이 프로토콜은 Wellcome 신탁 기금하에 개발되었습니다. 우리는 플라이 주식을 유지하고 년간 플라이 음식을 준비를 위해 양 모린은 싱클레어 감사드립니다. 우리는 또한이 프로토콜의 개발에 그의 도움 및 기술 지원을위한 씨 마이클 Aitchison 감사드립니다.

1. 유전자 변형 파리 및 유지 관리 <ol><li> 유전자 변형이 데모에서 사용되는 쳐냈습니다 : Ubq-GFP-Cdc20 (II), Ubq-RFP-His2B (X *); Ubq-GFP-Cdc20 (II *), Ubq-GFP-Cdc20 (II *); mad2 어이 ( III *) 및 Ubq-GFP-Cdc20 유전자 변형은 빠르다는 이전 표준 P-요소 매개 유전자 변형 접근법 10,11 및 Ubq-RFP-His2B가 UMR 144 CNRS / 연구소 퀴리의 Yohanns Belaïche에서 일종의 선물이다를 통해 실험실에서 생성된 프랑스 파리. 그들은 표준 Drosophila 유전자를 통해 Mad2 돌연변 배경으로 도입되었습니다. mad2 어이 원래 돌연변이 라인은 블루밍턴 주식 센터에서 구입했습니다. 우리는이 프로토콜에 transformants을 높이기 위해 사용되는 절차를 논의하지 않습니다. 참고 : * 염색체 수를 나타냅니다. </li><li> 유지 보수 : 트렌스 제닉 파리는 25 살에 유지되었다 플라스틱 튜브 containin에서 ° CG는 음식을 비행기 맨 위에 추가적인 건조 효모 분말로. 유리병은 일상적으로 성장 조건 (그림 1)에 따라 모든 3-4주 대체되었습니다. </li></ol> 2. (연구소 규모) 식품 준비 들아 <ol><li> 파리 식품 혼합의 적절한 금액은 구성 요소를 분해하기 위해 끊임없이 저어로 가열되었다. </li><li> 이 매체의 8-10 약 ML은 Jencons 과학 (주) 연동 펌프를 사용하여 각 플라스틱 약병 (2.5 cm 직경 X 8cm 길이)에 슬러리로 배포되었다. </li><li> 식품 슬러리가 설정되었고 실온으로 냉각되면 유리병 그런 다음 면화 폼 플러그로 연결됩니다. 이러한 음식 튜브 그런 다음 비닐 봉투에 밀봉하고 ° C에서 나중에 사용하기 위해 4에서 유지됩니다 트레이에 배치됩니다. </li></ol> 3. 소규모 에그 모음 <ol><li> 2~3일 오래된 파리 성충의 약 50 쌍은 레이에 대해 25 표면에 대한 추가적인 건조 효모 분말 함께 제공된 신선한 플라이 식품 유리병 ° C로 전송된배아를 접근한. </li><li> 파리 그런 다음 신선한 유리병에 매 시간마다 양도 및 핵 점차 피질로 마이 그 레이션하는 경우 수집된 배아 중 일부는 핵 분열주기 8-10 주위에 세 있도록 30 분 동안 유리병에 배아를 떠나으로 구성되어 있습니다 단일 단일층. 그것이 종종 조건이 누워 적합하지 다닐 때 여성의 신체에 유지되었다 노인 배아가 들어 있으므로 첫 번째 시간 컬렉션은 정상적으로 삭제됩니다. </li></ol> 4. Coverslips 및 슬라이드 준비 <ol><li> 50 X 22mm의 coverslip를 꺼내서 약간 촉촉한 고급 펜 브러쉬와 현미경 슬라이드상에 올려놓을 사용하여 물을 아주 작은 양의 한쪽에 미치는 네 모퉁이에 오줌 그래서 그걸로 coverslip 때문에 모세관 표면 장력으로 이동하지 않는 얇은 액체 필름에 의해 발생. </li><li> coverslip의 중간에 걸쳐 헵탄 접착제의 얇은 스트립을 적용, 헵탄는 coverslip에 접착제를 떠나 초 단위로 증발한다. </li><li>작은 사각형 (~ 1.5 mm 2)에 다이아몬드 펜으로 다른 coverslip을 잘라 하나를 픽업하고 접착제 스트립의 한쪽 끝을 (이것은 microinjection이 필요한 경우 바늘 끝을 여는 데 사용되는)에 배치하고 미래를위한 다른 저장 사용합니다. </li><li> 다른 현미경 슬라이드를 타고 커버 용지 오프 약 2 cm 거기에 길고 껍질 양면 스티커 테이프 조각을 꽂다. (그림 2A &amp; B를 참조). </li></ol> 5. Dechorionate 태아 <ol><li> 신선한 식품 유리병에 파리를 전송하고 계란이 밖으로 확산 수 있도록하는 액체의 적절한 금액으로 슬라이드에 양면 스티커 테이프에 50 알을 전송 moistened 고급 펜 브러시를 사용합니다. 