Name: gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation
Uploaded: 2016-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
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우리는 발현 플라스미드과 현장 프로브 박사 도리스 K. 우 감사, 감각 생물 이미징 시설의 존스 홉킨스 대학 센터와 청력과 균형을위한 센터. 이 작품은 LE에 NIDCD 부여 T32 DC000023에 의해 지원되었다

계란과 깐 배아는 마음에 든다고 윤리적 및 인도적으로 처리됩니다. 깐 배아 사용에 대한 모든 프로토콜은 의학, 볼티모어, 메릴랜드의 존스 홉킨스 대학에서 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 계란과 식 구조의 제조 <ol><li> 달걀 : <ol><li> 3 품어 - 4 다스 수정 된 닭고기 달걀 (갈 루스 갈 루스) 37 ° C에서 자신의 양쪽에 평평하게 누워. <ol><li> 배양 24 시간 후, 계란의 라운드 백 엔드에서 주사기와 알부민의 3 CC를 당겨 명확한 테이프로 구멍을 밀봉. 이 계란 (19)의 상단에 액세스를 위해 창을 절단 할 때 쉘을 고집 배아없이 배아에 대한 접근의 용이성을 허용, 배아와 껍질 사이에 공기 실을 만듭니다. </li><li> 배양 시간의 117 시간에서 햄버거와 해밀턴 (20) 발달 단계에 따라 배아를 무대E4 (HH24-25)에서 (그림 1D 참조). </li></ol></li></ol></li><li> 식 구축 : <ol><li> 시약을 사용하여 플라스미드 DNA와 시판 제제 키트 제조업체가 제공하는 프로토콜을 준비한다. 제제의 최종 단계에서, 500 ㎕의 TE (트리스 EDTA) 1.5 ㎖의 튜브에 키트에 제공된 버퍼에 DNA를 용출시킨다. </li><li> 에탄올을 3 M 아세트산 나트륨 50 μL 튜브 100 % 에탄올 1 ㎖을 첨가하여 농축하는 DNA를 침전. -20 ° CO / N에서 튜브를 놓습니다. </li><li> 4 ℃에서 14,000 rpm으로 30 분 동안 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 실온에서 10 분 동안 펠렛을 공기 건조. ~ 4 μg의 / μL의 농도를 산출한다 15 ㎕의 TE 버퍼에 펠렛을 용해. 참고 : 여기에 사용되는 제어 식 구조는 닭 β - 액틴 프로모터에 의해 구동된다 pMES-IRES-GFP (10), 또는 PCI-H2B-IRES-RFP 있습니다 <sCMV 프로모터에 의해 구동된다&gt; (10), 최대. </li></ol></li></ol> 비켜 마이크로 전기에와 비켜 세포 증식 분석 2. 닭 <ol><li> 발현 구조체 및 마이크로 일렉트로 비켜 마이크로 인젝션 조작에있어서 : <ol><li> 2.5 X 2.5 mm 상자 플래티넘 난방 필라멘트에 대해 다음과 최적화 된 매개 변수를 사용하여 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 미세 바늘로 유리 모세관 튜브를 당겨 : 압력 = 500, 열 = 600 ° C, 속도 = (105), 및 시간 = 64 당겨 = 150 밀리 초 (표 1 참조). </li><li> 왼쪽 및 현미경을 측면 오른 손잡이 마이크로 매니퓰레이터 단계는 설정 (그림 1A 참조). 오른쪽 손잡이 마이크로 매니퓰레이터는 유리 모세관 바늘과 왼손 마이크로 매니퓰레이터는 전극 (그림 1A)를 보유하고를 보유하고있다. </li><li> 절단에 의해 미세 주입을위한 미세 뽑아 유리 모세관 바늘을 준비겸자와 바늘의 끝은 현미경으로 작업하는 동안. </li><li> 현미경으로 작업하는 동안 0.1 % 빠른 그린으로 색을 칠한 플라스미드 DNA의 2.5 μL와 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 손으로 직접 바늘을 입력합니다. </li><li> (그림 1A 참조) 금형 / 계란 유지 장치 내 옆에 누워 계란을 놓습니다. 