This work was supported by the US Food and Drug Administration. We acknowledge the original publication of the CPA study by Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)

윤리 문 : 동물과 관련된 절차 독성 연구를위한 미국 FDA / 국립 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 참고 : 여기에 설명 된 연구 설계가 생체 내 설치류 알칼리 혜성 분석 (18)의 타당성에 대한 대체 방법의 유효성 검사를위한 일본 센터 (JaCVAM)에 의해 개발 된 프로토콜을 기반으로하고, 또한 OECD 가이드 라인의 권장 사항에 따라 수정 된 TG489 19 . 1. 준비 <ol><li> 슬라이드 준비 <ol><li> 1 %에서 일반 용융 아가로 오스를 용해 (W / V) 인산 버퍼 (칼슘, 마그네슘 2+ 무료 페놀 레드 무료) 전자 레인지에 가열. </li><li> 55 ° C의 물을 욕조에 용융 1 % 표준 아가로 오스 솔루션을 놓고 욕실 온도를 평형. 딥 유리 현미경은 exces을 배출, 아가로 오스 용액에 슬라이드아가로 오스 S와 깨끗한 슬라이드의 뒷면을 닦아냅니다. 실온에서 건조 슬라이드를 평평한 표면에 수직 슬라이드를 놓고 수 있습니다; 건조한 장소에 슬라이드를 저장합니다. </li></ol></li><li> 혜성 시험 용액의 제조 <ol><li> 0.5 % 저 융점 아가로 오스 솔루션을 준비합니다. 인산 버퍼에 아가로 오스 (칼슘, 마그네슘을 2 +, 페놀 레드 무료) 저 융점을 용해 전자 레인지에 가열. 혜성 슬라이드 준비하는 동안 37-45 ℃에서 솔루션을 유지; 이후에 남아있는 아가로 오스 솔루션을 폐기합니다. </li><li> 용해 버퍼를 준비합니다. 디 나트륨 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (디 소듐 EDTA 씨 372.24 g / mol)을 2.5 M 염화 나트륨 (NaCl을 씨 58.44 g / 몰) 및 10 mM 트리스 히드 록시 메틸 아미노 메탄 (트리스베이스 씨 121.14 g / 몰) 100 mM의 용액을 정제수, 10 N 수산화 나트륨 수용액 (NaOH로 씨 40g / mol)을 사용하여 pH 10로 조정한다. 사용 당일 최종 정광을 달성하기 위해 용액에 트리톤 X100 및 디메틸 설폭 사이드 (DMSO 씨 78.13 g / 몰) 부가각각 1 %, 10 %, 이온, 및 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 4-9 ℃에서 교반 하였다. </li><li> 사용 당일에 신선한 효소 버퍼를 확인합니다. 40 mM의 2- [4- (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 일] - 에탄 설 폰산 (HEPES 씨 238.3 g / 몰) 100 mM의 염화칼륨 (KCl을 씨 74.55 g / mol)를 0.5 mm로 함유하는 용액을 준비 디 소디움 EDTA, 정제수를 0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA, 씨 66,463g / 몰). 10 N 수산화 칼륨 용액 (KOH, 56.1 g / mol)을 8.0의 pH를 조정한다. 실온에서 교반하고, 사용하기 전에 완전히 용해를 확인합니다. </li><li> 300 mM의 수산화 나트륨 정제수 1 mM의 EDTA이 나트륨을 함유하는 알칼리 완충액을 준비한다. 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 4-9 ℃에서 교반 하였다. 사용하고, pH가&gt; 13 인 확인하기 전에 용액의 pH를 측정한다. </li><li> 정제 된 물에 0.4 M 트리스 자료의 용액을 제조하고, 염산 (HCl을, 미스터 36.46)으로 pH 7.5로 조정한다. 4-10 ° C에서 솔루션을 저장합니다. 이 버퍼를 중화한다. </li><li> F 만들기resh 사용 당일에 버퍼를 닦지. 행크의 균형 소금 용액에 20 mM의 디 소듐 EDTA, 10 % DMSO를 함유 용액 (HBSS, 칼슘, 마그네슘 2+, 페놀 레드 무료)을 준비합니다. 얼음에 사용할 때까지 보관합니다. </li><li> 염색 용액을 제조하려면 1에서 트리스 - 보레이트-EDTA (TBE 버퍼)와 핵산 형광 얼룩 원액을 희석 : 10,000 (v / v)로. 알루미늄 호일을 사용하여 빛의 솔루션을 보호합니다. 2-8 ° C에서 보관하고 24 시간으로 사용합니다. </li></ol></li></ol> 쥐의 간에서 단일 세포 현탁액 2. 준비 <ol><li> 동물의 안락사에 대한 미국 수의학 의료 가이드 라인에서 권장하는 CO 2 가스를 다음과 같은 방법으로 쥐를 안락사 : 2013 판 20. <ol><li> 2.75에서 CO 2 유량을 설정합니다. 안락사 챔버에서 쥐를 착용 할 것 (예를 들어, 데시 케이 터 항아리, 배출 뚜껑 쥐 케이지)와 탱크 밸브를 개방하여 CO 2를 켭니다. 