액체가 증발되면 계란은 테이프에 집중됩니다. </li><li> 해부 현미경 터치에서 그들의 긴 축을 따라 달걀을 여러 번 chorion 때까지 조심스럽게 핀셋 한 쌍의 절반의 바깥 면을 사용하면 골절 및 개방형이지만 쵸에서 배아를 떠나급속한 탈수를 예방하기 이온각. 계란의 10-20이 (단일 실험에 필요한 난자의 수에 따라) 처리되었습니다 때까지이 과정을 계속합니다. </li><li> 배아 그런 다음 포착하고 chorion 쉘에서 제거하고 부드럽게 하나에 의해 접착제 스트립 하나에 배치될 수 있습니다. 계란은 배치와 배아 병렬 또는 그들이 microinjected 수 있는지에 따라 달라집니다 접착제 스트립의 긴쪽으로 반 평행의 긴 측면에 중 정렬 수 있습니다. </li><li> 배아는 어느 즉각적인 영상을 위해 추가로 탈수를 예방하기 Voltalef의 10 초 오일 적당량 (Holocarbon 700 오일 27 기름 5시 1분 혼합, 시그마)로 즉시 적용하거나 3~8분 동안 건조 챔버에 삽입하실 수 있습니다 추가로 룸과 실험의 목적 습도에 따라 그들을 탈수. microinjection이 필요할 경우 지나친 탈수를 방지하기 위해 적절한 탈수 배아는 10 초 기름으로 덮여 있어야합니다. (그림을 참조하십시오. 2C, D는&amp; E). </li></ol> 6. 이미징 태아 <ol><li> 살아있는 배아의 시간 경과 또는 단일 이미지는 HCX PL APO CS 40X 1.25 기름 침지 목표 (60 또는 100X 목표를 너무 높이면, 실험 목적에 따라 사용할 수있는 Leica TCS SP2를 거꾸로 공촛점 현미경 시스템을 사용하여 수집됩니다 배율이 발생합니다 표백 더 많은 사진)가 사용됩니다. </li><li> 이미징 여러 스펙트럼을 중복했습니다 fluorophores, 그리고이 같은 배아에서 공동으로 표현하면, 각각의 형광 단백질 방출 파장은 순차적으로 수집되었다. Leica TCS SP2 시스템에서 사용할 수 여기와 방출 파장은 다음과 같습니다 GFP, λ 예 : 488 nm의 및 λ 엠 : 500-600 nm의. RFP, λ 예 : 543 nm의 및 λ 엠 : 555-700 nm의. </li><li> 하나의 이미지는 일반적으로 두 프레임 스캔의 평균이 scanlines의 평균으로 얻은 것입니다. 이것은 512x512 P를 검색하는 데 6.3 초 최소 걸립니다연속 스캔 모드의 동시 스캔 모드, 15.44 초 및 ixel 이미지는 좋은 신호 대 잡음 비율을 생산하고 있습니다. 이러한 시간은 촬영된 이미지 수집을위한 시간 프레임을 설정할 때 고려해야합니다. </li><li> 핀홀은 보통 1-2 AU (통풍 장치)로 설정되고, 레이저의 파워가 어떤 중요한 photobleaching을 피하기 위해 가능한 가장 낮은 레벨로 조정되었습니다. </li></ol> 7. 적절한 시약으로 배아를 Microinjecting하여 SAC를 유도할 <ol><li> 실험 전에 바늘을 준비합니다. 매개 변수 : 더위가 = 600, = 90, 벨 = 70를 당기면 : 우리는 불타는 / 갈색 micropipette 풀러 (P-97 셔터의 악기, 모델)을 사용 siliconised 유리 모세관 (GC-100-10, 하버드)에서 바늘을 뽑아 것을 선호 , 델 = 150. </li><li> 사출 버퍼에 시약의 적절한 농도에서 한두 ML이 훌륭한 로딩 팁을 (W215818J 20 μl Eppendorf 로트)를 사용하여 바늘을 Backfill. </li><li> 바늘 호에 바늘을 마운트Eppendorf 분사 제어 시스템에 연결된 압력 파이프 현미경에 lder. </li><li> 40X 목표하에 배아를 찾아 볼 분야의 중심에 바늘을 이동하고 점차 오른쪽 초점 비행기로 낮추는 방법으로 초점 평면을 변경하지 않고 바늘 그림자를 찾으십시오. </li><li> 깨진 coverslip 접착제 스트립의 한쪽 끝을에 미리 마운트의 작은 사각형을 찾기 위해 부드럽게 멀리 배아를 이동합니다. 