtHyPer7 프로브는H2O2에 대한 친화도가 매우 높고 pH24에 대한 민감도가 상대적으로 낮으며, 예쁜꼬마선충 미토콘드리아30을 성공적으로 표적으로 삼았습니다. 이 단백질은 효모27,31에도 사용되었습니다. 그러나 이전 연구에서는 mtHyPer7의 플라스미드 매개 발현에 의존했으며, 이로 인해 프로브 발현27에서 세포 간 변동성이 발생했습니다. 또한, 이 프로토콜에 기술된 구조체는 마커가 없는 통합을 위한 CRISPR 기반 접근법을 사용하여 염색체 X32의 보존된 유전자가 없는 영역에 통합되었습니다. 통합된 바이오센서 유전자의 발현은 또한 강력한 구성적 TEF1 프로모터에 의해 조절된다(그림 2). 결과적으로, 플라스미드-매개 바이오센서 발현을 사용하여 관찰된 것과 비교하여 효모 세포 집단에서 바이오센서의 보다 안정적이고 일관된 발현이 존재하며, 바이오센서를 지닌 세포는 선택적 배지를 필요로 하지 않고 증식될 수 있다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg"> 그림 2: CRISPR에 의한 mtHyPer7 발현 세포 생성. Cas9 및 sgRNA 함유 플라스미드(YN2_1_LT58_X2site) 및 PCR 증폭 mtHyPer7 함유 바이오센서 구조체는 리튬 아세테이트 형질전환에 의해 신생 효모 세포에 도입됩니다. 염색체 X(X2)의 유전자 없는 삽입 부위는 sgRNA와 Cas9 단백질에 의해 인식 및 절단되며, 바이오센서는 상동 재조합에 의해 게놈에 통합됩니다. 현미경 스크리닝, 콜로니 PCR 및 시퀀싱에 의해 성공적인 형질전환체를 확인한 후, Cas9 플라스미드는 비선택적 배지에서의 성장에 의해 제거(경화)됩니다. 약어: sgRNA = 단일 가이드 RNA; TEF = 전사 인핸서 인자. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
마지막으로, mtHyPer7은 다른 ROS 바이오센서에 비해 장점이 있습니다. 예를 들어, ROS를 검출하는 데 사용되는 유기 염료(예: 디하이드로에티듐[DHE]2 및 MitoSOX3)는 불균일하거나 비특이적인 염색을 생성할 수 있으며 종종 에탄올 또는 디메틸 설폭사이드와 같은 용매로 전달되므로 용매 효과에 대한 추가 제어가 필요합니다. ROS 바이오센서의 또 다른 부류는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 바이오센서(예를 들어, 세포 산화 환원 상태4에 대한 산화 환원 플루오르, 및 과산화물 센서 HSP-FRET5, OxyFRET 6 및 PerFRET6)이다. 이 프로브는 유전적으로 암호화되고 원칙적으로 매우 민감하며 잘 특성화된 미토콘드리아 신호 서열을 사용하여 미토콘드리아를 정량적으로 표적화할 수 있습니다. 그러나 교차 여기(cross-excitation) 및 블리드 스루(bleed-through)로 인한 배경과 FRET가 발생하기 위한 형광단의 근접성 및 방향에 대한 엄격한 요구 사항을 포함하여 FRET 기반 프로브를 사용하는 데 어려움이 있습니다33,34. 또한 FRET 프로브는 스펙트럼 이동 프로브에 비해 관심 세포에서 발현하기 위해 더 큰 구조가 필요한 두 개의 형광 단백질로 구성됩니다. 여기에 설명된 프로토콜은 HyPer7 기반 바이오센서의 강점을 활용하고, 살아있는 효모의 미토콘드리아에서 과산화물의 정량적 이미징을 위해 이 컴팩트하고 비율계량적이며 친화성이 높은 유전자 인코딩 프로브를 사용하기 위해 개발되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0145170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0118170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0127179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicilin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carl Zeiss Immersol Immersion Oil</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. cloni 10G chemical competent cell</td>
			<td>Bioserch Technologies</td>
			<td>60108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Schindelin et al 2012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 (Geneticin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP emission filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td>525/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2 (stable)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO</td>
			<td>Pon Lab</td>
			<td>JYE057/EP41</td>
			<td>Liao et al 20201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi PCR kit</td>
			<td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td>
			<td>KK1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A8094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>405 and 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#H5659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P5482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mHyPer7 plasmid</td>
			<td>This study</td>
			<td>JYE116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslips</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3406</td>
			<td>#1.5 (170 &#181;m thickness)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Red CM-H2Xros</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>M7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat. #856177&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>Posit.co</td>
			<td>Free desktop version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>BU530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#U1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>#DF0919073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YN2_1_LT58_X2site</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>177705</td>
			<td>Pianale et al 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging of mthyper7, a ratiometric biosensor for mitochondrial peroxide, in living yeast cells