까지 1.5 ~ 2.5 분 동안 기다립니다쥐 의식이된다. 최대 설정으로 CO 2 흐름을 증가시킵니다. 호흡의 중단 후 안락사를 위해 약 1 분 동안 챔버에서 래트를 떠난다. 쥐가 더 하트 비트가 없음을 확인 palpating하고 쥐가 다리를 철회하지 않는 것을 결정하기 위해 발가락을 곤란하게하여 안락사를 확인합니다. </li></ol></li><li> 70 % 에탄올로 머리 피부를 소독. 복강을 열고 수술 가위 그대로 간을 제거합니다. 간을 제거한 후, 수술 가위로 남아있는 간에서 왼쪽 측면 로브를 제거합니다. 커팅 보드에 왼쪽 측면 로브를 놓고 일회용 단일 양날 면도날을 사용하여 두 개의 인접한 3-4mm 두께의 횡단면을 잘라. </li><li> (섹션의 컬링을 방지하기 위해) 필터 종이에 하나의 횡단면을 배치, 10 % 중성 완충 포르말린 (NBF)에 섹션을 배치합니다. 1 이상 : 조직 10 % NBF의 비율이 10 있는지 확인하십시오. 적어도 72 시간, 시저의 고정 시간 후조직 병리학 (아래 7 항 참조) 간을 ESS. </li><li> 6cm 페트리 접시에 5 ml의 얼음처럼 차가운 닦지 버퍼 (섹션 1.2.6)에 두 번째 횡단 간 부분을 놓고 잔류 혈액을 제거하기 위해 3 번 씻어. </li><li> 1 ml의 얼음처럼 차가운 닦지 버퍼를 포함하는 새로운 2 ML의 원심 분리기 튜브에 간 섹션을 전송합니다. 세포를 분리하는 미세 가위로 잘 세정 간 부 말하다. 모든 조직 덩어리를 제거하기 위해 40 μm의 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액 스트레인. </li><li> 얼음에 단일 세포 현탁액을 놓고 1 시간 내에 슬라이드를 만들기 위해 사용합니다. 농도가 약 2 X10 106 세포 / ml 인 것을 확인하기 위해 (또는 전자 혈구 세포 계수기 예) 계수하여 세포의 농도를 확인한다. </li></ol> 혜성 슬라이드 3. 준비 <ol><li> 열 용융의 권, 37 ° C, 0.5 % 저 융점 아가로 오스 용액 (섹션 1.2.1)를 단일 세포 현탁액 하나의 볼륨을 섞는다.즉시 일반 융점 아가로 오스 (섹션 1.1)로 코팅 된 슬라이드에 100 μl를 피펫. 즉시 세포 아가로 오스 혼합물을 통해 커버 슬립을 배치합니다. 각 샘플에 대한 최소 8 슬라이드를 확인합니다. 참고 : 모든 슬라이드는 숫자 또는 이와 유사한 코드로 식별되어야하고 슬라이드가 눈을 멀게 방식으로 획득 할 수 있도록 자신의 정체성 (아래, 6.2.2 참조), 기록했다. </li><li> 30 분 동안 4 ° C에 슬라이드가 평평하고 멋진 놓습니다. </li><li> 젤이 응고 후, 부드럽게 커버 전표를 제거하고 미리 냉각 용해 버퍼 (섹션 1.2.2)에 슬라이드를 담가. 빛으로부터 슬라이드를 보호하고 O에 1 시간 (최소)에서 4 ° C에서 용해 버퍼에 슬라이드를 유지 / N (최대). </li></ol> 혜성 슬라이드 4. 효소 처리 <ol><li> 용해 버퍼에서 각 조직 샘플로부터 제조 된 8 슬라이드 6을 제거하고 그들을 실온에서 효소 버퍼 (섹션 1.2.3) 5 분마다 3 배 씻어. 알칼리 혜성 분석 w에 대한 나머지 두 슬라이드를 사용하여ithout 효소 처리 (아래 5.1 참조). 세척 한 후, 배수 및 조직과 슬라이드를 모래 바닥으로 물기를 제거합니다. </li><li> 1 효소 버퍼 hOGG1 및 엔도 III 효소 주식을 희석 : 1,000 (v / v)로. 얼음에 사용할 때까지 놓습니다. </li><li> 혼자 효소 버퍼 (참고 슬라이드로 사용이 슬라이드), 200 μl를 hOGG1 용액 (2 슬라이드) 또는 200 ㎕의 엔도 III 솔루션 (2 슬라이드) 200 ㎕를 각 치료 그룹에서 제조 된 슬라이드에 다음과 같은 솔루션을 200 μl를 적용합니다. </li><li> , 젖은 종이 타월로 줄 지어 페트리 접시에 슬라이드를 넣어 파라 필름과 슬라이드를 포함하고, 엔도 III-처리 및 참조 슬라이드와 hOGG1 처리 슬라이드에 30 분 동안 45 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 배양 후, 증류수로 슬라이드를 씻어 이하, 5.2에 설명 된대로 처리를 계속합니다. </li></ol> 5. 풀기 및 전기 영동 <ol><li> 슬라이드가 효소로 처리하지 않은 경우, 용해 완충액에서 슬라이드를 삭제상기 슬라이드를 드레인과 잔여 세제 염을 제거하기 위해 5 분 동안 차가운 중화 완충액 (섹션 1.2.5) 회 헹군다. </li><li> 공백을 피하고 단계 4.5 수평 겔 전기 영동 탱크에 무작위 5.1에서 장소 슬라이드. 액면 그냥 슬라이드를 커버 할 때까지 갓 만든 산도&gt; (13) 전기 영동 버퍼 (섹션 1.2.4)와 탱크를 채우십시오 (아가로 오스를 통해 거품을 방지하고 있는지 탱크 레벨 확인). DNA의 풀림의 시작에서 버퍼 pH와 온도를 기록한다. </li><li> 20 분 알칼리 책임 손상의 DNA와 표현의 풀림을 허용하는 슬라이드는 알칼리 버퍼에 남아 보자. </li><li> 푸는 동안 프로그램 전원은 전기 조 (양극과 음극 사이 cm의 거리로 나눈 값 V / cm = 볼트)에서 0.7 V / cm를 생성한다. </li><li> 풀림 후, 전원 공급 장치의 실행 버튼을 누릅니다. 