그것이 작은 정사각형 coverslip의 가장자리를 조회하고 부드럽게 열 분해까지 아주 부드럽게 바늘 끝 이동합니다. </li><li> 보기로 다시 배아를 이동 및 사출에 적합한 연령의 배아를 선택합니다. 핵은 대뇌 피질에 바깥쪽을 마이 그 레이션하기 전에 이것이이기 때문에 나는 보통 5-7에서 핵 분열주기에서 배아를 주입. 핵 분열주기 단계는 GFP-Cdc20 사전 주입 9 RFP-히스톤 2B의 핵 신호의 형광 신호의 빠른 스캔에 의해 결정됩니다. </li><li> 조심스럽게 엠브리으로 이동O 바늘 가까이하고 배아와 바늘 모두에 초점 비행기를 정리하다. 바늘로 배아를 이동하고 원하는 위치로 시약의 방울 주입하고 멀리 배아를 이동 (또는 microinjection 시스템에 대한 지침을 따르십시오.) 배아는 그 후부이나 실험의 목적에 따라 측면에서 주입 수 있습니다. </li><li> 일단 난자는 적절한 시간에 몇 군데 준비하고 있습니다 주입. (그림 2F &amp; G 참조) </li></ol> 8. 대표 결과 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig1.jpg" /> 1 그림. 필수 재료 :. 미세 펜 브러시, 나. 작은 정사각형 깨진-안경 컨테이너, 다. 22 X 50mm coverslip, D. 현미경 슬라이드, 전자. 양면 스티커 테이프, 6. 뚜껑, G에 구멍이있는 시험관에 건조 효모 분말. 누룩과립은 플라이 유지 보수, H를 위해 사용됩니다. 식품 유리병, 나는 비행을. dechorionate 배아에 사용되는 족집게의 반, J. 페어 핀셋, K. 헵탄 접착제 액체 용기 (용적 플라스크). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig2.jpg" /> 그림 2. 다이어그램은 4 단계, 5 단계와 7 단계에서 microinjection을위한 바늘 준비의 배아 dechorionation의 coverslips와 슬라이드의 준비를 보여줍니다. . 상단 그림의 중간에 걸쳐 헵탄 접착제의 스트립 한 끝에 붙어 깨진 coverslip의 작은 사각형으로 coverslip을 보여줍니다. 아래 그림은 coverslip를 개최하기위한 네 모퉁이에서 물의 얇은 층을 가진 현미경 슬라이드를 보여줍니다. coverslip을 보유하는 슬라이드를 사용하는 이유는 슬라이드에 양면 테이프를 가지고 있으며 따라서 현미경을 환기 시켰을 뿐일세 피하는 때 찾은으로 대략 동일한 초점 거리를 유지하는 것입니다 당신이 AR 동안전자 해부 및 테이프와 coverslip 사이의 배아를 전송. B는. 양면 스카치 테이프의 짧은 길이 슬라이드 배아. C를 dechorionating 사용의 표지 종이를 벗겨내는 전에 적용됩니다. 왼쪽 그림은 표시된 앞부분과 후부로 끝납니다 그대로 chorion 쉘과 배아를 보여줍니다, 그들은 접착제 스트립과 함께 coverslip에 전송하기 전에 오른쪽 그림 깨진 chorion 쉘에있는 태아를 보여줍 D &amp; E 다이어그램 두 보여주고 있습니다.. , 양도 배치 및 아교 스트립에 dechorionated 배아를 정렬을위한 방법. 배아는 적절한 건조 기간 후에 10 초 오일이 적용되었습니다. 이렇게 같은 삽입할 바늘와 위치의 일각을 여는 방법을 보여주는 F &amp; G. 다이어그램 있습니다. 위에서 설명한 실험에서 얻은 단일 또는 촬영된 이미지는 직접 Leica 소프트웨어를 사용하여 분석하거나 열려있는 구경이 있습니다. TIF 파일에 저장할 수이것을 설명하기와 같은 이미지 J, 포토샵 및 MetaMorph 등 두 가지 예로 같은 다른 일반적인 이미지 분석 프로그램을 사용하여 더욱 부량 또는 편집 분석에 사용할 수 rmat은 아래에 설명되어 있습니다 : 예제 1 : 시간 경과 영화는 (그림 3) GFP-Cdc20와 Drosophila syncytial 배아 생활의 염색체 운동의 동적 kinetochore 모집을 보여줍니다. 