Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation - Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.

1. 펠리클과 바이오 필름 콜로니 형성에 작은 분자 억제제의 효과 평가 <ol><li> 칼슘 염화 철 (III) 클로라이드 수화물없이 정의 생물막 유도 MSgg 매체 (25)의 2 배 솔루션을 준비합니다. 여과 멸균 한 후, 염화칼슘을 추가한다. 매체는 직접적으로 사용할 준비가되거나 어둠 속에서 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 실험의 날에 1 배 MSgg 희석을 준비합니다. <ol><li> (멸균 증류수 (펠리클) 또는 멸균 3 %의 고온 (80 ℃) 한천 (생물막)와 1 배 50 μM (펠리클) 또는 250 μM의 최종 농도로 철 (III) 클로라이드 수화물을 추가 배 MSgg 매체 희석 바이오 필름). 원하는 농도로 항생제 또는 작은 분자 억제제를 넣고 잘 섞는다. 예를 들어, 펠리클 또는 생물막을 확립 76.3 밀리미터 (10 ㎎ / ㎖) D 류신 원액 196.6 μL를 추가 30 ㎖ 0.5mm의 D 류신의 최종 농도를 얻었다. 아니TE는 :. 최종 1X MSgg 조성물은 표 1에 설명되어있는 원래의 레시피 (25)에 비해, 배지를 50㎍ / 트레오닌 mL 및 고체 MSgg 매체에 생물막 콜로니를 성장 철 농도가 주름 콜로니 형태를 최적화하기 위해 2.5 배 증가 하였다 포함 . </li></ol></li><li> 한천의 고화 후, 접종 전에 30-45 분간 생물학적 후드 고체 MSgg 판을 건조. </li><li> 박막 형성 (그림 1)의 메커니즘을 방해 특정 억제제를 선택하려면, 사용 농도는 플랑크톤 및 정적 성장에 영향을 미치는 것을 배제. <ol><li> 고정 성장 단계까지 600 nm에서 매 시간마다 광학 밀도를 측정하여 단순 성장 곡선에서 플랑크톤 성장 (액체 배양 시간에 따른 광학 밀도의 증가)를 결정합니다. </li><li> (CFU)를 측정 배양 탁도 생균 수를 나타내는 것을 확인 집락 형성 단위의 수를 결정하기 위해여러 시점 이후 진탕 배양에서 플랑크톤 성장 단계에서 세포. </li><li> 또한, 동일한 조건에서 접종 섹션 1.7-1.9에서 설명한 바와 같이 24 웰 세포 배양 물에서 23 ℃에서 3 일간 배양 한 끝에 고정 펠리클 성장 수확 세포 소분자 억제제의 효과를 평가 그리고 CFU를 결정한다. 이 컨트롤의 경우, 세포 외 기질 구성 요소에 대한 코딩하는 오페론이 부족 펠리클 결핍 균주를 사용하여 (즉, B. 서브 틸리 Δ epsH, Δ TASA). 주 :이 균주는 정적 조건에서 성장시킬 수 있지만 펠리클 형성 야생형 달리 그 성장이 증가 된 산소 농도 26 호의 액체 - 공기 계면에 부유 할 수있는 능력의 부족이다. 따라서,이 세포 외 매트릭스 - 및 펠리클 결핍 균주는 정적 조건에서 성장을 평가하는 추천 기준 균주이다. 주 : 특정 예를 들어비표준 D-D 아미노산 류신이 충분한 펠리클 형성 12,17 배제 된 간섭 농도 아래 플랑크톤 정적 성장에 영향을 설명했다. 플랑크톤 및 정적 성장을 결정하는 방법을 상세하게도 17에서 설명된다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig1.jpg" /> 그림 1. 강력한 실험 장치의 식별을위한 개념적 개요 biofilm 형성의 구체적인 억제를 평가하기 위해. 