필요한 경우, 상승 또는 버퍼 레벨을 낮춤으로써 300mA의 전류를 조정한다. 제 유지그냥 슬라이드의 표면 위의 전자 버퍼 수준입니다. 20 분 동안 4 ° C에서 전기 영동을 수행합니다. 시작과 끝에서의 전기 슬라이드 위치 버퍼의 온도와 전류 (A)를 기록한다. 참고 : 너무 많은 버퍼가 DNA의 이동을 방해 할 수 있습니다 낮은 전압 발생합니다. </li><li> 전기 영동 후, 5 분 동안 부드럽게 (섹션 1.2.5)을 탱크에서 슬라이드를 해제하고, 중화 완충액에 침지시켜 과량의 알칼리를 중화. 슬라이드를 배출하고 두 번 더 반복한다. </li><li> 5 분 동안 차가운 100 % 에탄올에 침지하여 슬라이드를 고정한다. 저장을위한 건조 지역에서 자연 건조와 장소에 슬라이드를 허용합니다. </li></ol> 6. DNA 염색, 혜성 시각화 및 분석 <ol><li> DNA 염색 <ol><li> 판지 또는 금속 트레이에 슬라이드를 놓고 각 슬라이드에 핵산 형광 염색 가공 솔루션 (섹션 1.2.7)의 200 μl를 추가하고 유리 커버 슬립으로 다룹니다. 에서 슬라이드를 보호광은 슬라이드 채점 전에 적어도 30 분 동안 염색 용액과 접촉을 유지하도록 허용한다. 한 번에 20의 배치에 슬라이드를 얼룩. </li><li> 각 슬라이드를 읽기 전에, 부드럽게 커버 유리를 방해하지 않도록주의, 과잉 염색 액을 멀리시킨다. </li></ol></li><li> 혜성 시각화 및 채점 <ol><li> 컴퓨터 모니터에 혜성 슬라이드의 라이브 영상을보기 위해 형광 현미경에 장착 된 비디오 카메라를 사용한다. </li><li> 무작위로 세포를 포함 현미경 필드를 선택합니다. 마우스를 사용하여 셀을 선택합니다. 마우스 왼쪽 클릭으로 &quot;혜성의 머리&quot;의 중심을 클릭합니다. 주 : 컴퓨터 소프트웨어는 모든 셀에 대한 측정 파라미터를 계산하고, 데이터 파일에 데이터를 추가한다. </li><li> 현재 필드 (단계 6.2.4 참조)에있는 모든 세포 점수, 다음 세포의 또 다른 세트를 찾기 위해 현미경의 스테이지를 제어하고 화면의 영상을 사용합니다. 6.2.2에 설명 된대로이 세포 점수. </li><li> 슬라이드 F 점수롬 오른쪽 왼쪽 위로 아래로합니다. 약 10 필드 랜덤을 선택합니다. 이 과정에서보기 필드에 나타납니다 적당한 혜성 셀은 편견없이 득점해야합니다. 참고 : 다음 중 하나에 해당하는 경우 혜성 점수하지 마십시오 : 1)는 슬라이드의 가장자리 중 하나에 있습니다; 2) 두 개 이상의 혜성은 중복; 3) 꼬리에 파편이있다; 4) 소프트웨어는 머리와 꼬리를 구분할 수 없다; 5) 핵 및 / 또는 꼬리의 염색 슬라이드에 다른 혜성 크게 다르다. 참고 : 꼬리 거의 모든 DNA 형광와 혜성은 종종 &#39;고슴도치&#39;혜성이라고합니다. 고슴도치 혜성은 득점하지 않아야하지만, 슬라이드 득점 중에 감지 고슴도치의 수를 기록, 총 혜성의 백분율로보고되어야한다. </li><li> 적어도 150 혜성 세포 / 총 샘플을 얻기 위해 장기 / 조직 당 두 개의 슬라이드를 읽고 슬라이드 당 최소 75 혜성을 분석합니다. 슬라이드에서 세포의 필요한 수의 후 수 있습니다실내는 결과는 나중에 데이터 분석을위한 스프레드 시트 파일로 저장됩니다 얻었습니다. </li></ol></li></ol> 7. 조직 병리학 분석 <ol><li> 조직 (21)을 트리밍 한 다음 10 % NBF에서 72 시간 고정 최소, 이후 정기적으로 처리하고 22 배지 계 파라핀 왁스 시료의 왼쪽 측면 간 로브를 포함. 제 샘플에서 약 5 미크론 유리 슬라이드에 수집합니다. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E)와 섹션을 얼룩 : <ol><li> 염색 과정에 앞서 2 시간 동안 60 ° C의 오븐에서 파라핀 조직 절편과 슬라이드를 가열한다. </li><li> 측면을 deparaffinize하는 자일 렌을 사용합니다. 실행중인 수돗물 린스에 등급 에탄올 (EtOH로)와 슬라이드를 재수. </li><li> 2 분 40 초 동안 헤 마톡 실린 450 ml의에서 슬라이드를 놓습니다. 4 초 동안 산 린스 슬라이드 (450 ml의 탈 이온수 2 ml의 빙초산는) 5 분 실행 수돗물 린스 다음과 같습니다. </li><li> 미끄러 배치2 분 30 초, 1 분 동안 70 %의 EtOH 린스 수돗물 린스를 실행하여 다음 2 분 동안 1 ㎖의 수산화 암모늄을 함유하는 450 ㎖의 70 % EtOH 중 에스. </li><li> 3 분 동안 4 ml의 빙초산을 함유하는 450 ml의 에오신 Y 용액 슬라이드 부화. </li><li> 등급 EtOH로 슬라이드 탈수. 자일 렌과 슬라이드 (세 번 각각 1 분)을 취소 한 커버 슬립이 슬라이드에 배치 될 때까지 크실렌에 슬라이드를 개최합니다. </li></ol></li><li> 1 (최소), 2 (가벼운), 3 (보통), 4로 심각도에 대한 광학 현미경, 기록 결과, 학년이 아닌 양성 병변에 의해 슬라이드를 검사 (표시). 