미토콘드리아 기능 장애 또는 기능 변화는 신경 퇴행성 및 근골격계 질환, 암 및 정상적인 노화를 포함한 많은 질병과 상태에서 발견됩니다. 여기에서, 유전적으로 인코딩된, 최소 침습적, 비율계량 바이오센서를 사용하여 세포 및 세포 내 해상도에서 살아있는 효모 세포의 미토콘드리아 기능을 평가하는 접근법을 설명합니다. 바이오센서인 미토콘드리아 표적 HyPer7(mtHyPer7)은 미토콘드리아에서 과산화수소(H2O2)를 검출합니다. 이는 원형으로 치환된 형광 단백질에 융합된 미토콘드리아 신호 서열과 박테리아 OxyR 단백질의H2O2-반응 도메인으로 구성됩니다. 바이오센서는 플라스미드 기반 구조에 비해 더 일관된 발현을 위해 CRISPR-Cas9 마커가 없는 시스템을 사용하여 생성되고 효모 게놈에 통합됩니다.
mtHyPer7은 미토콘드리아를 정량적으로 표적으로 하고, 효모 성장률이나 미토콘드리아 형태에 검출할 수 있는 영향을 미치지 않으며, 정상적인 성장 조건 및 산화 스트레스에 노출될 때 미토콘드리아H 2 O2에 대한 정량적 판독값을 제공합니다. 이 프로토콜은 스피닝 디스크 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 이미징 조건을 최적화하고 무료로 제공되는 소프트웨어를 사용하여 정량 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 이러한 도구를 사용하면 세포 내 및 집단 내 세포 간 모두에서 미토콘드리아에 대한 풍부한 시공간 정보를 수집할 수 있습니다. 또한, 여기에 설명된 워크플로우는 다른 바이오센서를 검증하는 데 사용할 수 있습니다.

