우리는 발현 플라스미드과 현장 프로브 박사 도리스 K. 우 감사, 감각 생물 이미징 시설의 존스 홉킨스 대학 센터와 청력과 균형을위한 센터. 이 작품은 LE에 NIDCD 부여 T32 DC000023에 의해 지원되었다

계란과 깐 배아는 마음에 든다고 윤리적 및 인도적으로 처리됩니다. 깐 배아 사용에 대한 모든 프로토콜은 의학, 볼티모어, 메릴랜드의 존스 홉킨스 대학에서 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 계란과 식 구조의 제조 <ol><li> 달걀 : <ol><li> 3 품어 - 4 다스 수정 된 닭고기 달걀 (갈 루스 갈 루스) 37 ° C에서 자신의 양쪽에 평평하게 누워. <ol><li> 배양 24 시간 후, 계란의 라운드 백 엔드에서 주사기와 알부민의 3 CC를 당겨 명확한 테이프로 구멍을 밀봉. 이 계란 (19)의 상단에 액세스를 위해 창을 절단 할 때 쉘을 고집 배아없이 배아에 대한 접근의 용이성을 허용, 배아와 껍질 사이에 공기 실을 만듭니다. </li><li> 배양 시간의 117 시간에서 햄버거와 해밀턴 (20) 발달 단계에 따라 배아를 무대E4 (HH24-25)에서 (그림 1D 참조). </li></ol></li></ol></li><li> 식 구축 : <ol><li> 시약을 사용하여 플라스미드 DNA와 시판 제제 키트 제조업체가 제공하는 프로토콜을 준비한다. 제제의 최종 단계에서, 500 ㎕의 TE (트리스 EDTA) 1.5 ㎖의 튜브에 키트에 제공된 버퍼에 DNA를 용출시킨다. </li><li> 에탄올을 3 M 아세트산 나트륨 50 μL 튜브 100 % 에탄올 1 ㎖을 첨가하여 농축하는 DNA를 침전. -20 ° CO / N에서 튜브를 놓습니다. </li><li> 4 ℃에서 14,000 rpm으로 30 분 동안 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 실온에서 10 분 동안 펠렛을 공기 건조. ~ 4 μg의 / μL의 농도를 산출한다 15 ㎕의 TE 버퍼에 펠렛을 용해. 참고 : 여기에 사용되는 제어 식 구조는 닭 β - 액틴 프로모터에 의해 구동된다 pMES-IRES-GFP (10), 또는 PCI-H2B-IRES-RFP 있습니다 <sCMV 프로모터에 의해 구동된다&gt; (10), 최대. </li></ol></li></ol> 비켜 마이크로 전기에와 비켜 세포 증식 분석 2. 닭 <ol><li> 발현 구조체 및 마이크로 일렉트로 비켜 마이크로 인젝션 조작에있어서 : <ol><li> 2.5 X 2.5 mm 상자 플래티넘 난방 필라멘트에 대해 다음과 최적화 된 매개 변수를 사용하여 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 미세 바늘로 유리 모세관 튜브를 당겨 : 압력 = 500, 열 = 600 ° C, 속도 = (105), 및 시간 = 64 당겨 = 150 밀리 초 (표 1 참조). </li><li> 왼쪽 및 현미경을 측면 오른 손잡이 마이크로 매니퓰레이터 단계는 설정 (그림 1A 참조). 오른쪽 손잡이 마이크로 매니퓰레이터는 유리 모세관 바늘과 왼손 마이크로 매니퓰레이터는 전극 (그림 1A)를 보유하고를 보유하고있다. </li><li> 절단에 의해 미세 주입을위한 미세 뽑아 유리 모세관 바늘을 준비겸자와 바늘의 끝은 현미경으로 작업하는 동안. </li><li> 현미경으로 작업하는 동안 0.1 % 빠른 그린으로 색을 칠한 플라스미드 DNA의 2.5 μL와 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 손으로 직접 바늘을 입력합니다. </li><li> (그림 1A 참조) 금형 / 계란 유지 장치 내 옆에 누워 계란을 놓습니다. 