가위 19 (그림 1A)를 사용하여 계란의 상단에 둥근 창을 잘라. </li><li> 현미경으로 작업하는 동안주의 깊게 집게를 사용하여 배아를 오버레이 두 막을 엽니 다. </li><li> 현미경에서 작업하는 동안, 수동으로 미세 조작기를 사용하여 마이크로 일렉트로 오른손을 사용하여 마이크로 인젝션에 의해 오른쪽 귀 소포 루멘 플라스미드 DNA의 약 0.5 ~ μl를 제공한다. <ol><li> 동시에 왼손 머무르고 사용시 그래서 우측의 마이크로 매니퓰레이터 (도 1b-D)과 DNA와 오른쪽 귀 소포 루멘 마이크로 - 주입 수행태아의 머리가 단계 E4에서 딥 때문에 조지아 forcep는 배아의 머리를 안정합니다. 이 귀의 소포가 손상 될 수 있기 때문에, 귀의 소포 루멘 과거 마이크로 주입하지 마십시오. </li><li> 바로 마이크로 주사 후, 현미경으로 작업하는 동안, 양극 (양극) 백금 전극의 전방-복부 오른쪽 귀의 소포 및 병렬 부정적인 2mm 전극 (음극)에 2mm를 배치 왼쪽 미세 조작기를 사용 1mm 간격 (도 1 C 참조). 100 밀리 초 지속 시간 200 밀리 초 간격으로 12 V에서 4 펄스를 제공합니다. 왼쪽 귀의 소포는 내부 처리되지 않은 제어 역할을합니다. 참고 : 1X PBS에 담근 면봉 electroporations 사이에 전극을 청소합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 비켜 세포 증식 분석에서 : <ol><li> 즉시 전기 후 수동으로 전체에 50 μl의 에듀 솔루션을 놓아 0.25 밀리그램의 50 μl를 추가 / ㎖ EDU 1X PBS에서피펫을 사용하여 OVO의 배아. 테이프로 계란을 밀봉하고 18 일 동안 인큐베이터로 돌아 - 96 시간. </li><li> ( &#39;그림 1 EE 참조) 표준 형광 현미경을 사용하여 24 시간 - 조심스럽게 테이프를 제거하고 18 후 귀의 소포 내에서 형광 GFP 또는 RFP 신호의 배아를 확인합니다. 형광 시그널이있는 경우 ( &#39;FP도 1 참조),이 시점에서 분석을 위해 수확하거나 배아 테이프 봉인 및 수집 동안 인큐베이터로 돌아가서 이후 단계에서 분석한다. 참고 : - 7 시간 전기 10 후 pMES-IRES-GFP 구조와 GFP 신호의 발현은 6 분명하다. </li></ol></li></ol> 현장 하이브리드 및 면역 조직에서 RNA 3. 배아 수확 및 조직 처리 <ol><li> 집게를 사용하여 배아를 수확. 차가운 1X PBS에서 배아를 씻어. 목으로 머리를 절단하여, 배아의 머리를 제거4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드의 O / N로 머리를 집게를 사용하고 배치합니다. 헤드 내부의 4 % 파라 포름 알데히드의 침투를 허용하는 forcep을 이용하여 뇌에 구멍. </li><li> 4 ° C에서 O / N (1X PBS)에 30 % 자당의 머리를 탈수. </li><li> 드라이 아이스와 메틸 부탄 (2- 메틸 부탄)의 슬러리에 급속 냉동하여 cryoprotective 매체의 헤드를 탑재합니다. 대안 적으로, 신속한 액체 질소 cryoprotective 매체에 헤드를 고정. -80 ° C에 탑재 된 헤드를 저장합니다. </li><li> 12 μm의 두께 조직 섹션에 머리를 동결 절단 (Cryosections) 및 superfrosted 현미경 유리 슬라이드 위에 모든 내이 함유 조직 섹션을 수집합니다. </li><li> 이전 4,21 바와 같이 동일계 하이브리드 화 및 면역 조직 화학의 표준 RNA를 수행하고, 키트 제조업체가 제공하는 프로토콜은 다음 듀 세포 증식 분석. 주 : 머리 셀의 토끼 폴리 클로 날 사용하여 식별 될 수-α를 MyosinVIIa (Myo7a)을tibody (1 : 1000, 프로테우스 Biosciences 사)과 형광 표지 된 이차 항체 (1 : 250, 염소 항 - 토끼 AlexaFluor 488; 인비 트 로젠). </li></ol> 4. 이미지 캡처 및 처리 <ol><li> 디지털 이미징 장비와 이미지를 가져 가라. 표준 형광 현미경 (배의 배율 40 배까지) 표준 와이드 필드 현미경을 사용하여 현장에서의 결과와 이미지 면역 조직 화학 염색 결과. </li><li> 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리​​. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