원래 촬영된 시퀀스 이미지에서 관심 지역으로 결정 / 편집 및 자동 - 일괄 포토샵 소프트웨어를 사용하여 변환했습니다. 영화는 퀵타임 소프트웨어를 사용하여 조립되었다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig3.jpg" /> 그림 3. 시간 경과 영화는 GFP-Cdc20와 Drosophila syncytial 배아 생활의 염색체 운동의 동적 kinetochore 모집을 보여줍니다. () 촬영된 이미지는 GFP-Cdc20를 (녹색)을 공동 표현 형질 syncytial 배아에서 찍은및 RFP-히스톤는 2B (빨간색)을 융합 단백질하며 ° C 핵 분열주기 중 7-8 18 Leica TCS SP2 공촛점 시스템을 사용하여 기록되었다. 프레임은 매 10 초 촬영되었다. 이미 prophase의 세포와 프레임은 제로 시점 10으로 처리됩니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3763/3763movie3A.mov" target="_blank">그림 3A에 대한 동영상을 보려면 여기를 누르십시오</a> . (B) GFP-Cdc20는 쉽게 prophase 및 prometaphase kinetochores (B3, 4, 흰색 화살표)을 준수하고 있습니다 metaphase과 anaphase의 kinetochores (B5 &amp; 6, 흰색 화살표)를 지속. GFP-Cdc20는 초기 prophase으로 핵을 입력 계면 핵 (화이트 화살촉)에서 제외됩니다. 염색질의 morphologies는 마커 (B8-14)로 공동 표현 His2BmRFP을 사용하여 결정됩니다. 바는 5mm =. 예제 2 : SAC 기능 microinjecting 항체, fluorescently 라벨이 단백질이나 chemica에 의해 배아를 조작하여 공부하실 수 있습니다잠재적 SAC를 실행하는 관심 리터 화합물. 예를 주입 콜히친 들어 microtubules을 depolymerize하기 위해 그림 4 10에 표시된대로 SAC 도발 때문에. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig4.jpg" /> 4 그림. Mad2은 콜히친-호출할 SAC 기능 10 필수적입니다. GFP-cdc20; mad2 + / +, GFP-cdc20; mad2 어이 (mad2 - / - null이 돌연변이)과 GFP-mad2; mad2 어이의 배아는 microinjection에 의한 콜히친로 치료되었다. 시간 경과 공촛점 이미지는 (; 08-12, 중, 패널, 14-18, 바닥 판넬 02-06, 상단 패널) 전 (01, 07 및 13) 또는 주사 후에 찍은. GFP-Cdc20 (상단과 가운데 패널) 또는 GFP-Mad2 (하단 패널) kinetochore 신호는 세포주기의 진행 마커로 사용되었다. 톱 패널, 화살표는 02-06에서 체포 kinetochores를 나타냅니다. 01에서 화살표로 표시된 영역은 콜히친 처리, GFP-C 전에 그 의미dc20은 후반 계면 핵에서 제외됩니다. 가운데 패널 앞에서, 내생 Mad2의 부재에서 GFP-Cdc20 신호는 핵에서 퇴원 진동을 계속하고, cytokinesis 결함이있을 것 같습니다 비록 kinetochores에 갔다가, 같은가 microtubules 부족 배아에 예상되어지는 콜히친의 (07-12에서 화살표로 표시) 콜히친 치료에 대한 응답으로 세포를 체포에 실패 SAC 기능을 제안. 딸 핵의 분리는 그림 10에 실패했습니다. 하단 패널, 14-18의 화살촉은 Mad2 돌연변이 배아의 구조의 SAC 결함 표현형을에 기능성 GFP-Mad2을 제안하기 위해 축적된 GFP-Mad2 융합 단백질로 체포 kinetochores를 나타냅니다. 13 화살촉은 늦은 계면 핵에 GFP-Mad2 축적을 나타냅니다. = 5mm를 바. 배아는 1 X PBS에서 100mg/ml 콜히친 주식 솔루션의 ~ 1 %의 계란 량과 microinjected되었다.