Mitochondria are essential eukaryotic cellular organelles that are well known for their function in producing ATP through oxidative phosphorylation and electron transport1. In addition, mitochondria are sites for calcium storage, the synthesis of lipids, amino acids, fatty acid and iron-sulfur clusters, and signal transduction2,3. Within cells, mitochondria form a dynamic network with characteristic morphology and distribution, which varies according to cell type and metabolic state. Furthermore, although mitochondria can fuse and divide, not all the mitochondria in a cell are equivalent. Numerous studies have documented the functional heterogeneity of mitochondria within individual cells in attributes such as membrane potential and oxidative state4,5,6. This variation in mitochondrial function is due in part to damage to the organelle from mtDNA mutations (which occur at a higher rate than in nuclear DNA) and to oxidative damage by reactive oxygen species (ROS) generated both within and outside the organelle7,8,9. Damage to the organelle is mitigated by mitochondrial quality control mechanisms that repair the damage or eliminate mitochondria that are damaged beyond repair10.
Hydrogen peroxide (H2O2) is a reactive oxygen species that is a source of oxidative damage to cellular proteins, nucleic acids, and lipids. However, H2O2 also serves as a signaling molecule that regulates cellular activities through the reversible oxidation of thiols in target proteins11,12. H2O2 is produced from electrons that leak from the mitochondrial electron transport chain and by specific enzymes, such as NADPH oxidase and monoamine oxidases13,14,15,16,17,18,19,20. It is also inactivated by antioxidant systems, including those based on thioredoxin and glutathione21,22,23. Thus, analysis of mitochondrial H2O2 levels is critical for understanding the role of this metabolite in normal mitochondrial and cellular function and under conditions of oxidative stress.
The overall goal of this protocol is to detect mitochondrial H2O2 using a genetically encoded ratiometric H2O2 biosensor, HyPer7, that is targeted to the organelle (mtHyPer7). mtHyPer7 is a chimera consisting of the mitochondrial signal sequence from ATP9 (the Su9 presequence), a circularly permuted form of green fluorescent protein (GFP), and the H2O2-binding domain of the OxyR protein from Neisseria meningitidis24 (Figure 1). In circularly permuted GFP, the N- and C-termini of native GFP are fused and new termini are formed near the chromophore, which impart greater mobility to the protein and greater lability of its spectral characteristics compared to native GFP25. The interaction of mtHyPer7&#39;s OxyR domain with H2O2 is high-affinity, H2O2-selective, and leads to reversible oxidation of the conserved cysteine residues and disulfide bridge formation. Conformational changes associated with the oxidation of OxyR are transferred to the circularly permuted GFP in mtHyPer7, which results in a spectral shift in the excitation maximum of the mtHyPer7 chromophore from 405 nm in the reduced state to&#160;488 nm in the H2O2-oxidized state26. Thus, the ratio of fluorescence from mtHyPer7 in response to excitation at 488 nm versus 405 nm reflects the oxidation of the probe by H2O2.
Ideally, a biosensor should provide a real-time, absolute, quantitative readout of its target molecule. Unfortunately, however, this is not always possible in real-world measurements. In the case of oxidation sensors, such as mtHyPer7, the real-time readout is affected by the rate of reduction of the disulfide bridge. The reduction systems used by ROS biosensors differ, and these can dramatically alter probe response dynamics-as shown by the comparison of HyPer7, reduced by the thioredoxin system, and roGFP2-Tsa2&#916;CR, reduced by glutathione-in yeast cytosol27. Thus, to draw a conclusion about the relative H2O2 concentration from mtHyPer7 ratios, one must assume that the reduction system maintains a constant capacity during the experiment. Notwithstanding these considerations, HyPer7 and related probes have been used in various contexts to obtain information about H2O2 in living cells25,28,29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg" /> 
Figure 1: Design, molecular mechanism, and excitation/emission spectra of the H2O2 biosensor mtHyPer7. (A) The mtHyPer7 probe is derived by inserting circularly permuted GFP into the OxyR-RD domain from Neisseria meningitidis. It contains the mitochondrial targeting sequence from subunit 9 of the ATP synthase from Neurospora crassa (Su9). (B) Illustration of the H2O2-sensing mechanism of mtHyPer7. Oxidation of cysteines in the RD domain increases fluorescence emission upon excitation at 488 nm and decreases emission produced by excitation at 405 nm. (C) Excitation and emission spectra of HyPer7 in oxidized and reduced forms. This figure is reprinted with permission from Pak et al.24. Abbreviations: GFP = green fluorescent protein; cpGFP = circularly permuted GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
This ratiometric imaging of mtHyPer7 offers important benefits for mitochondrial H2O2 quantitation24,27; it provides an internal control for probe concentration. In addition, the shift in excitation peak produced by H2O2 exposure is not complete, even in saturating concentrations of H2O2. Thus, ratio imaging can increase the sensitivity by incorporating two spectral points in the analysis.
The mtHyPer7 probe used here has a very high affinity for H2O2 and relatively low sensitivity to pH24, and has been successfully targeted to Caenorhabditis elegans mitochondria30. This protein has also been used in yeast27,31. However, previous studies relied on plasmid-borne expression of mtHyPer7, which results in cell-to-cell variability in probe expression27. In addition, the construct described in this protocol was integrated into a conserved, gene-free region on chromosome X32 using a CRISPR-based approach for marker-free integration. Expression of the integrated biosensor gene is also controlled by the strong constitutive TEF1 promoter (Figure 2). As a result, there is more stable, consistent expression of the biosensor in yeast cell populations compared to that observed using plasmid-borne biosensor expression, and cells bearing the biosensor can be propagated without the need for selective media.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg" /> 
Figure 2: Generation of mtHyPer7-expressing cells by CRISPR. The Cas9 and sgRNA-containing plasmid (YN2_1_LT58_X2site) and PCR-amplified mtHyPer7-containing biosensor construct are introduced into budding yeast cells by lithium acetate transformation. The gene-free insertion site on chromosome X (X2) is recognized and cut by Cas9 protein with the sgRNA, and the biosensor is integrated into the genome by homologous recombination. After identification of the successful transformants by microscopic screening, colony PCR, and sequencing, the Cas9 plasmid is removed (cured) by growth in non-selective media. Abbreviations: sgRNA = single guide RNA; TEF = transcription enhancer factor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Finally, mtHyPer7 offers advantages over other ROS biosensors. For example, organic dyes used to detect ROS (e.g., dihydroethidium [DHE]2 and MitoSOX3) can produce uneven or nonspecific staining and are often delivered in solvents such as ethanol or dimethyl sulfoxide, which require additional controls for solvent effects. Another class of ROS biosensors are fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors (e.g., Redoxfluor for cellular redox state4, and the peroxide sensors HSP-FRET5, OxyFRET6, and PerFRET6). These probes are genetically encoded and highly sensitive in principle and can be quantitatively targeted to mitochondria using well-characterized mitochondrial signal sequences. However, there are challenges in the use of FRET-based probes, including background due to cross-excitation and bleed-through, and stringent requirements for the proximity and orientation of the fluorophores for FRET to occur33,34. In addition, FRET probes consist of two fluorescent proteins that require larger constructs for expression in cells of interest compared to spectra-shifting probes. The protocol described here was developed to take advantage of the strengths of the HyPer7-based biosensor, and to use this compact, ratiometric, high-affinity, genetically encoded probe for quantitative imaging of peroxide in mitochondria in living yeast.