오보 마이크로 일렉트로에서의 여기에 설명 된 방법은 현상 청각 기관으로의 유전자 전달에 대해 최적화되어있다. 그것은 일반적으로 유전자 기능 / 발현을 조작하는 데 사용되는 플라스미드 DNA 계 발현 벡터와 호환된다. E4에서 전기의 타이밍은 청각 기관에서는 HC 개발에 집중 조사에 적합하다. 가장 중요한 단계는 바늘 너무 깊이 가서 귀의 소포를 손상시키지 않고 귀의 소포 루멘...

포유류 및 조류 청각 감각 기관 사이의 형태 차이 및 세포 패턴에도 불구하고, 분자 요인과 감각 HC의 개발을 담당 경로는 진화 1-3 보존 될 것으로 생각된다. 청각의 HC와 그 주변으로 SC를 수용하는 기저 유두는, 내부 귀 otocyst의 outpocketing으로 개발하고 있습니다. 초기 HC 및 SC 조상의 풀은 귀의 placode / 귀 컵 신경 감각 능력 도메인 (NSD) 내에서 지정됩니다. 운명 매핑 데이터는 신경 및 감각 계통이 연결과 귀 컵의 안테 - 복부 지역에 위치한 나 마우스와 치킨 4,5에 otocyst NSD에서 발생된다는 증거를 제공. 먼저 neuroblasts 결국 청각 및 전정 신경으로 분할 청각-전정 신경절의 뉴런을 야기 할 NSD로부터 박리. 이 신경은 뇌간에있는 내이 및 핵의 감각의 HC를 신경을 분포시키다. 세포 일NSD에 남아있는 열 변환 - 기계 감각의 HC 및 연관된으로 SC 구성된 청각의 감각 기관을 포함하는 다양한 관능 패치를 야기 할 것으로 생각된다. 병아리와 쥐 모두에서, 청각 기관의 감각 전구 세포주기 출구와 HC 차별화 그라디언트 반대에서 발생합니다. 병아리 청각 전구 세포주기 종료 ~ E5 주위 시작 기저부로부터 꼭지점까지 진행하고, 중심으로부터 외주 6. 어느 날 이후, HC 차별화가 정점에서 시작베이스 (7)에 진행한다. 작용 메커니즘이 복잡한 수술을 필요로 다른 모델 시스템에서의 자궁에 배아 조작 반대로 오보에서 비교적 용이하게 조사 할 수 있기 때문에 닭 내이의 개발 공부 많은 기술적 장점을 제공한다. 여기에 설명 된 방법은 추정 basila에 대한 관심의 유전자를 대상으로 비켜 마이크로 전기에 사용특히 E4에 귀의 소포의 연구 유두 영역 전방 - 복부. OVO의 전기가 잘 설립하고 일반적으로 8-14를 사용하는 기술이다. 일렉트로 기술의 원리는 뉴클레오티드 (예를 들면, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 또는 RNA 올리고 뉴클레오티드) 음으로 하전된다는 사실에 기초한다. 한 DNA는 관심있는 조직으로 주입된다. 전류는 조직을 통해 배치 될 때, 전류는 셀 벽에서 과도 모공을 열어 상기 음으로 하전 된 DNA는 양극 (애노드)을 향하여 흐를 때 상기 DNA의 흡수를 허용한다. 이득의 기능 실험을 위해, 관심의 유전자는 일반적으로 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP)에 적합한 발현 카세트를 포함하는 발현 플라스미드에 서브 클로닝된다. 손실의 기능 실험 플라스미드 기반의 지배적 인 부정적인 리프레 구조, 또는 RNAi의, 또는 모르 폴리 노의 구조를 들어 C는ommonly는 15, 16을 사용했다. 플라스미드 계 전형적 마이크로 RNA (miRNA의) 기능의 miRNAs 스폰지 구조를 억제하기 위해 17 사용될 수있다. 오보 마이크로 전기 천공 방법에서의 용이 전체 배아 듀를 추가 오보 세포 증식 분석에서 결합 될 수있는 여기에 기술 된 방법은 청각 기관의 증식 및 분화를 조절하는 분자 메커니즘을 조사 할 수있다. 일렉트로과 에두의 추가는 어느 날 청각 기관의 세포주기 출구의 시작 앞에있는 귀의 소포에 E4에서 수행됩니다. 일반적으로 18 수행되는 청각 기관의 분석 - (HC 분화시) E5 (감각 전구 세포주기 출구의 시작), E6 (HC 차별화의 시작)와 E7에서 전기 후 96 시간을; 이상 ~ E9 (HC 차별화 끝)까지. 유전자 전달이 전기 천공 방법은 ~ 4 일 정도 지속 일시적인 becauSE는 관심 유전자가 게놈 내로 통합되지 않지만, 상기 방법은 TOL2 매개 유전자 전달 (11)의 게놈 내로 통합하는 능력이 있는가 적절한 플라스미드 DNA 계 발현 벡터와 함께 사용하기 위해 적용 가능하다. 이 방법 강력한 GFP 또는 RFP 발현 지속 ~로 신호를 가리 페이드, 아직 청각 기관의 복잡한 현상을 연구하기 위해 충분한 시간 창을 제공 한 후, 달팽이관 4 일. 비켜 유전자 전달 방법이 소설 특히 청각 기관에 HC 개발에 초점 조사에 최적입니다 E4에서 추정 청각 기관을 대상으로 할 수 있습니다. 훨씬 이하의 개발 단계 (11, 12) 또는 기저 관내 유두 이식편 배양 물 (18)의 사용에 비해 electroporate 다른 방법에 좋은 재료이다.