플랑크톤 성장에 뚜렷한 효과없이 생물막 형성 특정 간섭을 나타내는 작은 분자 억제제에 대한 선택 기준을. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.</a> <ol start="5"><li> B. 밖으로 행진 -80 ° C 형 재고 서브 틸리 스 (LB의 cultu20 % 글리세롤에 얼의 재 109 세포 / ㎖)을 멸균 팁 또는 스틱 어플리케이터와 LB-1.5 % 한천 플레이트 상에 단일 콜로니를 분리한다. </li><li> 30 ℃에서 하룻밤 성장. </li><li> CRITICAL STEP : 예 D 류신과 같은 비표준 D - 아미노산에 의해 견고 펠리클 저해 단일 콜로니는 4 시간 동안 37 ° C에서 3 ㎖ LB 배지에서 LB-1.5 % 한천 플레이트에서 고른 성장 인큐베이터를 흔들어 (속도 200 rpm으로 진탕). 조심스럽게 상층 액을 제거하고 1.5 ml의 MSgg 매체에 펠렛을 다시 중단, 6,000 XG에서 4 분 동안 1.5 ml의 스타터 문화를 원심 분리하여 접종 이전에 생물막 유도 MSgg 매체와 LB 배지를 교체합니다. 문화의 나머지는 폐기 될 수있다. 중요 : 시스템의 안정성을 보장하기 위해, 세척 스타터 문화의 600 nm의 (OD 600)에서 광학 밀도가 0.6과 1 사이 여야합니다. </li><li> 스타터 문화의 성장하는 동안, 12 웰 세포 배양 multidish 판 containin을 준비이없는 또는 작은 분자 억제제 (예, 0.3, 0.5, 1 mM의 D 류신 17)의 농도 범위 MSgg 배지 3 ㎖ g. 가장자리 효과를 배제하기 위해, multidish 접시에 걸쳐 서로 다른 농도의 위치를 ​​배포 할 수 있습니다. 또한, MSgg 매체의 1.5 ml에 포함 된 24 웰 세포 배양 multidish 플레이트를 사용합니다. </li><li> (1,000 희석 1) 세척 스타터 문화의 3 μL와 12 웰 세포 배양 multidish 판의 우물을 접종한다. 주 : 낮은 희석 비율, 즉, 1 : 500이 사용될 수있다. 이 펠리클의 개발 시간을 감소시킨다. </li><li> 사흘 동안 정적 상태에서 23 ° C에서 펠리클 성장. 이 펠리클의 최종 표면 형상에 영향을 미칠 수 있기 때문에,이 시간 동안 펠리클을 움직이지 않는다. </li><li> 번개의 양안 및 균일 한 노출 사진을 획득. 대안 적으로, 고해상도 카메라와 펠리클의 사진을 촬영. inconsis에 의한 유물을 방지하려면텐트 빛의 각도와 그림자, 삼각대에 고정 된 카메라로 위에서 아래로 사진을 찍고 양쪽에서 45 °에서 부드럽고 큰 광원을 사용합니다. 참고 : B를 공부하는 다른 방법 서브 틸리 다세포 고체, 바이오 필름 유도 MSgg 매체에 생물막 식민지 분석이다. 펠리클과 마찬가지로,이 분석은 시공간 과정의 연구를 할 수 있습니다. 소분자 저해제의 유효 범위가 결정되면, 생물막 콜로니 형성에 미치는 영향을 연구 할 수있다. </li><li> 8.5 cm 직경의 페트리 접시 당 4 방울 - 생물막 식민지를 성장, 대칭 씻지 사전 문화의 1.5 μL 템플릿의 도움으로 건조 MSgg 1.5 % 한천 플레이트에 (단계 1.7) 자리. 방울 그들을 이동하기 전에 판에 흡착 할 수 있습니다. 참고 : 템플릿은 세포가 재배되는 지역 내 바이오 필름 식민지의 동일한 분포를 얻을 수 있습니다. 템플릿을 준비하려면, 원래 규모에서 성장의 전체 면적을 그릴 동일한 종파로 분할ORS과 중앙을 표시합니다. 