저자 스포트라이트: 미토콘드리아 연구의 발전 - 세포 내 분석을 위한 mtHyper7 바이오센서 

살아있는 효모 세포에서 미토콘드리아 과산화물을 위한 비율계량 바이오센서인 mtHyPer7의 이미징

Mitochondria are organelles within cells that facilitate energy mobilization, central metabolism, production of vital macromolecules, calcium storage, and signal transduction. As a result, they play a crucial role in cellular function, fitness, and lifespan control. Our research focuses on investigating the impact of mitochondria on aging using the budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model organism.Live cell imaging is our best tool to observe variation in mitochondrial function. Here we describe a method that utilizes a genetically encoded ratio metric spectral shifting biosensor called mitochondrial HyPer7. mtHyPer7 detects hydrogen peroxide, a reactive oxygen species, that can damage cellular constituents, but also functions as a signaling molecule in mitochondria of live cells.mtHyPer7 has a high affinity for hydrogen peroxide and low sensitivity to pH. It is integrated into the yeast genome, which results in stable and consistent expression in yeast cell populations. Finally, it is quantitatively targeted to mitochondria and has no detectable effect on cellular or mitochondrial function or fitness.Biosensors like mtHyPer7 are critical for studying mitochondrial function at subcellular resolution, for finding mechanisms underlying mitochondrial quality control, and for examining how that process affects cell fitness, feed, and lifespan. The mtHyPer7 stain provides consistent laboring in contrast to organic dyes utilized for reactive oxygen species detection. Compared to FRET-based sensors, mtHyPer7 is more compact and avoids issues such as cross-excitation and bleed through, as well as the precise positioning and the orientation requirements for FRET.