<table><tbody><tr><td>Sterile 1x PBS pH 7.4</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Powder</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>EdU Powder</td><td>Invitrogen</td><td>E10187</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10338</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 ElectroSquarePorator&amp;nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banana to Micrograbber Cable Kit</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Right Handed &amp;amp; Left Handed Micromanipulators</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>M3301R &amp;amp; M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Metal Steel Base Plate 12x24 inch</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Micropippette Puller for pulling needles</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Glass Syringe 100 &amp;mu;l</td><td>Hamilton</td><td>80601 Model 710LT</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>427420 Intramedic Clay Adams Brand</td><td></td></tr><tr><td>3 cc Disposable Syringes</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Disposable 21 Gauge Needles</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>One pair of 2 mm Platinum Electrodes</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY611P3-2</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Holder</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY580</td><td></td></tr><tr><td>One pair of Dumont fine forceps number 5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matte finish invisible tape for sealing eggs</td><td>Office Depot</td><td>520-928</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-Tipped Swabs</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filter tips</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation

닭 배아 유전자 기능의 조작은 오보에서 비교적 용이하게 수행 될 수있는 배아 발달 공부 이상적인 모델 시스템이다. 내이의 청각 감각 기관들을 수있는 우리의 능력 중요합니다. 그것은 지원 세포 (희주) 아교와 같은 고도로 전문화 된 감각 HCS () - 기계 열 변환 유모 세포로 구성되어 상피와 주변 주택. 청각 기관의 구조적인 차이에도 불구하고, 청각 기관의 발달을 조절하는 분자 메커니즘이 진화 포유 동물과 AVES 사이에 보존되어 비켜 전기에서 E1의 초기 단계에 크게 제한된다 -. E3. 때문에 E5의 청각 기관의 상대적으로 늦게 개발, E3 과거 비켜 전기에 의한 청각 기관의 조작으로 인해 나중 단계에서 닭 배아의 고급 개발에 어렵습니다. 여기에 제시된 방법은 관심 유전자를 타겟팅하는 일시적 유전자 전달 방법단계 E4 - 비켜 마이크로 전기의를 통해 개발 치킨 청각 감각 기관에 E4.5. 이 방법은 이득 - 및 상실 함수 종래의 플라스미드 DNA 계 발현 벡터를 적용하고 상기 전체 배아 EDU (5-에 티닐 -2&#39;- 데 옥시 우리 딘)을 첨가하여 오보 세포 증식 분석에서 결합 될 수있다 전기의 시간입니다. 녹색 또는 적색 형광 단백질 (GFP 또는 RFP) 발현 플라스미드의 사용은 실험 신속 전기 성공적 현상 내이의 청각 부를 대상 여부를 판단 할 수있다. 이 방법 논문에서는 GFP 전기 천공 표본의 대표적인 예는 예시; 전기 후 96 시간과 청각 기관의 프로 감각 영역에 GFP의 대상은 현장 하이브리드의 RNA에 의해 확인되었다 - 배아는 18을 수확했다. 이 방법은 종이 셀 prolif를 분석 듀 아날로그 티미 딘의 사용을 위해 최적화 된 프로토콜을 제공한다eration; 면역 라벨링을 결합 듀 화학을 클릭했을 듀 계 세포 증식 분석의 예를 제공한다.

녹색 형광 단백질로 구성된이 방법 종이 플라스미드 DNA에서 (GFP) 발현 카세트는 ~를 산출, 12 V 4 100 밀리 초 펄스 폭과 펄스와 200 밀리 초 간격의 최적화 된 매개 변수를 사용하여 개발 치킨 기저 돌기 (BP)에 대상이되었다 50 % 태아 생존율 및 BP에 타겟팅 플라스미드 DNA의 효율. (; 흰색 화살표 그림 1 EE &#39;)와 GFP 발현 시간 걸쳐 올 수 있습니다 배아를 개발 기본 G...