8.5 cm 직경의 원형 페트리 접시의 경우,이 14 cm 2 일 생물막 식민지를 지정합니다. </li><li> 사흘 동안 30 ° C에서 접시를 품어. 이 시간 동안, 생물막 콜로니 개발 입체 주름 구조를 형성한다. </li><li> 단계 1.11에서와 같이 사진을 촬영합니다. </li></ol> 2. 에탄올 저항 분석 <ol><li> 단계 1.1-1.7 및 1.12-1.14의 설명에 따라 생물막 성장. </li><li> 30 ° C에서 성장의 68 시간 후, 면도날과 템플릿의 도움으로 동일한 두 부분으로 생물막 식민지를 잘라. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig2.jpg" /> 도 2 실시 예 살균제에 생물막 콜로니 셀의 저항을 평가하기위한 실험 설계. 페트리 접시에 걸쳐 생물막 콜로니 동일한 분배 절단에 사용되는 (A) 템플릿. (B)처리되지 않은 야생형 생물막의 하향식 이미지는 30 ℃에서 고체, 정의 생물막 유도 MSgg 매체에 68 시간 동안 성장. 확대는 생물막 식민지 두 개의 동일한 절반으로 절단하는 방법을 보여줍니다. (C)은 두 개의 동일한 생물막 절반은 동일하게 (제어, PBS)을 치료 또는 PBS 또는 살균제 중 하나와 설명에 따라 처리됩니다. 스케일 바 :. 1cm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="3"><li> 조심스럽게 작은 주걱 한천 플레이트에서 콜로니 생물막의 각각의 절반을 올려 인산 완충 용액 (PBS) 500 ㎕를 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브로 이동합니다. 필요하다면, 플레이트에 남아있는 세포를 긁어 아니라 마이크로 원심 튜브로 옮긴다. 주 : 생물막 콜로니 후반전, 차분 처리는 제어 여부에 따라 또는 steri에 대한 내성을 테스트하는 것이다LIZING 에이전트. </li><li> 제어의 경우, 단계 2.3에서와 같이 500 ㎕의 PBS에서 생물막 식민지의 두 번째 절반을 품어. , 멸균 제에 대한 내성을 평가하는 500 ㎕의 50 % (v / v)의 에탄올 생물막 콜로니의 후반을 전송한다. 참고 : 예컨대 차아 염소산 나트륨 등의 대안의 살균제를 사용할 수있다. 사용 된 모든 살균 에이전트의 경우, 예비 실험의 활성 농도 및 배양 시간을 결정합니다. </li><li> 실온에서 벤치 탑에서 10 분 동안 생물막 콜로니 부화. </li><li> 18,000 XG에서 5 분 동안 생물막 식민지를 원심 분리기 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거합니다. PBS 300 μl를 추가합니다. </li><li> 소니 케이의 마이크로 팁과 세포 온화 (진폭 10 %, 펄스 5 초) sonicate하세요. 주 : 초음파 에너지가 별도의 생물막 집계에 충분해야한다. 그러나, 지나치게 강한 초음파가 세포 용균있다. 광학 현미경 초음파 에너지에 의해 사전에 확인세포를 용균하지 않습니다 사용하고 모든 집계 용해됩니다. </li><li> 1 ML의 최종 볼륨 PBS 700 μl를 추가합니다. PBS (10 -7) 일련의 희석을 수행하고 멸균 유리 비드를 사용하여 LB-1.5 % 한천 플레이트 상에 3 희석액 100 ㎕를 확산. 주 :이 살균제에 응답 관심 및 세포 생존율의 생물막 콜로니 세포의 양에 따라, 상기 최적의 희석은 도금 될는 예비 실험에서 결정되어야한다. </li><li> 하룻밤 30 ° C에서 접시를 품어 CFU를 계산하고 CFU에게 / ㎖를 결정한다. 