mtHyPer7이 미토콘드리아H2O2를 평가하기에 적합한 프로브임을 확인하기 위해 mtHyPer7의 국소화와 효모 미토콘드리아 및 세포 건강에 미치는 영향을 평가했습니다. mtHyPer7의 표적화를 평가하기 위해 미토콘드리아를 mtHyPer7을 발현하는 대조군 효모 세포와 효모에서 중요한 미토콘드리아 특이적 염료인 MitoTracker Red로 염색했습니다. MitoTracker Red 염색을 사용하여 미토콘드리아는 모-새싹 축을 따라 정렬되고 새싹 끝과 새싹 원위부에 있는 모세포 끝단에 축적된 긴 관형 구조로 분해되었습니다(41). 미토콘드리아 형태는 대조군과 mtHyPer7 발현 세포에서 유사했습니다. 또한 mtHyPer7은 MitoTracker Red-stained 미토콘드리아와 함께 국소화되었습니다(그림 3A). 따라서 mtHyPer7은 정상적인 미토콘드리아 형태나 분포에 영향을 미치지 않고 미토콘드리아를 효율적이고 정량적으로 표적으로 삼았습니다.
다음으로, 미토콘드리아의 세포 적합성 및 산화 스트레스에 대한 민감도에 대한 mtHyPer7의 효과를 평가하기 위해 추가 검증 실험을 수행했습니다. 농축 또는 합성 포도당 기반 배지(각각 YPD 또는 SC)에서 mtHyPer7 발현 세포의 성장률은 형질전환되지 않은 야생형 세포의 성장률과 유사합니다(그림 3B,D). 미토콘드리아의 산화 스트레스에 대한 가능한 영향을 평가하기 위해 대조군 및 mtHyPer7 발현 효모를 미토콘드리아에 축적되어 세포 소기관24,27에서 과산화물 수준을 높이는 산화 환원 활성 소분자인 낮은 수준의 파라콰트로 처리했습니다. mtHyPer7 발현이 미토콘드리아의 산화 스트레스를 유도하거나 산화 스트레스로부터 미토콘드리아를 보호하는 경우, mtHyPer7 발현 세포는 파라콰트 처리에 대한 민감도가 각각 증가하거나 감소해야 합니다. 낮은 수준의 파라콰트를 사용한 처리는 효모 성장률의 감소를 초래했습니다. 더욱이, 파라콰트의 존재 하에서 야생형 및 mtHyPer7 발현 세포의 성장률은 유사하였다(그림 3C,E). 그러므로, 바이오센서의 발현은 발아 효모 세포에서 현저한 세포 스트레스를 생성하거나 미토콘드리아 산화 스트레스에 대한 효모의 민감성을 변화시키지 않았다.
mtHyPer7이 신진 효모에서 미토콘드리아 H 2 O 2 를 연구하는 데 적합하다는 증거를 감안할 때, mtHyPer7이 중간 로그 단계 야생형 효모에서 미토콘드리아 H 2 O 2 와 외부에서 첨가 된 H 2 O2에 의해 유도 된 미토콘드리아 H 2 O 2의 변화를 검출 할 수 있는지 여부를 테스트했습니다. H2O2적정 실험을 수행하고, 미토콘드리아에서 평균 산화:환원(O/R) mtHyPer7 비율을 측정하였다.
자동화된 분석 스크립트는 여러 출력 파일을 생성했습니다.
비율 이미지(ratio.tif): 배경 보정되고 임계값이 있는 488nm 및 405nm 스택의 비율로 구성된 Z 스택입니다. 이 스택은 추가 처리 없이 피지에서 볼 수 있습니다. 그러나 보기 전에 프로토콜 단계 4.3 또는 5.6에 설명된 대로 대비를 높이거나 이미지를 채색하는 것이 좋습니다.
마스크 이미지(mask.tif): 분석에 사용되는 임계값 미토콘드리아 영역으로 구성된 Z 스택입니다. 이 이미지는 임계값의 정확도를 평가하는 데 사용해야 합니다.
분석에 사용되는 ROI(ROIs.zip): 이 파일을 피지에서 열면 원본 이미지와 함께 ROI가 이미지에 겹쳐져 결과 테이블과 원본 이미지를 상호 참조합니다. 각 ROI는 셀 번호와 ROI 번호로 이름이 바뀝니다.
분자, 분모 및 비율 이미지의 각 슬라이스에 대한 임계값 미토콘드리아의 면적, 평균 및 통합 밀도를 포함하는 측정 테이블(NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv). 미토콘드리아가 없거나 초점이 맞지 않는 절편에서는 NaN이 기록됩니다.
배경 및 노이즈 보정, 임계값 설정 및 비율 계산에 사용되는 옵션을 문서화하는 로그 파일(Log.txt)입니다.
mtHyPer7의 O/R 비율은 외부에서 첨가된1-2mM에서 정체기에 도달한H2O2농도에 대한 용량 의존적 반응을 나타냈다(도 7). 놀랍게도, HyPer7 비율은 대조군보다 0.1mMH2O2에 노출된 세포에서 더 낮았지만, 이 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 이 현상에 대한 한 가지 설명은 낮은 수준의 스트레스 요인에 대한 노출이 항산화 메커니즘과 같은 스트레스 반응을 유도할 수 있는 호르메시스 반응일 수 있으며, 이는 차례로 프로브에 의해 검출될 수 있는 ROS의 양을 낮춥니다. 반대로 스트레스 요인 수준이 높을수록 내부 스트레스 반응을 압도하여 HyPer7의 판독값이 높아질 수 있습니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig07.jpg"> 그림 7 : 외부에서 첨가 된 H 2 O 2에 대한 mtHyPer7의 반응. (A) 405 nm 및 488 nm 여기 이미지의 최대 투영 및 H 2 O 2 농도의 중간 로그 상 셀에서 mtHyPer7의 비율 계량 이미지의 평균 강도 투영. 의사 색상은 산화:감소된 mtHyPer7 비율(하단의 배율)을 나타냅니다. 눈금 막대 = 1μm. 셀 윤곽선은 흰색으로 표시됩니다. n > 조건당 100개 셀. (B) 다른 농도의 H 2 O2 로 처리 된 신진 효모 세포에서 mtHyPer7 산화 : 감소 된 비율의 정량화. 5개의 독립적인 시행의 평균이 표시되며, 각 시행마다 모양과 색상이 다른 기호가 표시됩니다. 산화 : 환원 된 mtHyPer7 비율의 평균 ± SEM : 1.794 ± 0.07627 (처리 없음), 1.357 ± 0.03295 (0.1 mM), 2.571 ± 0.3186 (0.5 mM), 6.693 ± 0.5194 (1 mM), 7.017 ± 0.1197 (2 mM). p < 0.0001(Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석). p 값은 ****p < 0.0001로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
마지막으로, 이전 연구에서는 더 환원되고 과산화물을 덜 함유하는 더 적합한 미토콘드리아가 효모 딸 세포(yeast daughter cell)4에 의해 우선적으로 유전되고, 세포질 카탈라아제(cytosolic catalase)가 효모 딸 세포(yeast daughter cell)로 운반되어 활성화된다는 것을 밝혔다(42,43,44,45). 이 연구는 효모 세포 분열 중 미토콘드리아의 비대칭 유전과 딸 세포 적합성 및 수명, 모녀 연령 비대칭에서 이 과정의 역할을 문서화합니다. H2O2의 차이가모체와 새싹 사이에 존재하는지 여부를 테스트하기 위해, mtHyPer7을 새싹과 모세포에서 측정하였다. 효모 세포 내에서 미토콘드리아H 2 O 2 의 차이가 관찰되었으며, H 2 O 2 바이오 센서 판독 값의 미묘하지만 통계적으로 유의한감소가 모세포의 미토콘드리아와 비교하여 새싹의 미토콘드리아에서 감지되었습니다 (그림 8). 이러한 발견은 새싹의 미토콘드리아가 산화 스트레스로부터 더 잘 보호된다는 이전 발견과 일치합니다. 또한 mtHyPer7이 신진 효모의 세포 및 세포 내 분해능으로 미토콘드리아 H 2O2에 대한 정량적 판독 값을 제공 할 수 있다는 문서를 제공합니다.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig08.jpg"> 그림 8: 미토콘드리아 H2 O2 수준은 딸 세포에서 더 낮습니다. (A) 대표 셀에서 mtHyPer7의 비율계량 이미지의 최대 투영. 의사 색상은 산화:감소된 mtHyPer7 비율(하단의 배율)을 나타냅니다. 비율의 세포 내 차이가 분명합니다 (화살촉). 눈금 막대 = 1μm. 셀 윤곽선: 흰색. (B) 새싹과 모세포의 mtHyPer7 비율의 차이. 각 개별 셀에 대해 새싹 비율 값에서 어머니 비율 값을 빼고 점으로 표시했습니다. n = 5개의 독립적인 실험에서 풀링된 193개의 세포, 각 실험에 대해 서로 다른 색상의 기호로 표시됨. 새싹과 모세포의 mtHyPer7 비율 차이에 대한 평균 ± SEM: -0.04297 ± 0.01266. p = 0.0008(쌍체 t-검정) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충표 S1: 본 연구에서 사용된 균주. 사용 된 효모 균주 목록. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%201%20Strains%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충표 S2: 본 연구에 사용된 플라스미드. 사용된 플라스미드 목록. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/Supplemental%20Table%202%20Plasmids%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충표 S3: 본 연구에 사용된 프라이머. 사용된 프라이머 목록. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%203%20Primers%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 바이오센서 플라스미드 구축을 위한 프로토콜. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Yang%20et%20al%20Supp%20Protocol%202023.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: 자동화된 분석을 위한 스크립트. 각 스크립트에 대해 샘플 입력 파일 및 출력 파일이 제공됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/biosensor-supplemental-coding-files.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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과산화수소 (H 2 O2)는 산화 손상의 원인이자 신호 분자입니다. 이 프로토콜은 살아있는 효모에서 유전적으로 인코딩된 비율계량 바이오센서인 미토콘드리아 표적 HyPer7(mtHyPer7)을 사용하여 미토콘드리아H2O2를 측정하는 방법을 설명합니다. 무료로 제공되는 소프트웨어를 사용하여 이미징 조건을 최적화하고 정량적 세포 및 세포 내 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