참고 :; 가벼운 = 16~35%가 보통 = 36-60%, 특정 병변에 적용 심각도 등급이 병변에 간 상대적 비율 (최소 = &lt;1-15%에 기초하고 표시 = 61 100 %). </li></ol> 8. 데이터 분석 <ol><li> 동물은 통계적 평가를위한 실험 장치로 간주됩니다. DNA 손상은 %로 표현된다 DN꼬리에. </li><li> 다음 산화성 DNA 손상을 계산한다 : 레퍼런스 슬라이드 (NO 효소 처리)는 백그라운드 DNA 가닥 나누기 (SB)의 추정치를 제공한다. 참고 : 효소 처리 된 슬라이드 가닥 나누기의 측정 및 산화 기지 (SB + OX)를 제공합니다. DNA 손상의 함수로 꼬리 %의 DNA에 대한 선형 용량 반응을 가정하면, SB + OX에서 SB의 감산은 산화 피리 미딘 / 변경 퓨린 (23)로부터 DNA 가닥 나누기의 추정치를 제공합니다. </li><li> 차량 제어에 처리 된 동물에서의 답변 페어의 비교에 대한 던넷 시험 다음 편도 ANOVA에 의해 투여 량의 함수로 꼬리 %의 DNA를 분석합니다. 참고 : 모든 테스트는 하나의 꼬리하고 0.05의 p- 값이 통계적 유의성의 기준으로 설정됩니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair:+principles,+applications,+and+limitations.">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+'comet'+assay.">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay.</a> Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).</li><li>Committee, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+opinion+on+genotoxicity+testing+strategies+applicable+to+food+and+feed+safety+assessment.">Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment.</a> EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).</li><li>Ding, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+dose-response+analysis+of+genotoxicity+in+cyproterone+acetate-treated+F344+rats.">Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats.</a> Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).</li><li>Ding, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genotoxicity+of+estragole+in+male+F344+rats.">In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats.</a> Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).</li><li>Ding, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genotoxicity+of+furan+in+F344+rats+at+cancer+bioassay+doses.">In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+genotoxicity+assessment+of+silver+nanoparticles+in+mouse.">Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse.</a> Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).</li><li>Ding, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyleugenol+genotoxicity+in+the+Fischer+344+rat+using+the+comet+assay+and+pathway-focused+gene+expression+profiling.">Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling.</a> Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).</li><li>Manjanatha, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+of+doxorubicin+in+F344+rats+by+combining+the+comet+assay,+flow-cytometric+peripheral+blood+micronucleus+test,+and+pathway-focused+gene+expression+profiling.">Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling.</a> Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).</li><li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII.">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+oxidative+damage+to+DNA+and+its+repair+with+the+comet+assay.">Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay.</a> Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).</li><li>Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+comet+assay:+use+and+status+in+genotoxicity+testing.">The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing.</a> Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).</li><li>Hartmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+conducting+the+in+vivo+alkaline+Comet+assay.+4th+International+Comet+Assay+Workshop.">Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop.</a> Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+oxidative+DNA+damage+and+its+repair+using+the+comet+assay.">Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay.</a> Mutat Res. 681, 24-32 (2009).</li><li>Collins, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay+in+human+biomonitoring+studies:+reliability,+validation,+and+applications.">Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications.</a> Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).</li><li>Gutzkow, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+comet+assay+using+96+minigels.">High-throughput comet assay using 96 minigels.</a> Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013)</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).</li><li>Carson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Self-Instrumental+Text.">A Self-Instrumental Text.</a> Histotechnology. , 25-37 (1996).</li><li>Dusinska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+COMET+ASSAY,+modified+for+detection+of+oxidised+bases+with+the+use+of+bacterial+repair+endonucleases.">THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases.</a> Dusinska Protocol [Internet]. , (2000).</li><li>Schuppler, J., Gunzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tumors+and+steroid+hormones+in+rats+and+mice.">Liver tumors and steroid hormones in rats and mice.</a> Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).</li><li>Hobkirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+sulfotransferases+and+steroid+sulfate+sulfatases:+characteristics+and+biological+roles.">Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles.</a> Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).</li></ol>