각 반 생물막 식민지의 최종 CFU / ㎖에서 생존자의 비율을 계산합니다. 주 : 실시 분석 한 바와 같이 대칭 또는 콜로니의 저항 값을 확인하는 제어 생물막 콜로니의 반쪽과 생존 세포 수의 10 % 이하의 차이를 산출한다 미처리 생물막 콜로니 에탄올 처리 절반 대 비 처리 , respectively. 대안 적으로, 결과는 전체 CFU로 표현 될 수있다. 제어 및 미처리 생물막 집락의 세포 수는 동일한 정도의 크기로 유지한다. 반대로, 작은 분자 처리 생물막 콜로니의 에탄올 처리 절반의 세포 수는 살균제로 증가 된 감도 항에 2 차의 크기를 최소로 감소 할 것으로 예상된다. </li></ol> 주사 전자 현미경 3. 바이오 필름 식민지 샘플 준비 <ol><li> 단계 1.1-1.7 및 1.12-1.14의 설명에 따라 생물막 식민지를 성장. </li><li> 2 % (v / v)의 글루 타르 알데히드, 100mM의 3 % 나트륨 cacodylate의 (v / v)의 파라 포름 알데히드 용액을, 5 mM의 염화 칼슘 완충액, pH가 7.3의 신선한 배치를 준비한다. 8.5 cm 직경의 모든 페트리 접시에 대한 정착액 5 ㎖를 준비합니다. 주의 : 글루 타르 알데히드 및 ​​파라 포름 알데히드는 유해하다. 화학 후드 내부에 안전 장비로 처리합니다. HAZ의 솔루션과 오염 물질을 폐기농사 폐기물. </li><li> 조심스럽게 바이오 필름 위에 직접 분배하지 않고, 생물막 식민지에 정착을 추가합니다. 참고 : 생물막 식민지의 소수성 특성으로 인해, 식민지 천천히 한천에서 분리하고 떠 시작합니다. </li><li> 조심스럽게 파라 필름의 스트립 판을 밀봉. 실온에서 2 시간 동안 회전 진탕 기에서 인큐베이션하고이어서 밤새 39 ° C로 플레이트를 옮긴다. </li><li> 다음 날, 조심스럽게 진공 펌프에 연결 파스퇴르 유리 피펫으로 액체를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 바이오 필름을 씻고 5 분 동안 배양 10 ml의 100 mM의 나트륨 cacodylate, 5 mM의 염화칼슘 버퍼를 추가합니다. 조심스럽게 바이오 필름의 손상을 방지하고 부드러운 피펫으로 신선한 세척 솔루션을 추가 할 판의 모서리에서 파스퇴르 유리 피펫으로 액체를 제거합니다. 일단이 단계를 반복합니다. </li><li> 생물막 콜로니 탈수 다음 단계로 진행 DDH 2 O 2 배에 5 분; 3 배 20 분0 % 에탄올; 배 20 분 50 %의 에탄올; 배 20 분 70 %의 에탄올; 배 20 분 96 %의 에탄올; 2 × 100 % 에탄올에서 30 분. <ol><li> 각 단계에서 8.5 cm 직경의 모든 페트리 접시에 대한 액체의 15 ML을 추가하고주의 깊게 각 배양 후 액체를 제거합니다. </li></ol></li><li> 에탄올에서 샘플을 건조하기위한 두 가지 방법 중 하나를 사용합니다. <ol><li> 에탄올 항공 건조의 경우 : <ol><li> 분기 셀룰로오스 여과지 (직경 9cm의)을 잘랐다. 간단히 100 % 에탄올에 1/4 잠수함, 다음 조심스럽게에 하나의 부동 생물막 식민지를 전송합니다. 여과지 줄 지어 페트리 접시에 젖은 필터 용지를 넣습니다. 