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우리는 공개 할게 없다.

여기에서 설명한 프로토콜은 영상은 Leica TCS SP2 공촛점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 syncytial 배아를 조종 및 기타 현미경 시스템에 맞게 수정할 수 있으며 Drosophila syncytial 배아를 사용하는 다른 유전자 기능을 연구하는 데 적용할 수 있습니다위한 일반적인 방법입니다. 우리는 스핀들 조립 검사점, 단백질 역학 및 생활 또는 고정 표본 4,6,12-14의 단백질 지방화를 시각화하는 유전자 변형 파리 또는 polyclonal 항체를 사용하여 단백질의 proteolysis의 여러 측면을 연구하기 위해이 프로토콜을 사용 하였다. 달걀 - 작은 숫자 (100 ~ 10)를 수집하면 신선한 플라이 음식 튜브 안에 파리를 유지하는 간단한 방법입니다. 이것은 만들기 및 기타 출판물 15,16에 설명된대로 추가적인 사과 쥬스 한천 플레이트 계란 수집 챔버를 준비의 번거로움을 줄여줍니다. coverslip에 접착제 스트립의 한쪽 끝을에서 깨진 유리 coverslip 작은 광장 이외는 훨씬 쉽게바늘을 열고 바늘이 10 초 기름에 immersing되는 동안 microinjection 시스템 설정을 조정하여 사출 볼륨을 결정합니다. 태아의 탈수의 정도는 leakages을 피하고 특히 장시간을 필요로하거나 주사 후 transformants을 높이는 경우 해당 실험에 대한 태아의 생존을 유지 분사의 성공을 위해 중요합니다. 그러나 탈수가 필요한 정확히 얼마를위한 황금률은 없습니다. 이 실험에서 실험으로 다르​​며 주입 솔루션 및 작업 환경의 습도의 양에 따라 달라집니다. 관심있는 특정 단백질의 기능은 모노 또는 폴리-clonal 항체 야생 형식이나 유전자 변이 배경 아래에서 특정 단백질, 메신저 RNA 또는 fluorescently 분류 펩티드에 대해 특정 단백질 억제제를 microinjecting으로 조작 할 수 있습니다. 이러한 돌연변이 선 또는 GFP-태그를 형질 전환 라인의 대부분은 공개 AV있다Drosophila 주식 센터와 대부분의 ailable은 Flybase (에 나열되어 있습니다 <a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/~~V</a> ) 및 온라인으로 검색할 수 있습니다.

