이 방법은 조사관이 여성 생식 기관에 살고 감염을 일으키는 혐기성 박테리아의 생물학 및 병태 생리학을 연구하는 데 도움이 될 것입니다. 쥐 질 접종의 이전 모델은 호기성 조건에서 성장하고 회복된 박테리아에 초점을 맞추었습니다. 우리의 방법은 산소 노출을 최소화하기 위한 추가 전략이 필요한 절대 혐기성 박테리아의 접종 및 회수에 대해 지시합니다.
얼마나 까다로운지에 따라이 모델에 사용 된 새로운 박테리아 균주는 특정 단계를 변경해야 할 수 있습니다. 우리는 원고의 표 1에서 잠재적 수정에 대한 제안을 제공했습니다. 우선, 혐기성 챔버에서 800 마이크로 리터의 신선한 배지가있는 1.5 밀리리터 큐벳에 16 시간 된 박테리아 배양 물 200 마이크로 리터를 추가하십시오.
그런 다음 분광 광도계에서 600 나노 미터에서 희석 된 배양의 광학 밀도 또는 OD를 블랭크로 배지 만있는 별도의 큐벳을 사용하여 측정했습니다. 배양의 실제 OD 값을 얻으려면 분광 광도계 판독값에 5를 곱한 다음 실험에 필요한 접종량의 부피를 결정하고 필요한 접종 밀도를 달성하는 데 필요한 박테리아 배양의 부피를 계산합니다. 다음으로, 필요한 양의 박테리아 배양물을 멸균 된 마이크로 원심 분리 튜브에 피펫팅하고 16, 000 회 G에서 1 내지 3 분 동안 원심 분리한다.
상청액을 제거한 후, 펠릿을 혐기성 PBS에 재현탁시켜 이전에 계산된 필요한 접종량을 달성한다. 준비된 접종물에서 박테리아 콜로니 형성 단위의 수를 결정하려면 먼저 10마이크로리터의 박테리아 현탁액을 사용하여 PBS에서 여러 연속 희석을 만들고 다중 채널 피펫을 사용하여 한천 플레이트에서 플레이트 접종 희석을 스팟합니다. 동시에 70마이크로리터의 멸균 혐기성 PBS를 마우스 번호가 표시된 1.5밀리리터 마이크로원심분리기 튜브에 피펫팅하여 혐기성 챔버에서 질 세척 튜브를 준비합니다.
튜브를 단단히 닫고 챔버 밖으로 꺼냅니다. 질 세척을 수행하려면 먼저 앞발로 잡을 수있는 케이지 위에 마우스를 놓습니다. 그런 다음 꼬리의 중간 부분을 부드럽게 잡고 들어 올려 뒷부분이 약간 올라가고 질 입구가 노출되도록합니다.
라벨이 부착된 세척관에서 50마이크로리터의 PBS를 추출한 후 피펫 팁을 질 내강에 2-3밀리미터 부드럽게 삽입하고 3-4회 피펫팅하여 PBS로 세척합니다. 그런 다음 나머지 20마이크로리터의 미사용 PBS와 함께 세척 재료를 원래 세척 튜브로 다시 옮깁니다. 이 질 세척 직후, 20 마이크로리터의 박테리아 현탁액 또는 비히클 대조군을 질식으로 옮겨 각 마우스를 접종합니다.
두 개의 다른 박테리아 균주를 사용한 공동 접종 실험의 경우 균주를 미리 혼합하지 않고 각 박테리아 현탁액 10마이크로리터를 별도로 접종하십시오. 투여 된 부피가 질 내막에 즉시 축적되는 것을 방지하려면 마우스의 뒷부분을 10-20 초 동안 계속 잡고 있습니다. 접종된 마우스를 새 케이지 또는 이미 접종된 케이지 메이트로 옮기고 다른 마우스와 함께 절차를 반복합니다.
모든 마우스를 접종 한 후, 혐기성 챔버에서 접종 물의 연속 희석액을 도금하여 접종 후 콜로니 형성 단위를 얻습니다. 마우스 장기를 수집하려면 질과 자궁경부를 위한 각 튜브에 1밀리리터의 멸균 혐기성 PBS를 추가하여 혐기성 챔버에 5밀리리터의 장기 수집 튜브를 준비합니다. 자궁 뿔에 표시된 튜브에 750 밀리리터의 PBS를 추가하십시오.
희생 시 최종 세척을 수집하려면 이전에 설명한 대로 다른 질 세척 튜브 세트를 준비하십시오. 또한, 해부기구를 헹구고 살균하기 위해, 탈 이온수 50 밀리리터 비커와 70 내지 90 % 에탄올의 50 밀리리터 비커를 준비한다. 마우스를 희생하기 직전 또는 직후에 앞에서 설명한 대로 최종 세척을 수행합니다.
희생 후 마우스의 복부와 등에 70 % 에탄올을 뿌립니다. 그런 다음 에탄올로 멸균되고 말린 가위를 사용하여 수직 절단으로 마우스의 복강을 엽니 다. 그런 다음 집게를 사용하여 피부를 뒤로 당깁니다.
생식 기관을 노출시키려면 내장을 체강 밖으로 열린 필드의 측면으로 부드럽게 밀고 마우스에서 방광을 제거하여 생식 기관의 아래쪽 부분에 접근하십시오. 그 후, 질을 자르지 않고 가위로 음모의 중심을 자릅니다. 그런 다음 두 세트의 집게를 사용하여 골반의 양쪽을 잡고 골반을 옆으로 당겨 질의 아래쪽 부분을 노출시킵니다.
집게로 자궁 경부를 부드럽게 잡고 위로 당겨 결장을 노출시킵니다. 그 후, 작은 가위를 사용하여 외부 결합 조직에서 질을 방출하십시오. 장관에 구멍을 뚫지 않고 결장에서 질을 조심스럽게 풀어줍니다.
질이 결장에서 완전히 풀리면 가위를 사용하여 내측에서 질 옆구리를 잡은 다음 잘라내어 마우스 몸에서 제거합니다. 자궁 경부를 부드럽게 잡고 자궁 뿔이 더 잘 보이도록 위로 당기고 오른쪽과 왼쪽의 난소 바로 아래를 잘라 자궁 뿔을 풀어줍니다. 다음으로, 마우스 몸에서 생식 기관을 제거하고 멸균 된 페트리 접시에 넣으십시오.
그런 다음 면도날을 사용하여 자궁 뿔, 자궁 경부 및 질을 분리하십시오. 각 조직을 각각의 라벨이 붙은 수집 튜브에 넣습니다. 장기를 균질화하려면 휴대용 균질 기를 생물 안전 캐비닛에 준비하십시오.
먼저, 각 장기를 균질화 한 후 균질화 된 블레이드를 세척하기 위해 탈 이온수, 70 % 에탄올 및 PBS가 각각 포함 된 3 개의 50 밀리리터 튜브 세트를 준비하십시오. 균질 기를 청소하려면 블레이드를 물 튜브에 담그고 약 3 초 동안 최고 속도로 기계를 켭니다. 그런 다음 종이 타월의 칼날을 흔들어 과도한 물을 제거하십시오.
70 % 에탄올과 PBS로 블레이드를 연속적으로 헹굽니다. 초기 헹굼 후 균질화기 프로브를 장기가 있는 튜브의 바닥으로 내려 조직을 아래에 가둡니다. 그런 다음 균질화기를 켜서 조직을 갈아서 프로브를 약 5 번 위아래로 부드럽게 움직여 잠긴 상태로 유지합니다.
균질 기를 끄고 제거하고 시각적으로 완전한 조직 파괴를 보장합니다. 균질화 후 샘플을 혐기성 챔버로 다시 순환시키고 CFU 회수를 위해 연속 희석을 수행합니다. 이 프로토콜에 따라 질 세척제에서 생존 가능한 박테리아의 회수 및 집락 형성 단위의 열거는 박테리아 균주, Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia 및 Fusobacterium nucleatum에 대해 성공적으로 수행 될 수 있습니다.
더욱이, 질 세척으로부터 수득된 가드네렐라 질리스 콜로니-형성 단위의 수는 질 조직 균질액으로부터 회수된 것들과 상관관계가 있었다. 이 방법은 또한 Prevotella bivia 역가와 마우스 자궁 조직이 Gardnerella vaginalis와의 공동 감염 동안 Prevotella 단일 감염에 비해 유의하게 더 높다는 것을 보여주었습니다. 또한, 이 방법은 접종 후 24시간 및 72시간에 돌연변이 Fusobacterium nucleatum 균주의 질 지속성을 야생형의 질 지속성과 비교하는 데 성공적으로 사용될 수 있습니다.
질 박테리아 접종에 대한 면역 반응을 조사하기 위해, 사이토카인 분석은 조직 균질액에서 실행될 수 있다. 또는 염증의 징후를 평가하기 위해 조직 검사를 위해 조직을 저장할 수 있습니다.