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Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

gene-transfer-into-chicken-auditory-organ-ovo-micro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

9.4K 조회수.  The Johns Hopkins University, School of Medicine. The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ. 

비디오: Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

연구

발생학

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

HH 스테이지 10 치킨 태아의 비켜 Electroporations에서

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

생물학

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송<em&gt; VIVO에서</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

신경과학

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

복부 병아리 중뇌에있는 마이크로 RNA의 오보, 식

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

배아 칙의 망막에서 비켜 Electroporation에

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

에 의한 이전 치킨 태아에 유전자 이체<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to aberrant neuronal and synaptic activities in fragile X syndrome (FXS), which is characterized by intellectual disability, sensory abnormalities, and social communication problems. Studies of FMRP function and FXS pathogenesis have primarily been conducted with Fmr1 (the gene encoding FMRP) knockout in transgenic animals. Here we report an in vivo method for determining the cell-autonomous function of FMRP during the period of circuit assembly and synaptic formation using chicken embryos. This method employs stage-, site-, and direction-specific electroporation of a drug-inducible vector system containing Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) and an EGFP reporter. With this method, we achieved selective FMRP knockdown in the auditory ganglion (AG) and in one of its brainstem targets, the nucleus magnocellularis (NM), thus providing a component-specific manipulation within the AG-NM circuit. Additionally, the mosaic pattern of the transfection allows within-animal controls and neighboring neuron/fiber comparisons for enhanced reliability and sensitivity in data analyzing. The inducible vector system provides temporal control of gene editing onset to minimize accumulating developmental effects. The combination of these strategies provides an innovative tool to dissect the cell-autonomous function of FMRP in synaptic and circuit development.

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Using in ovo electroporation, we devised a method to selectively transfect the auditory inner ear and cochlear nucleus in chicken embryos to achieve a cell-group-specific knockdown of fragile X mental retardation protein during discrete periods of circuit assembly.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한

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