가위 19 (그림 1A)를 사용하여 계란의 상단에 둥근 창을 잘라. </li><li> 현미경으로 작업하는 동안주의 깊게 집게를 사용하여 배아를 오버레이 두 막을 엽니 다. </li><li> 현미경에서 작업하는 동안, 수동으로 미세 조작기를 사용하여 마이크로 일렉트로 오른손을 사용하여 마이크로 인젝션에 의해 오른쪽 귀 소포 루멘 플라스미드 DNA의 약 0.5 ~ μl를 제공한다. <ol><li> 동시에 왼손 머무르고 사용시 그래서 우측의 마이크로 매니퓰레이터 (도 1b-D)과 DNA와 오른쪽 귀 소포 루멘 마이크로 - 주입 수행태아의 머리가 단계 E4에서 딥 때문에 조지아 forcep는 배아의 머리를 안정합니다. 이 귀의 소포가 손상 될 수 있기 때문에, 귀의 소포 루멘 과거 마이크로 주입하지 마십시오. </li><li> 바로 마이크로 주사 후, 현미경으로 작업하는 동안, 양극 (양극) 백금 전극의 전방-복부 오른쪽 귀의 소포 및 병렬 부정적인 2mm 전극 (음극)에 2mm를 배치 왼쪽 미세 조작기를 사용 1mm 간격 (도 1 C 참조). 100 밀리 초 지속 시간 200 밀리 초 간격으로 12 V에서 4 펄스를 제공합니다. 왼쪽 귀의 소포는 내부 처리되지 않은 제어 역할을합니다. 참고 : 1X PBS에 담근 면봉 electroporations 사이에 전극을 청소합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 비켜 세포 증식 분석에서 : <ol><li> 즉시 전기 후 수동으로 전체에 50 μl의 에듀 솔루션을 놓아 0.25 밀리그램의 50 μl를 추가 / ㎖ EDU 1X PBS에서피펫을 사용하여 OVO의 배아. 테이프로 계란을 밀봉하고 18 일 동안 인큐베이터로 돌아 - 96 시간. </li><li> ( &#39;그림 1 EE 참조) 표준 형광 현미경을 사용하여 24 시간 - 조심스럽게 테이프를 제거하고 18 후 귀의 소포 내에서 형광 GFP 또는 RFP 신호의 배아를 확인합니다. 형광 시그널이있는 경우 ( &#39;FP도 1 참조),이 시점에서 분석을 위해 수확하거나 배아 테이프 봉인 및 수집 동안 인큐베이터로 돌아가서 이후 단계에서 분석한다. 참고 : - 7 시간 전기 10 후 pMES-IRES-GFP 구조와 GFP 신호의 발현은 6 분명하다. </li></ol></li></ol> 현장 하이브리드 및 면역 조직에서 RNA 3. 배아 수확 및 조직 처리 <ol><li> 집게를 사용하여 배아를 수확. 차가운 1X PBS에서 배아를 씻어. 목으로 머리를 절단하여, 배아의 머리를 제거4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드의 O / N로 머리를 집게를 사용하고 배치합니다. 헤드 내부의 4 % 파라 포름 알데히드의 침투를 허용하는 forcep을 이용하여 뇌에 구멍. </li><li> 4 ° C에서 O / N (1X PBS)에 30 % 자당의 머리를 탈수. </li><li> 드라이 아이스와 메틸 부탄 (2- 메틸 부탄)의 슬러리에 급속 냉동하여 cryoprotective 매체의 헤드를 탑재합니다. 대안 적으로, 신속한 액체 질소 cryoprotective 매체에 헤드를 고정. -80 ° C에 탑재 된 헤드를 저장합니다. </li><li> 12 μm의 두께 조직 섹션에 머리를 동결 절단 (Cryosections) 및 superfrosted 현미경 유리 슬라이드 위에 모든 내이 함유 조직 섹션을 수집합니다. </li><li> 이전 4,21 바와 같이 동일계 하이브리드 화 및 면역 조직 화학의 표준 RNA를 수행하고, 키트 제조업체가 제공하는 프로토콜은 다음 듀 세포 증식 분석. 주 : 머리 셀의 토끼 폴리 클로 날 사용하여 식별 될 수-α를 MyosinVIIa (Myo7a)을tibody (1 : 1000, 프로테우스 Biosciences 사)과 형광 표지 된 이차 항체 (1 : 250, 염소 항 - 토끼 AlexaFluor 488; 인비 트 로젠). </li></ol> 4. 이미지 캡처 및 처리 <ol><li> 디지털 이미징 장비와 이미지를 가져 가라. 표준 형광 현미경 (배의 배율 40 배까지) 표준 와이드 필드 현미경을 사용하여 현장에서의 결과와 이미지 면역 조직 화학 염색 결과. </li><li> 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리​​. </li></ol>