페트리 접시를 덮고 생물막 식민지에게 화학 후드에서 건조 하룻밤을 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 전이 유체로서 이산화탄소 (CO 2)를 사용 -drying 임계점 (CP)의 경우 : <ol><li> 100 % 에탄올 임계점 건조기 챔버의 75 %를 채운다. 자신의 C에, 홀더에 각각의 샘플을 샘플로 이동hamber. 필요한 경우, 작은 조각으로 가위로 바이오 필름을 잘라. 모든 취급시 에탄올에 빠져들 샘플을 남겨주세요. 그 후, 챔버로 홀더를 전송하고 단단히 챔버를 닫습니다. </li><li> 7 ° C까지 챔버를 냉각 교반 시작합니다. 액체 CO 2와 완전히 챔버를 입력합니다. 7 분 인큐베이션 시간 동안 CO 2와 에탄올 혼합하자. 이어서, 용액을 25 % 방출. 주 : 샘플의 수준 아래의 실을 버리지 말 것. </li><li> 단계를 반복 3.8.2.2 네 번. </li><li> 단계를 반복 3.8.2.2 5 분의 배양 시간에 다섯 번. 마지막으로 에탄올을 완전히 CO 2로 대체한다. </li><li> 챔버의 마지막 라운드, 빈 5 % 중. 교반 및 냉각을 끕니다. 42 ° C에 실을 가열 시작합니다. 31.1 ° C의 온도 및 73.9 bar의 압력에서, 액체 CO 2 임계점의 상태에 도달 여기서 기체 산도ASE는 용매 (27)의 액상과 동일한 밀도를 갖는다. 온도가 42 ° C에 도달하면, 10 분 동안 배양한다. 42 ° C에서, 챔버 내의 이산화탄소는 초 임계 기체로서 존재한다. 주 : 끊임없이 챔버의 압력을 확인합니다. 압력은 42 ° C에서 120 줄을 초과하지 않아야합니다. </li><li> 천천히 연속 난방 가스를 방출하기 시작합니다. 이것은 CO 2 - 가스 단계에서 샘플을 유지하고, 액체의 표면 장력을 통해 시료의 형태의 변형을 방지한다. 미세 조정하여 유량계를 제어하는 ​​계량 밸브를 5 리터 / h에 유량계를 설정합니다. 챔버 내의 모든 압력이 해제 될 때까지 기다립니다. 이제 챔버를 열고 홀더에서 조심스럽게 샘플을 제거합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 코트 카본 테이프 전자 현미경 토막. 핀셋의 도움으로 조심스럽게 그루터기에 바이오 필름의 식민지를 전송합니다. 차에서 얇은 다리를 추가하여 스텁 각 식민지 연결전자 빔에서 충전 제거를위한 중요 봉 테이프. 그들은 매우 깨지기 쉬운만큼이 단계에서주의하여 생물막 식민지를 처리합니다. 최소 24 시간 동안 또는 시험 때까지 데시 케이 터에서 샘플을 저장합니다. </li><li> 주사 전자 현미경 검사의 날은, 금, 팔라듐 스퍼터 코터에서 60 °의 각도에서 2 분간 생물막 콜로니 - 스퍼터 코팅. 두 번이 단계를 반복 사이에 120 °로 샘플을 돌립니다. 마지막에, 스퍼터 코팅 샘플을 일단 위로부터 3 분. 금 - 팔라듐 20 nm의 얇은 층은 도전성을 향상시키고 SEM의 영상에 대한 샘플의 콘트라스트를 향상시킨다. </li><li> 주 사형 전자 현미경 (29, 30)로 촬상 할 때까지 샘플 (28)의 재수 않도록 데시 케이 터에서 샘플을 저장한다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) 형태 강력하고 고도로 구조화 된 생물막 모두 액체 (펠리클)와 고체 배지에 (식민지). 따라서, 특정 바이오 필름 저해제의 작용 모드를 특성화하는 이상적인 모델 생물로서 기능한다. 고체 배지에서 세포 가장자리에 중심에서 방사 주름 등 펠리클에서 알 수없는 고유 한 특징을 가진 다세포 구조를 형성한다. 따라서, 펠리클과 식민지 B.을 연구 ?...