미토콘드리아는 에너지 동원, 중추 대사, 중요한 거대분자 생산, 칼슘 저장 및 신호 전달을 촉진하는 세포 내 세포 기관입니다. 결과적으로 세포 기능, 체력 및 수명 조절에 중요한 역할을 합니다. 우리의 연구는 신생 효모인 맥주효모균 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 모델 유기체로 사용하여 미토콘드리아가 노화에 미치는 영향을 조사하는 데 중점을 둡니다.살아있는 세포 이미징은 미토콘드리아 기능의 변화를 관찰할 수 있는 최고의 도구입니다. 여기서는 미토콘드리아 HyPer7이라고 하는 유전적으로 인코딩된 비율 메트릭 스펙트럼 이동 바이오센서를 활용하는 방법을 설명합니다. mtHyPer7은 세포 구성 요소를 손상시킬 수 있는 활성 산소종인 과산화수소를 검출하지만 살아있는 세포의 미토콘드리아에서 신호 분자로도 기능합니다.mtHyPer7은 과산화수소에 대한 친화력이 높고 pH에 대한 민감도가 낮습니다. 효모 게놈에 통합되어 효모 세포 집단에서 안정적이고 일관된 발현을 초래합니다. 마지막으로, 미토콘드리아를 정량적으로 표적으로 하며 세포 또는 미토콘드리아 기능이나 체력에 감지할 수 있는 영향을 미치지 않습니다.mtHyPer7과 같은 바이오센서는 세포 내 해상도에서 미토콘드리아 기능을 연구하고, 미토콘드리아 품질 관리의 기초가 되는 메커니즘을 찾고, 해당 과정이 세포 적합성, 사료 및 수명에 미치는 영향을 조사하는 데 매우 중요합니다. mtHyPer7 염색제는 활성산소종 검출에 사용되는 유기 염료와 달리 일관된 노동력을 제공합니다. FRET 기반 센서에 비해 mtHyPer7은 더 컴팩트하며 교차 여기 및 블리드 스루와 같은 문제는 물론 FRET의 정확한 위치 지정 및 방향 요구 사항을 방지합니다.