<ol>
	<li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken.">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).</li><li>Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+mammalian+cochlea.">Patterning of the mammalian cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).</li><li>Whitfield, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+inner+ear.">Development of the inner ear.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 32, 112-118 (2015).</li><li>Raft, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-regulation+of+Ngn1+and+Math1+coordinates+the+production+of+neurons+and+sensory+hair+cells+during+inner+ear+development.">Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development.</a> Development. 134, 4405-4415 (2007).</li><li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+the+relationships+between+mechanosensory+cells+and+the+neurons+that+innervate+them+in+the+chicken+ear.">Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear.</a> Development. 132, 1687-1697 (2005).</li><li>Katayama, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+production+in+the+chicken+cochlea.">Cell production in the chicken cochlea.</a> The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).</li><li>Cotanche, D. A., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+stereociliary+bundles+in+the+cochlear+duct+of+chick+embryos.">The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos.</a> Brain Res. 318, 181-193 (1984).</li><li>Alsina, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+is+required+for+determination+of+otic+neuroblasts+in+the+chick+embryo.">FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo.</a> Developmental biology. 267, 119-134 (2004).</li><li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp4+is+essential+for+the+formation+of+the+vestibular+apparatus+that+detects+angular+head+movements.">Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements.</a> PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).</li><li>Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2-mediated+gene+transfer+and+in+ovo+electroporation+of+the+otic+placode:+a+powerful+and+versatile+approach+for+investigating+embryonic+development+and+regeneration+of+the+chicken+inner+ear.">Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear.</a> Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).</li><li>Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id+gene+regulation+and+function+in+the+prosensory+domains+of+the+chicken+inner+ear:+a+link+between+Bmp+signaling+and+Atoh1.">Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).</li><li>Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+Sox2+and+Sox3+in+neuronal+and+sensory+progenitors+of+the+developing+inner+ear+of+the+chick.">Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick.</a> The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).</li><li>Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prosensory+function+of+Sox2+in+the+chicken+inner+ear+relies+on+the+direct+regulation+of+Atoh1.">The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1.</a> PLoS One. 7, 30871 (2012).</li><li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental biology. 294, 554-563 (2006).</li><li>Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neural+crest+cell+alphaN-catenin+impacts+chick+trigeminal+ganglia+formation.">Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation.</a> Developmental biology. 392, 295-307 (2014).</li><li>Kumar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+non-small+cell+lung+tumor+development+by+the+let-7+microRNA+family.">Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).</li><li>Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+regulates+development+and+transdifferentiation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+basilar+papilla.">Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla.</a> Hearing research. 289, 27-39 (2012).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e306 (2007).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+in+the+developing+vestibular+and+auditory+sensory+organs.">Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).</li><li>Bell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+segregation+of+auditory+and+vestibular+neurons+in+the+otic+placode.">Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode.</a> Developmental biology. 322, 109-120 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

오보 마이크로 일렉트로에서의 여기에 설명 된 방법은 현상 청각 기관으로의 유전자 전달에 대해 최적화되어있다. 그것은 일반적으로 유전자 기능 / 발현을 조작하는 데 사용되는 플라스미드 DNA 계 발현 벡터와 호환된다. E4에서 전기의 타이밍은 청각 기관에서는 HC 개발에 집중 조사에 적합하다. 가장 중요한 단계는 바늘 너무 깊이 가서 귀의 소포를 손상시키지 않고 귀의 소포 루멘...

