혜성 분석은 유전 독성을 평가하는 데 널리 사용됩니다. 당사의 프로토콜은 표준 혜성 분석에 비해 여러 가지 방법론적 이점을 제공합니다. 우리의 기술은 표준 혜성 슬라이드를 수직으로 잡고 특수 제작된 랙에서 25개 배치로 처리하는 데 중점을 둡니다.
여기에는 전기 영동이 포함되므로 탱크가 더 작고 버퍼를 덜 사용하며 냉각 기능이 통합되어 있습니다. 랙에 보관되어 슬라이드의 섬세한 젤이 더 잘 보호되고 25초 만에 용액에서 용액으로 이동합니다. 우리의 혈액 혜성 프로토콜을 사용하여 연구자들은 혈액의 핀 찌름을 사용하여 인간, 다른 종의 DNA 손상 및 잠재적으로 유전 독성 환경 노출의 다양한 것을 연구 할 수 있습니다.
현미경 슬라이드를 혜성 젤에 대한 견고한 지지체로 사용하는 혜성 분석의 다양한 형식은 우리의 접근 방식에 적합합니다. 이 기술의 중요한 부분은 LMP 아가로스와 혼합 한 후 샘플을로드하는 것입니다. 샘플은 기포를 만들지 않고 신속하게 적재해야 하며 응고되기 전에 즉시 커버 슬립으로 덮어야 합니다.
시작하려면 PBS에 0.6%저융점 아가로스를 준비하고 섭씨 37도의 수조에 넣습니다. 영구 마커 또는 연필을 사용하여 미리 코팅된 슬라이드의 젖빛 끝에 이름, 날짜 및 치료 정보를 표시합니다. 평평한 벤치에 냉각 플레이트를 놓고 두 개의 냉동 냉각 팩을 금속 표면 아래의 슬라이딩 서랍에 삽입합니다.
그런 다음 슬라이드를 냉각 플레이트에 올려 1-2분 동안 미리 냉각합니다. 원심분리하여 샘플 튜브에서 상청액을 제거하고 즉시 얼음 위에 다시 놓습니다. 세포 펠릿을 200마이크로리터의 0.6%저융점 아가로스로 재현탁하고 피펫팅으로 혼합합니다.
다음으로, 80 마이크로 리터의 아가 로스 함유 세포를 냉각 된 슬라이드에 넣고 젤 위에 커버 슬립을 빠르게 놓습니다. 젤을 냉각 플레이트에 1-2 분 동안 두십시오. 그 동안 용해 완충액의 작업 용액 500 밀리리터를 준비하고 용해 접시에 부어 넣으십시오.
젤이 굳은 후 엄지와 집게 손가락 사이의 슬라이드를 부드럽게 잡고 커버 슬립을 젤에서 밀어 커버 슬립을 빠르게 제거합니다. 그런 다음 슬라이드의 모든 검은색 점 표시가 같은 방향을 향하도록 슬라이드 캐리어 안에 슬라이드를 배치합니다. 슬라이드 캐리어를 용해 접시 안에 넣습니다.
용해 접시의 뚜껑을 닫고 배양을 위해 넣으십시오. 젤을 방해하지 않고 용해 접시에서 슬라이드 캐리어를 조심스럽게 제거하십시오. 슬라이드 캐리어를 얼음처럼 차가운 이중 증류수가 미리 로드된 세척 접시에 부드럽게 놓습니다.
슬라이드가 완전히 잠겼는지 확인하고 30분 동안 설정을 그대로 두십시오. 최적의 완충 온도를 유지하기 위해 전기 영동 탱크 아래에 냉동 냉각 팩을 놓습니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 전기 영동 작업 용액을 탱크에 넣고 슬라이드 캐리어를 탱크에 옮깁니다.
세포 함유 겔이 음극을 향하도록 슬라이드의 방향을 지정합니다. 슬라이드를 전기 영동 탱크에서 20 분 동안 배양하여 DNA가 풀릴 수 있도록합니다. 그런 다음 전원 공급 장치를 켜서 센티미터당 20볼트에서 1.19분 동안 전기 영동을 수행합니다.
전기 영동이 완료되면 전원 공급 장치를 끄고 전기 영동 탱크에서 슬라이드 캐리어를 제거합니다. 슬라이드 캐리어가 티슈 페이퍼에서 30초 동안 배수되도록 합니다. 다음으로, 슬라이드 캐리어를 중화 완충액이 들어있는 접시에 넣고 20 분 동안 그대로 두십시오.
그런 다음 얼음처럼 차가운 이중 증류수가 들어있는 세척 접시에 넣고 20 분 동안 그대로 두십시오. 세척 후 물에서 슬라이드 캐리어를 제거하고 슬라이드를 섭씨 37도의 인큐베이터에서 1시간 동안 건조시킵니다. 슬라이드를 재수화하려면 슬라이드 캐리어를 얼음처럼 차가운 이중 증류수가 들어있는 세척 접시에 옮기고 30 분 동안 그대로 두십시오.
그런 다음 슬라이드 캐리어를 밀리리터당 2.5마이크로그램의 요오드화 프로피듐 용액을 포함하는 염색 접시에 넣습니다. 염색 접시의 뚜껑을 닫고 실온에서 어두운 곳에서 20 분 동안 배양하십시오. 배양 후 슬라이드 캐리어를 별도의 접시에 옮기고 얼음처럼 차가운 이중 증류수로 20 분 동안 씻으십시오.
접시에서 슬라이드 캐리어를 꺼내 섭씨 37도 인큐베이터 또는 실온에서 어두운 곳에서 완전히 건조시킵니다. 슬라이드가 완전히 건조되면 이미지 분석이 준비될 때까지 어두운 곳에서 슬라이드 상자에 보관하십시오. 인간 각질세포는 상이한 용량의 UVA 및 UVB로 조사되거나 50-마이크로몰 과산화수소로 처리되어 DNA 손상을 유도하였다.
최적의 전압은 1.19 볼트 센티미터로 가장 민감한 반응과 꼬리 DNA의 가장 큰 비율을 유도합니다. 인간 전혈은 상이한 용량의 UVA로 조사되고 상이한 농도의 Fpg로 처리되었다. 고처리량 알칼리성 혜성 분석은 최적의 수준의 DNA 손상이 Fpg 밀리리터당 4개의 단위로 유도되었음을 밝혀냈다.
난소암 세포주 SK-OV-3을 시스플라틴과 과산화수소의 조합으로 처리하였다. 노출되지 않은 세포는 손상을 나타내지 않았습니다. 과산화수소 단독에 대한 노출은 DNA 인트라 스트랜드 가교가 유도 된 세포와 비교하여 상당한 평균 올리브 테일 모멘트를 생성했습니다.
100 마이크로 몰 시스플라틴으로 처리 한 후, DNA 인트라 스트랜드 가교는 12 시간에 피크로 증가하고, 그 후 30 시간 후에 레벨이 0으로 감소했다 전기 영동 탱크에 얼음 팩을 넣고 20 분 동안 슬라이드를 배양하여 전기 영동 전에 DNA를 푸는 것이 필수적입니다. 이 단계는 손상된 DNA가 전류로 이동하는 데 도움이 됩니다. 수직으로 배치된 슬라이드로 분석을 실행하면 혜성 분석을 자동화할 수 있었습니다.
또한, 우리의 기술은 연구를 위한 혜성 분석을 단순화했습니다.