imaging-mthyper7-ratiometric-biosensor-for-mitochondrial-peroxide

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

1.4K 조회수.  Columbia University Irving Medical Center. 미토콘드리아는 에너지 동원, 중추 대사, 중요한 거대분자 생산, 칼슘 저장 및 신호 전달을 촉진하는 세포 내 세포 기관입니다. 결과적으로 세포 기능, 체력 및 수명 조절에 중요한 역할을 합니다. 우리의 연구는 신생 효모인 맥주효모균 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 모델 유기체로 사용하여 미토콘드리아가 노화에 미치는 영향을 조사하는 데 중점을 둡니다.살아있?...

비디오: 저자 스포트라이트: 미토콘드리아 연구의 발전 - 세포 내 분석을 위한 mtHyper7 바이오센서 

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

연구

생물학

Preparation of Yeast Cells for Imaging, Optimization of Imaging Conditions, and Image Collection

To begin, take one milliliter of a mid-log phase budding yeast cell culture, expressing mitochondria-targeted HyPer7. Centrifuge the cells at 6, 000 G for 30 seconds, and remove the supernatant, leaving 10 to 20 microliters in the tube. Re-suspend the cell pellet by gently mixing it with residual media using a micro-pipette.Next, use an air blower or lint-free tissue to clean a glass microscope slide, and add 1.8 microliters of the cell suspension to the slide. Finally, cover the cells with number 1.5 glass cover slip by lowering it slowly at an angle to avoid introducing bubbles. Then place the slide on the microscope stage.To image the cells, set up the acquisition conditions to ensure a detectable signal and acceptable resolution in each fluorescence channel. For example, on a spinning disc confocal microscope with an sCMOS camera use 2x2 binning, 20 to 40%laser power, and 200 to 600 milliseconds exposure. Next, examine the image histogram.In a 12-bit image ensure the total dynamic range of the pixel values is at least several hundred gray levels without saturation. Additionally, ensure the range is one order of magnitude higher than the noise level. To calculate the noise level, measure the standard deviation of pixel values in a cell-free area of an image.Then collect time-lapse images with no delay between acquisitions to evaluate the effects of the imaging conditions on signal stability and oxidative stress in mitochondria. Using the microscope acquisition software or ImageJ, measure the average pixel value in each fluorescence channel to ensure signal stability. If the experiment does not involve time-lapse imaging, ensure that the fluorescence is stable over two or three repeated Z-stacks.Acquire images with a Z interval of 0.5 micrometers in a total stack depth of six micrometers for budding yeast. If collecting Z-stacks ensure that the Z interval is the same for all images in the dataset and include the entire cell. Also acquire transmitted light images to document cell boundaries.