포유류 및 조류 청각 감각 기관 사이의 형태 차이 및 세포 패턴에도 불구하고, 분자 요인과 감각 HC의 개발을 담당 경로는 진화 1-3 보존 될 것으로 생각된다. 청각의 HC와 그 주변으로 SC를 수용하는 기저 유두는, 내부 귀 otocyst의 outpocketing으로 개발하고 있습니다. 초기 HC 및 SC 조상의 풀은 귀의 placode / 귀 컵 신경 감각 능력 도메인 (NSD) 내에서 지정됩니다. 운명 매핑 데이터는 신경 및 감각 계통이 연결과 귀 컵의 안테 - 복부 지역에 위치한 나 마우스와 치킨 4,5에 otocyst NSD에서 발생된다는 증거를 제공. 먼저 neuroblasts 결국 청각 및 전정 신경으로 분할 청각-전정 신경절의 뉴런을 야기 할 NSD로부터 박리. 이 신경은 뇌간에있는 내이 및 핵의 감각의 HC를 신경을 분포시키다. 세포 일NSD에 남아있는 열 변환 - 기계 감각의 HC 및 연관된으로 SC 구성된 청각의 감각 기관을 포함하는 다양한 관능 패치를 야기 할 것으로 생각된다. 병아리와 쥐 모두에서, 청각 기관의 감각 전구 세포주기 출구와 HC 차별화 그라디언트 반대에서 발생합니다. 병아리 청각 전구 세포주기 종료 ~ E5 주위 시작 기저부로부터 꼭지점까지 진행하고, 중심으로부터 외주 6. 어느 날 이후, HC 차별화가 정점에서 시작베이스 (7)에 진행한다. 작용 메커니즘이 복잡한 수술을 필요로 다른 모델 시스템에서의 자궁에 배아 조작 반대로 오보에서 비교적 용이하게 조사 할 수 있기 때문에 닭 내이의 개발 공부 많은 기술적 장점을 제공한다. 여기에 설명 된 방법은 추정 basila에 대한 관심의 유전자를 대상으로 비켜 마이크로 전기에 사용특히 E4에 귀의 소포의 연구 유두 영역 전방 - 복부. OVO의 전기가 잘 설립하고 일반적으로 8-14를 사용하는 기술이다. 일렉트로 기술의 원리는 뉴클레오티드 (예를 들면, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 또는 RNA 올리고 뉴클레오티드) 음으로 하전된다는 사실에 기초한다. 한 DNA는 관심있는 조직으로 주입된다. 전류는 조직을 통해 배치 될 때, 전류는 셀 벽에서 과도 모공을 열어 상기 음으로 하전 된 DNA는 양극 (애노드)을 향하여 흐를 때 상기 DNA의 흡수를 허용한다. 이득의 기능 실험을 위해, 관심의 유전자는 일반적으로 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP)에 적합한 발현 카세트를 포함하는 발현 플라스미드에 서브 클로닝된다. 손실의 기능 실험 플라스미드 기반의 지배적 인 부정적인 리프레 구조, 또는 RNAi의, 또는 모르 폴리 노의 구조를 들어 C는ommonly는 15, 16을 사용했다. 플라스미드 계 전형적 마이크로 RNA (miRNA의) 기능의 miRNAs 스폰지 구조를 억제하기 위해 17 사용될 수있다. 오보 마이크로 전기 천공 방법에서의 용이 전체 배아 듀를 추가 오보 세포 증식 분석에서 결합 될 수있는 여기에 기술 된 방법은 청각 기관의 증식 및 분화를 조절하는 분자 메커니즘을 조사 할 수있다. 일렉트로과 에두의 추가는 어느 날 청각 기관의 세포주기 출구의 시작 앞에있는 귀의 소포에 E4에서 수행됩니다. 일반적으로 18 수행되는 청각 기관의 분석 - (HC 분화시) E5 (감각 전구 세포주기 출구의 시작), E6 (HC 차별화의 시작)와 E7에서 전기 후 96 시간을; 이상 ~ E9 (HC 차별화 끝)까지. 유전자 전달이 전기 천공 방법은 ~ 4 일 정도 지속 일시적인 becauSE는 관심 유전자가 게놈 내로 통합되지 않지만, 상기 방법은 TOL2 매개 유전자 전달 (11)의 게놈 내로 통합하는 능력이 있는가 적절한 플라스미드 DNA 계 발현 벡터와 함께 사용하기 위해 적용 가능하다. 이 방법 강력한 GFP 또는 RFP 발현 지속 ~로 신호를 가리 페이드, 아직 청각 기관의 복잡한 현상을 연구하기 위해 충분한 시간 창을 제공 한 후, 달팽이관 4 일. 비켜 유전자 전달 방법이 소설 특히 청각 기관에 HC 개발에 초점 조사에 최적입니다 E4에서 추정 청각 기관을 대상으로 할 수 있습니다. 훨씬 이하의 개발 단계 (11, 12) 또는 기저 관내 유두 이식편 배양 물 (18)의 사용에 비해 electroporate 다른 방법에 좋은 재료이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:621px;">Sterile 1x PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:249px;">gibco</td>
			<td style="width:259px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green FCF Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EdU Powder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E10187</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10338</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">12643</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECM 830 ElectroSquarePorator&#160;</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Banana to Micrograbber Cable Kit</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0216</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Right Handed &#38; Left Handed Micromanipulators</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.&#160;</td>
			<td>M3301R &#38; M3301L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.&#160;</td>
			<td>M10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal Steel Base Plate 12x24 inch</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.&#160;</td>
			<td align="right">5479</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.&#160;</td>
			<td align="right">14120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropippette Puller for pulling needles</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm</td>
			<td>FHC</td>
			<td>27-30-0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton Glass Syringe 100 &#956;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601 Model 710LT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O122-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>427420 Intramedic Clay Adams Brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 cc Disposable Syringes</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td align="right">309657</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable 21 Gauge Needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td align="right">305122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One pair of 2 mm Platinum Electrodes</td>
			<td>Bulldog Bio. / Nepagene</td>
			<td>CUY611P3-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode Holder</td>
			<td>Bulldog Bio. / Nepagene</td>
			<td>CUY580</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One pair of Dumont fine forceps number 5</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matte finish invisible tape for sealing eggs</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>520-928</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cotton-Tipped Swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile filter tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation

닭 배아 유전자 기능의 조작은 오보에서 비교적 용이하게 수행 될 수있는 배아 발달 공부 이상적인 모델 시스템이다. 내이의 청각 감각 기관들을 수있는 우리의 능력 중요합니다. 그것은 지원 세포 (희주) 아교와 같은 고도로 전문화 된 감각 HCS () - 기계 열 변환 유모 세포로 구성되어 상피와 주변 주택. 청각 기관의 구조적인 차이에도 불구하고, 청각 기관의 발달을 조절하는 분자 메커니즘이 진화 포유 동물과 AVES 사이에 보존되어 비켜 전기에서 E1의 초기 단계에 크게 제한된다 -. E3. 때문에 E5의 청각 기관의 상대적으로 늦게 개발, E3 과거 비켜 전기에 의한 청각 기관의 조작으로 인해 나중 단계에서 닭 배아의 고급 개발에 어렵습니다. 여기에 제시된 방법은 관심 유전자를 타겟팅하는 일시적 유전자 전달 방법단계 E4 - 비켜 마이크로 전기의를 통해 개발 치킨 청각 감각 기관에 E4.5. 이 방법은 이득 - 및 상실 함수 종래의 플라스미드 DNA 계 발현 벡터를 적용하고 상기 전체 배아 EDU (5-에 티닐 -2&#39;- 데 옥시 우리 딘)을 첨가하여 오보 세포 증식 분석에서 결합 될 수있다 전기의 시간입니다. 녹색 또는 적색 형광 단백질 (GFP 또는 RFP) 발현 플라스미드의 사용은 실험 신속 전기 성공적 현상 내이의 청각 부를 대상 여부를 판단 할 수있다. 이 방법 논문에서는 GFP 전기 천공 표본의 대표적인 예는 예시; 전기 후 96 시간과 청각 기관의 프로 감각 영역에 GFP의 대상은 현장 하이브리드의 RNA에 의해 확인되었다 - 배아는 18을 수확했다. 이 방법은 종이 셀 prolif를 분석 듀 아날로그 티미 딘의 사용을 위해 최적화 된 프로토콜을 제공한다eration; 면역 라벨링을 결합 듀 화학을 클릭했을 듀 계 세포 증식 분석의 예를 제공한다.