None of the authors have competing interests or conflicting interests. The information in these materials is not a formal dissemination of information by FDA and does not represent agency position or policy.

이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 쥐의 간에서 모두 직접 산화 DNA 손상의 동시 측정을 설명합니다. 일반적인 프로토콜 (즉, DNA 손상되지 테스트 에이전트하지만 동물 조직의 취급 및 가공에 의해 유도 된) 단일 세포 또는 핵 최소 처리 유도 된 DNA 손상과 분리 될 수있는 모든 조직에 적용 할 수있다. 우리의 연구에서는 골수 7,9, 위 (6), 신장 (9), 방광 (9), 폐 <s...

알칼리 혜성 분석은 단일 세포 수준에서 DNA 가닥 나누기를 측정한다. 단일 세포 현탁액은 현미경 슬라이드에 아가에 매립하고 세포의 DNA를 포함하는 수퍼 코일 루프 nucleoids을 형성 용해. 양극으로 마이그레이션하는 DNA의 해제 가닥으로 가닥 나누기를 포함하는 DNA 루프에서 수퍼 코일의 손실 산도&gt; (13) 결과에서 전기 영동, 형광 현미경으로 관찰 할 수 혜성 같은 구조를 생성. 단편화 된 DNA는 DNA 파괴 하나를 정량화하는데 사용될 수있는 단편의 크기 및 총 강도 (머리와 꼬리)에 비해 혜성 꼬리의 상대적 형광에 기초하여 &quot;꼬리&quot;에 혜성의 &quot;헤드&quot;에서 마이그레이션 2. 분석은 단순 구분, 다양한, 빠른, 1 상대적으로 저렴하다. DNA를 손상 에이전트에 의한 단편화 된 DNA의 검출은 세포의 DNA 손상을 정량화하기위한 분석을 사용 또는에서 핵을 격리 INDIVI잠재적 유전 독성 물질 (들)로 처리 동물의 이중 조직. 장점으로 인해 생체 내 혜성의 분석은 현재의 가늠자 조정에 국제 회의 (ICH) (3)과 유럽 식품 안전청에서 제품의 안전성 평가를 수행하기위한 (생체 내 소핵 분석과 쌍) 두 번째 생체 내 유전 독성 분석 (EFSA로 추천 ) 4 규제 지침. 우리가 실험실에서, 우리는 음식 재료, 의약품, 나노 물질 5-10에 의한 생체 내 DNA 손상을 평가하기위한 분석을 사용했다. 쥐 간 이러한 프로토콜의 예로서 사용되지만, 혜성 분석은 실험 동물의 다른 조직 / 기관만큼 조직으로부터 단리 할 수​​있다 그대로 단셀로 수행 될 수있다. DNA 손상의 특정 타입은 염기성 알칼리 혜성 시험을 수정하지 않고 DNA 가닥 나누기로 검출하기 어렵다. 산화성 DNA 손상의 경우에, 스트랜드 Breaks은 같은 8 oxoguanine (8 oxoGua) 및 메틸 fapy - 구아닌 (11)에서 휴식을 만들어 인간의 8-oxoguanine-DNA-N-글리코 1 (hOGG1, 같은 수리 효소로 소화에 의해 DNA의 산화 적 병변에서 만들 수 있습니다. 또한, 효소 III (엔도 III)의 산화 피리 미딘 1 주로 휴식을 생성한다. 따라서, 효소 분해 단계의 추가가 분석을 생체 (12)의 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 구체적이고 민감한 방법을한다. 이러한 분석을 활용, 우리는 증명하고있다 쥐와 생쥐 6-8의 간에서 쥐 (10)의 중심부에 독성 물질에 의한 산화 적 DNA 손상. 시험관 내에서 민감한에 의해 식별 genotoxins에 대한 생체 분석에서 후속는 3,13 테스트로 1), 2) 여러 조직에서 생체 이물에 의한 DNA 손상의 메커니즘을 평가하기 : 알칼리 혜성 분석은 유전 독성과 인간 생체 모니터링에 많은 응용 프로그램이 있습니다 14 3)하면 조사발암 물질, 4), 5) 사람의 질병 직업적 노출 (16)을 조사하고 DNA 손상을 복구 (15)을 평가하기 위해 유전자 독성 또는 동작의 비 유전 독성 모드 (MOA) (7)를 사용하여 동작 6)에 대한 잠재적 인 높은 처리량 스크리닝 검사로서 기관 고유의 유전 독성 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">12-544-14</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">12-550-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA, Disodium</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">ICN1860454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca++, Mg++ free)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:156px;">SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Low Melting Point Agarose (LMP)</td>
			<td style="width:140px;">Lonza</td>