필수 장비 및 시약 : 공촛점 이미징 시스템 :이 프로토콜에 설명된 이미징 시스템 공촛점 거꾸로 현미경 시스템을 스캔 Leica TCS SP2의 레이저입니다. 설명한 방법은 다른 이미징 시스템을위한 몇 가지 사소한 수정하면 아마도 적합합니다. 현미경을 해부 : 우리는 DF PLAPO 1X-4 렌즈 올림푸스 SZX7를 사용합니다. 니들 풀러 / 갈색 micropipette 풀러를 (: P-97 셔터의 악기, 모델에서) 불타는. Microinjection 체제 : Eppendorf의 microinjection 시스템이 설명되어 있지만 다른 적절한 시스템을 사용할 수 있습니다. Jencons 과학 (주) 연동 펌프 : 식품 유통 들아. 시약 : <table border="1"><tbody><tr><td> 성분 </td><td> 무게의 </td><td> 자원 </td><td> 로트 번호 </td></tr><tr><td> 옥수수 식사 </td><td> 100.0g </td><td> SUMA, 영국 </td><td></td></tr><tr><td> 갈색 설탕 </td><td> 50.0g </td><td> 빌링턴의, 영국 </td><td></td></tr><tr><td> 건조 효모 </td><td> 25.0g </td><td> DCL 효모 (주) 영국 </td><td></td></tr><tr><td> 한천 </td><td> 12.5g </td><td> 피셔 과학 </td><td> 106,556 </td></tr><tr><td> Sorbic 산 </td><td> 0.4g </td><td> BDH, VWR 인터내셔널 (주) 영국 </td><td> 8,829,310 </td></tr><tr><td> 벤조산 </td><td> 2.9g </td><td> 피셔 과학 </td><td> 1,019,599 </td></tr><tr><td> Nipagin (메틸 -4 - 하이드 xybenzoate) </td><td> 0.9g </td><td> BDH, VWR 인터내셔널 (주) 영국 </td><td> K35969015 </td></tr><tr><td colspan="3"> 1L로 H 2 O를 최대 </td><td></td></tr></tbody></table><p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 표 1. 음식 재료를 날기. Holocarbon 700과 시그마에서 구입한 27 오일. 건조 효모 : 토마스 앨리슨, 영국. 헵탄 접착제를 준비하기 : 양면 스카치 테이프 1.5 미터 받아 헵탄의 5ml와 15ml 팔콘 튜브에 넣고 3~5시간 또는 하룻밤 동안 돌린다. 그 때 1.5 ML eppendorf의 원심 분리기 튜브에서 4 동등한 aliquots으로 분할하고 잔해를 제거하는 벤치 탑 원심 분리기에서 빠른 속도로 약 5 분 동안 회전 후. 10ml의 용적 플라스크에 헵탄 접착제 솔루션을 저장하고 사용할 수 있도록 유지. 접착제의 강도는 농도와 사용된 접착제의 금액에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적으로 얇은 접착제가 공촛점 현미경으로 스캔 덜 시끄러운 배경을 생산하고 있습니다. <ul><li> Coverslip : BDH, VWR 인터내셔널 (주) 영국 </li><li> 현미경 슬라이드 : BDH, VWR 인터내셔널 (주) 영국 &lt;/ 리&gt; <li> Siliconised 유리 모세관 : GC-100-10, 하버드 </li><li> 파인 로딩 팁 : 20μl eppendorf 주차장 : W215818J </li><li> 족집게 </li><li> 파인 펜 브러시 </li></ul>

studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos

스핀들 조립 검사 점 (SAC) 메커니즘 염색체가 제대로 연결되어 때까지 anaphase 발병을 막기 위해 염색체 kinetochores 및 스핀들 microtubules 간의 상호 작용을 모니터링 활동적인 신호입니다. 세포는 aneuploidy 또는 게놈 불안정성, 그리고 따라서 암 및 출생 결함과 알츠하이머의 1과 같은 다른 인간의 질병을 방지하기 위해이 메커니즘을 사용합니다. 같은 Mad1 같은 SAC 구성 요소의 수, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10,로드 및 오로라 B 키나제는 식별 그리고 그들은이 모든 kinetochore 역동적인 단백질들은되었습니다. 증거 SAC 신호를 시작한 곳을 kinetochore는 것이 좋습니다. SAC 주요 단속 대상은 Cdc20입니다. Cdc20는 필수 APC / C (naphase P romoting C omplex 또는 C yclosome) activators 셋 중 하나이며 또한 kinetochore 역동적인 단백질 4-6입니다. 활성화되면 SAC가의 활동을 억제PC / C는이를 이행 7,8를 anaphase하기 metaphase 방지, 두 가지 핵심 기판, cyclin B와 securin의 파괴를 방지합니다. SAC 신호가 시작하고 조립 kinetochores와 그 기능이 여전히 애매 남아 억제하기 위해 APC / C에 중계되고 정확히 어떻게. Drosophila는 매우 취급하기 쉬운 실험 시스템이다; 훨씬 간단하고 좀더 이해 유기체는 인간 하나와 비교하여 공통점 주 기본 프로세스니다. 초기 배아는 동기 13 급격한 핵분열주기 (8~10분 진행되는 동안 그것은 특히 공간과 시간에서 mitotic 이벤트의 시각화를 위해,, 아마도, 살아있는 세포에서 바이오 이미징 연구에 사용할 수있는 가장 좋은 생물 중 하나입니다 25 ° C)에서 각 사이클과 점차 단지 피질 구 밑에 하나의 단일층의 핵을 구성합니다. 여기에서 나는 유전자 변형 Drosophila expres를 사용하여 바이오 이미징 방법을 제시노래 GFP (녹색 형광 단백질) 또는 관심과 SAC 구성 요소의 일부 GFP 융합 단백질, Cdc20와 Mad2의 이미지를 보여줌으로써, 파리에서 SAC 기능을 공부 Leica TCS SP2 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 시스템의 변종 타겟 단백질 , 예를 들어 있습니다.

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Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

SAC는 자매 chromatids의 mitotic의 분리를 모니터링의 신호를 시작하는 곳이 kinetochore입니다. 방법으로 염색체 운동과 함께 kinetochore 단백질과 그 조정 중 하나의 모집 및 매출을 시각화하기 위해 설명되어 있습니다<em&gt; Drosophila</em&gt; Leica 레이저 스캐닝 공촛점 시스템을 이용하여 배아.

생활에서 보여주는 동적 Kinetochore 단백질 행동과 염색체 모션으로 Mitotic 검사 점 유학<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial 태아

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

11.3K 조회수.  University of Newcastle, United Kingdom. SAC는 자매 chromatids의 mitotic의 분리를 모니터링의 신호를 시작하는 곳이 kinetochore입니다. 방법으로 염색체 운동과 함께 kinetochore 단백질과 그 조정 중 하나의 모집 및 매출을 시각화하기 위해 설명되어 있습니다 Drosophila Leica 레이저 스캐닝 공촛점 시스템을 이용하여 배아.

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Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

만성 실험에 장착 전극 또는 Microdialysis 프로브를위한 라이트 - 치료 치과 접착제 수지의 응용

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

연구

생물학

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Drosophila의 유충에서 냄새 기반 행동의 고해상도 측정

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

의 유사 분열 유학을위한 Microinjection 기법 Drosophila melanogaster Syncytial 엠브료

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

Drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

dsRNA 주입하여 RNAi 간섭에 Drosophila 태아

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

단백질 - 단백질 상호 작용을 확인<em&gt; 초파리</em탠덤 선호도 정화로&gt; 성인 머리 (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

생체</em에서 단백질 복합체를 분리> 가교 접근 초파리 태아

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구<em&gt; 초파리</em&gt; 난소

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...