이미징을 위한 효모 세포 준비, 이미징 조건 최적화 및 이미지 수집

Semiautomated Analysis of mtHyPer7 in Yeast Cells with Scripts 

To begin, open a multichannel Z stack image in Fiji, and open the desired biosensor analysis script file. Click Run in the script editor window to run the script. Then enter the requested information in the dialogue window that appears.Select the channel numbers of the numerator and denominator for ratio calculation. For mitochondria targeted HyPer7, the numerator is the channel excited at 488 nanometers and the denominator is the channel excited at 405 nanometers. Select the channel number of the transmitted light image if present, or zero if there is none.Then choose the desired background subtraction method. If the background is uniform, click select an image area to measure the background level in the image. Afterward, choose the desired noise subtraction method to reduce random variation in the detector readout.Click Select an image area. Select the fixed value option to enter a previously measured noise level, which usually works well if the imaging conditions are kept constant. For accurate and consistent detection of mitochondria, select a thresholding algorithm such as Otsu or Maximum Entropy.Use the same algorithm for all images in an experiment, but ensure that mitochondria are accurately recognized. Then select the number of regions of interest per cell. For example, if measuring mother bud differences, select two.Select the output folder where measurements and ratio images will be saved. For background or noise correction, choose Select an image area. Follow the prompts to draw a background area using the rectangle ROI tool and click Okay.While analyzing individual cells or subcellular regions, draw regions of interest based on the brightfield image. The ROI does not need to precisely match the cell outline as only thresholded mitochondria within the ROI will be measured. After creating each ROI, press T to add the selected ROI to the ROI Manager.Check Show All in the ROI Manager to document the marked cells. Each added region will appear as a numbered item in the ROI Manager list. If analyzing more than one ROI per cell, mark the ROIs in the same order for each analyzed cell.After all the desired ROIs have been added to the ROI manager, click Okay in the Mark Cells dialogue window. Next, select the measurement table format. In the Multi Measure dialogue window, check measure-all-slices and one-row-per-slice options to produce a table with a desired format.Use the process multi ROI tables. rscript to process the tables created with the one-row-per-slice option. Do not check the append-results option.Save the output files to the selected folder using the script. Now open the ratio Z stack image in Fiji to generate a colorized ratio image. Then open the colorize_ratio_image.ijm script file and click Run in the script editor window. A dialogue window prompting to enter the requested information will appear. In the unmodulated option, all mitochondrial pixels appear at the same brightness.Some images may appear noisy as dim and bright pixels contribute to the ratio image. Use the intensity modulated option to reduce the noise. In the minimum and maximum displayed values method, choose values near the average minimum and maximum values observed in an experiment.To ensure consistency, acquire all images using the same imaging conditions and display all images using the same minimum and maximum values. Then select the projection mode to project the Z stack and show the entire mitochondrial population before colorization. For a maximum intensity projection, select maximum.To create an average intensity projection, select average. Finally, select the folder to save the colorized images. If the unmodulated option is selected, choose a color scheme in the dialogue window that appears.Utilize the fire or rainbow RGB lookup tables built into Fiji or any desired lookup table in ImageJ's LUT format. Use the script to save the output files to the selected folder. The oxidized reduced ratio of mitochondria tagged HyPer7 showed a dose dependent response to hydrogen peroxide concentration, which reached a plateau at one to two millimolar externally added hydrogen peroxide.Differences in mitochondrial hydrogen peroxide were observed within the yeast cells. A statistically significant decrease in hydrogen peroxide biosensor readout was detected in mitochondria in the bud compared to the mother cell.