			<td align="right" style="width:156px;">50081</td>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Normal Melting Agarose (NMA)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pH testing paper strips (pH 7.5-14)</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">M95873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Potassium Cloride</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">slide labels, (0.94 x 0.5 in.)</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">NC9822036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Sodium Chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Sodium Hydroxide (NaOH)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SYBR&#8482; Gold&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:156px;">S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Trizma Base&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">2.0 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">05-402-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Cell strainer (40 &#181;m)</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td align="right" style="width:156px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Endonuclease III (Nth)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:156px;">M0268S</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">hOGG1&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:156px;">M0241S</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring dna strand breaks and oxidative dna damage in rat liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

생체 내 알칼리성 혜성 분석은 사이 프로 테론 아세테이트 (CPA) (5)로 처리 된 래트의 간에서 직접 및 산화성 DNA 손상을 모두 측정하는 효소 변성 혜성 분석과 함께 수행 하였다. CPA와 함께, 섹스 특정 방식으로 쥐의 간 종양을 유도하는 합성 호르몬 약물 여성 (24)에 비해 남성 쥐에서 간 종양을 유도하는 데 필요한 높은 용량을 5 배. 우리 수컷 및 암컷...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver at JoVE.com

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

쥐 간에서 DNA 가닥 나누기 및 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

in-vivo-alkaline-comet-assay-enzyme-modified-alkaline-comet-assay-for

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

15.3K 조회수.  US FDA/National Center for Toxicological Research. The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

비디오: In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

이미징 불일치 복구 및 DNA의 손상 세포 응답 바실러스 subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

연구

생물학

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

세포질 DNA 검출 진학의 자극<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

전신 산화 스트레스의 간접 측정으로 혜성 분석

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정<em&gt; 생체</em&gt; 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...