녹색 형광 단백질로 구성된이 방법 종이 플라스미드 DNA에서 (GFP) 발현 카세트는 ~를 산출, 12 V 4 100 밀리 초 펄스 폭과 펄스와 200 밀리 초 간격의 최적화 된 매개 변수를 사용하여 개발 치킨 기저 돌기 (BP)에 대상이되었다 50 % 태아 생존율 및 BP에 타겟팅 플라스미드 DNA의 효율. (; 흰색 화살표 그림 1 EE &#39;)와 GFP 발현 시간 걸쳐 올 수 있습니다 배아를 개발 기본 G...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation at JoVE.com

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

gene-transfer-into-chicken-auditory-organ-ovo-micro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

9.4K 조회수.  The Johns Hopkins University, School of Medicine. The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ. 

비디오: Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation에 접근

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

연구

발생학

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

유전자 발현에 영향을 미치는 신호 전달 진학을 확인하기 위해 닭 배아 사지 개발에 구슬의 접목

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

소설<em&gt; 예 비켜</em&gt; 밴딩 기법 닭 배아 시스템에서 심장 내 혈류를 변경할

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 Organotypic 문화

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The continuously growing mouse incisor provides an excellent model to study tissue-specific stem cells. The epithelial tissue-specific stem cells of the incisor are located at the proximal end of the tooth in a niche called the cervical loop. They provide a continuous influx of cells to counterbalance the constant abrasion of the self-sharpening tip of the tooth. Presented here is a detailed protocol for the isolation and culture of the proximal end of the mouse incisor that houses stem cells and their niche. This is a modified Trowell-type organ culture protocol that enables in vitro culture of tissue pieces (explants), as well as the thick tissue slices at the liquid/air interface on a filter supported by a metal grid. The organ culture protocol described here enables tissue manipulations not feasible in vivo, and when combined with the use of a fluorescent reporter(s), it provides a platform for the identification and tracking of discrete cell populations in live tissues over time, including stem cells. Various regulatory molecules and pharmacological compounds can be tested in this system for their effect on stem cells and their niches. This ultimately provides a valuable tool to study stem cell regulation and maintenance.

The Trowell-type organ culture method has been used to unravel complex signaling networks that govern tooth development and, more recently, for studying regulation involved in stem cells of the continuously growing mouse incisor. Fluorescent-reporter animal models and live-imaging methods facilitate in-depth analyses of dental stem cells and their specific niche microenvironment.

치아 줄기 세포의 조절 연구를 위한 트로웰형 장기 배양 사용

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

인슐린 생성 세포로 분화를 위한 쥐 지방조직 중간엽 줄기세포의 분리

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :