조사 된 버피 코트에서 피더 세포를 사용하여 T 림프구의 격리 및 배양을 통해 대동맥 밸브 석회화 조사

이 프로토콜은 수행하기 쉽습니다. 복제 단계는 신선한 샘플에서 더 많은 수의 T 클론을 얻을 수 있게 합니다. 더욱이, T 세포의 표현형 및 기능을 쉽게 분석할 수 있다.

절차를 시연하는 것은 메리 크리스토퍼, 내 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다. T 세포 복제를 유도하려면 바늘이 없는 밸브가 달린 백 스파이크를 사용하여 라미나르 플로우 후드에 조사된 버피 코트 백을 엽니다. 가방에서 최대 50밀리리터의 혈액을 T-150 플라스크로 옮기고 70밀리리터의 PBS를 플라스크에 넣습니다.

4개의 50 밀리리터 원액 튜브 각각에 있는 20 밀리리터의 밀도 그라데이션에 희석된 혈액의 30 밀리리터를 주의 깊게 층으로, 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리한다. 신중하게 슈퍼나탈을 흡인하고, 각 튜브에서 PBMC를 하나의 새로운 50 밀리리터 튜브로 전송합니다. PBS를 사용하여 최종 볼륨을 50밀리리터로 가져오고 원심분리로 PBMC를 수집합니다.

동일한 조건하에서 두 번째 세척 후, 셀 배양 배지의 10 밀리리터에서 격리 된 피더 세포를 중단하고, 2 개의 50 밀리리터 튜브 각각에 IL-2 용액 50 단위로 보충 된 70 밀리리터 세포 배양 배지의 25 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 IL-2 농도로 보충된 세포 배양 배지의 밀리리터 당 6세포에 2-10의 튜브에 피더 세포를 첨가한다. T 림프구 배양을 설정하려면 스테노틱 밸브 샘플 플라스크에서 슈퍼나티를 포함하는 T 셀 클론을 단일 50 밀리리터 튜브로 풀링하고 원심분리로 세포를 수집합니다.

세척당 PBS의 50 밀리리터에서 펠릿을 세 번 세척한 후 셀 배양 배지의 1 밀리리터에서 세포를 재보설한다. 셀을 밀리리터 농도당 3번째 세포에 11로 희석하고, 피더 세포 없이 IL-2로 보충된 세포 배양 배지의 튜브에 500 마이크로리터를 첨가한다. 피더 셀 서스펜션을 플라스틱 100 x 15 밀리리터 페트리 접시에 추가하고 실험을 위해 적절한 수의 U-bottom 96-well 플레이트의 각 웰에 100 마이크로리터의 피더 셀을 추가합니다.

그런 다음 T 세포를 페트리 접시에 추가하고 세포 배양 인큐베이터에서 1 주일 동안 잘 보충 된 각 피더 셀에 100 마이크로 리터를 추가합니다. PBMC 절연은 피더 세포를 획득하고 대동맥 밸브 샘플에서 백혈구에 침투하는 검출 및 특성화를 가능하게 하는 데 매우 중요합니다. 2주 간의 배양 후 클론 T 세포 집단을 얻을 수 있다.

여기서, 석회화 대동맥 판막 질환 환자의 T세포 하위집단을 분석하기 위한 게이팅 방식이 도시된다. 이 환자에서 관찰된 바와 같이, CD8+T 세포보다 더 많은 CD4+T 세포가 있었다. 복제되지 않은 T 세포의 흐름 세포 측정 분석은 동일한 T 세포 마커가 네이티브 밸브 및 클론 샘플 모두에 존재하는지 확인합니다.

종합하면, 이 데이터는 T 세포가 CD45+백혈구를 가진 석회화한 대동맥 판막에 존재한다는 것을 나타내며, 석회화 대동맥 판막 질환이 면역 계통및 염증 활성의 활성화와 관련이 있음을 시사합니다. 이 방법은 매우 다재다능합니다. 그것은 연구원이 기능적 특성화를 위해 조직에서 세포를 격리할 수 있어야 하는 다른 프로토콜에 적용될 수 있습니다.

오염을 피하기 위해 멸균 조건하에서 작업하고 현미경으로 세포를 비판적으로 관찰하는 것이 중요합니다.