다세포 세균 지역 사회는 자연 및 인위적 환경에서 중요한 역할을하고, 유익하거나 매우 유해 할 수 있습니다. 이러한 다세포 콜로니 개별 세포 자체 생산 세포 외 폴리머 물질 (EPS) 매트릭스에 매립되는 것을 특징으로하는 바이오 필름으로서 알려져있다. 허가제 강하게들이 정착 표면에 세포를 접착. 그들은 기계적 및 화학적 힘에 대항하는 방패 역할 및 셀룰러 통신 1을 촉진, 인접 셀 사이에 긴밀한 연락을 만듭니다. 생물막은 세포가 고도로 규제 사용하십시오 차별화 된 커뮤니티로 볼 수있다, 종 2-5에서뿐만 아니라, 지역 사회 내에서 활동을 조정하는 프로세스를 조율. 생물막 상태로 성장 플랑크톤 자유 생활 모드 간의 전환은 종종 개발 프로세스와 관련된다. 좋은 예는 그람 양성 토양 박테리아 고초균 및 따라서 인 undomesticated 균주는 biofilm 형성을 유도하는 발달 단계를 연구하는 강력한 모델 생물 역할을한다. 이 박테리아에서, 운동성 세포는 전문적인 작업 4를 수행 눈에 띄는 다세포 구조로 자신을 구성 할 수 있습니다. 셀들의 하나의 그룹은 매트릭스 생산자 엑소 폴리 사카 라이드 6 분비 아밀로이드 단백질 TASA 7,8, 표면 소수성 단백질 BslA 9,10; 이는 모두는 EPS 11-13의 조립에 참여한다. 자연스럽고 인위적 틈새에 생물막의 풍부하고 일으킬 수있는 치명적인 손상 추정을 감안할 때, 그 형성을 방지하는 방법을 찾기 위해 가압 할 필요가있다. 소분자 억제제는 새로운 규제 경로, 효소 및 생물막 형성에 관여하는 구조 단백질의 발견에 도움이, 이에 다세포 커뮤니티 어셈블리의 복잡한 프로세스의 통찰을 촉진 할 수있다. B.으로 서브 틸리는 바이오 잘 연구 된 모델입니다성막 14,15, 다양한 생물막 억제제의 효과를 평가하기 위해 사용될 수있다. 이 연구는 작은 분자 억제제에 바이오 필름의 반응을 평가하기위한 중요한 4 개의 기본적인 방법을 다룹니다. 첫째,이 억제제는 생물막 특정 대상이 있는지 확인하기 위해, biofilm 형성에 미치는 영향에서 플랑크톤의 성장에 미치는 영향의 분리는 매우 중요하다. 대부분의 항균제는 플랑크톤 성장기에있는 세포를 표적으로하지만, 생물막 라이프를 대상 분자는 드물다. 플랑크톤의 성장에 영향을 미치지 않는 분자 독성이기 때문에 또한 이들은 항생제 내성 돌연변이 체 (16)를 선호 선택 압력을 감소시킬 수있다. 바이오 필름은 D 아미노산 또는 기타 특정 세포벽 간섭 분자로 처리하는 경우, 예를 들면, 그들은 어느 방해하거나 분해하지만, 이러한 억제제는 약간 플랑크톤 성장 12,17 영향을한다. 대조적으로, 많은 항생제 극적 리터와 플랑크톤 성장을 저해ittle 또는 biofilm 형성 (17)에 아무런 영향. 둘째, 작은 분자의 효과를 연구하는 일관되고 견고한 실험 프레임 워크를 확립하는 것이 중요하다. 우리는 소분자 억제제의 활성 농도 범위는 예비 배양 조건 이러한 소분자 저해제의 효과를 연구하기 위해 실험 구성에 민감한 것을 관찰 하였다. 특히이 B를 공부 각종 보고서, 부유 세균 바이오 필름 12,17-19 - 서브 틸리는 D-아미노산 펠리클의 형성을 억제하는 농도 범위의 변화를 한 것으로 밝혀졌습니다. 여기에 제시된 결과는 다음과 같은 요소가 활성 농도 범위의 차이를 고려하는 것이 제안 : 예비 배양 조건 (후기 정지 20 성장기 대 로그 12,17) 예비 배양 조건에서 사용 된 배양 배지는 (풍부 정의 대 정의되지 않은 [루리아 국물, LB] [글루탐산 나트륨글리세롤, MSgg), 접종 비 접종 전의 상기 배지 특히 제거. 정적 펠리클의 성장 온도는 소분자 억제제 D 류신, 본 연구에 사용 된 대표 D 아미노산의 활성 영역에서 덜 중요한 역할을 나타내었다. 마지막으로, 한 번 생물막은 특정 바이오 필름 억제제, 강력하고 유익한 방법이 생물막 피트니스 이러한 억제제의 효과를 특성화하기 위해 필요로 처리됩니다. 생물막 콜로니 및 항균제 그들의 저항 내 단일 세포 (1) 효과 : 여기서, 독립적 소분자 억제제의 효과를 특징 화하는 두 가지 방법이 상세히 설명된다. 자유 살아있는 박테리아 21-23에 비해 생물막의 셀은 전형적으로 더 많은 항생제 내성한다. 이 현상은 인성이지만, 항생제 침투를 줄이기위한 EPS의 능력은 종종 매력 설명 24 여겨졌다 </suP&gt;. 이 방법은 항균성 물질에 노출 된 후 미리 설정된 생물막 세포의 생존율을 평가한다. (2) 작은 규모에 큰에서 생물막 식민지 아키텍처에 미치는 영향. 생물막 콜로니는 입체 구조와 EPS의 존재를 특징으로한다. 주사 전자 현미경을 이용하여, 세포 형태, 생물막 콜로니 구조 및 EPS의 구조 및 다량의 변화는 작은 크기 (μm의)에 큰 (mm)에서 가시화 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Luria Broth, Lennox</td><td>Difco</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma, 136.09 g/mol</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>potassium phosphate dibasic&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>3-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-morpholino)propanesulfonic acid</td><td>Fisher Scientific, 209.27 g/mol</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>magnesium chloride hexahydrate&amp;nbsp;</td><td>Merck, 203.30 g/mol&amp;nbsp;</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride anhydrous</td><td>J.T. Baker, 110.98 g/mol</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>manganese(II) chloride tetrahydrate</td><td>Sigma, 197.91 g/mol</td><td>31422-250G-R</td><td></td></tr><tr><td>iron(III) chloride hexahydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma, 270.30 g/mo)</td><td>F2877-500G</td><td></td></tr><tr><td>zinc chloride anhydrous&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics, 136.29 g/mol</td><td>424592500</td><td></td></tr><tr><td>thiamine hydrochloride</td><td>Sigma, 337.27 g/mol</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptophan</td><td>Fisher Scientific, 204.1 g/mol</td><td>BP395-100</td><td></td></tr><tr><td>L-phenylalanine</td><td>Sigma, 165.19 g/mol</td><td>P5482-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-threonine</td><td>Sigma, 119.12 g/mol</td><td>T8625-100G</td><td></td></tr><tr><td>glycerol anhydrous</td><td>Bio-Lab Itd</td><td>712022300</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamic acid monosodium salts hydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma, 169.11 g/mol</td><td>G1626-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-leucine</td><td>Sigma, 169.11 g/mol</td><td>855448-10G</td><td></td></tr><tr><td>ethanol anhydrous</td><td>Gadot</td><td>830000054</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td>Eddison</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>circular cellulose filter papers</td><td>Whatman, 90 mm</td><td>1001-090</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>EMS, 16% in water</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>sodium cacodylate</td><td>Merck, 214.05 g/mol&amp;nbsp;</td><td>8.2067</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride 2-hydrate</td><td>Merck, 147.02 g/mol&amp;nbsp;</td><td>1172113</td><td></td></tr><tr><td>stub-aluminium mount</td><td>EMS, sloted head</td><td>75230</td><td></td></tr><tr><td>carbon adhesive tape</td><td>EMS</td><td>77825-12</td><td></td></tr><tr><td>Shaker 37 &amp;deg;C</td><td>New Brunswick Scientific Innowa42</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf table top centrifuge 5424</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip</td><td>Branson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubator 30 &amp;deg;C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubator 23 &amp;deg;C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Filter System, 500 ml, polystyrene</td><td>Cornig Incorporated</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II</td><td>Boekel</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>S150 Sputter Coater&amp;nbsp;</td><td>Edwards</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 Critical Point Dryer</td><td>BAL-TEC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Environmental Scanning Electron Microscope</td><td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

methodologies for studying b. subtilis biofilms as a model for characterizing small molecule biofilm inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

펠리클 분석은 B의 높은 규제 및 동적 프로세스를 연구하는 하나의 방법이다 서브 틸리 다세포. 이 외에, 펠리클 분석 한 실험에서 단일 세포 배양 multidish 접시에 미리 시동 조건 또는 소분자 어느 농도의 범위를 테스트하는 데에 적합하다. 그러나, B. 서브 틸리 펠리클 형성은 예비 배양 조건에 민감하다 (예를 들어, 예비 - 배양의 성장 배지 및 성장 단계) 접종 비와 미리...

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Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

methodologies-for-studying-b-subtilis-biofilms-as-model-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

15.1K 조회수.  Weizmann Institute of Science. This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

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Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter 디시 Biofilm 형성 분석

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

연구

면역학 및 감염병학

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells (MBC-P) and Biofilm Cells (MBC-B)

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria are inoculated into the wells of a 96-well microtiter plate. In the case of the planktonic assay, serial dilutions of the antimicrobial agent of choice are added to the bacterial suspensions. In the biofilm assay, once inoculated, the bacteria are left to form a biofilm over a set period of time. Unattached cells are removed from the wells, the media is replenished and serial dilutions of the antimicrobial agent of choice are added. After exposure to the antimicrobial agent, the planktonic cells are assayed for growth. For the biofilm assay, the media is refreshed with fresh media lacking the antimicrobial agent and the biofilm cells are left to recover. Biofilm cell viability is assayed after the recovery period. The MBC-P for the antimicrobial agent is defined as the lowest concentration of drug that kills the cells in the planktonic culture.&#160; In contrast, the MBC-B for a strain is determined by exposing preformed biofilms to increasing concentrations of antimicrobial agent for 24 hr. The MBC-B is defined as the lowest concentration of antimicrobial agent that kills the cells in the biofilm.

Establishing the Minimal Bactericidal Concentration of an Antimicrobial Agent for Planktonic Cells MBC-P and Biofilm Cells MBC-B

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro using a 96-well microtiter plate. Planktonic or biofilm bacteria are exposed to serial dilutions of the antimicrobial agent of choice. Viability is assayed by growth on agar plates.

플랑크토닉 세포(MBC-P) 및 생물막세포(MBC-B)의 항균제 의 최소 박혈 농도 확립

This protocol allows for a direct comparison between planktonic and biofilm resistance for a bacterial strain that can form a biofilm in vitro. Bacteria ...

Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm's tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

엔지니어링 정원 담금질 Lactonases를 사용하여 병원성 바이오 필름의 안티 악성 중단

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

바이오 필름 관련 타겟팅<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt; 사용 레사 주린 기반 약물 감수성 분석

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

천연 화합물 라이브러리의 탐험에 적합 안티 바이오 필름 분석 실험의 플랫폼

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

담 즙 소금 유도 Biofilm 형성 장 병원 체에서: 식별 및 정량화 기술

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are frequently used to cultivate bacterial biofilms for rapid antimicrobial susceptibility testing to calculate minimal biofilm eradication concentration (MBEC) values. Standard biofilm devices consist of polystyrene pegged-lids fitted to 96-well microplates and are ideal for measuring biofilm biomass and MBEC values, but these devices are limited by available peg surface area for biomass accumulation and cost. Here, we outline a protocol to use self-assembled polypropylene 96-well deep well PCR-plate pegged-lid device to grow Escherichia coli BW25113 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilms. A comparison of 24-hour biofilms formed on standard and deep well devices by each species using crystal violet biomass staining and MBEC determination assays are described. The larger surface area of deep well devices expectedly increased overall biofilm formation by both species 2-4-fold. P. aeruginosa formed significantly greater biomass/mm2 on deep well pegs as compared to the standard device. E. coli had greater biomass/mm2 on standard polystyrene devices as compared the deep well device. Biofilm eradication assays with disinfectants such as sodium hypochlorite (bleach) or benzalkonium chloride (BZK) showed that both compounds could eliminate E. coli and P. aeruginosa biofilms from both devices but at different MBEC values. BZK biofilm eradication resulted in variable E. coli MBEC values between devices, however, bleach demonstrated reproducible MBEC values for both species and devices. This study provides a high throughput deep well method for growing larger quantities of biofilms on polypropylene devices for downstream studies requiring higher amounts of static biofilm.

This protocol presents methodology to perform biofilm growth and biomass measurements using self-assembled deep well PCR-plate devices for high-throughput 96-well pegged lid static biofilm screening.

PCR-플레이트 딥웰 마이크로플레이트 장치를 이용한 더 큰 박테리아 바이오필름 바이오매스의 생성

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are ...

Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods

The presence of biofilms in the dairy industry is of major concern, as they may lead to the production of unsafe and altered dairy products due to their high resistance to most clean-in-place (CIP) procedures frequently used in processing plants. Therefore, it is imperative to develop new biofilm control strategies for the dairy industry. This protocol is aimed at evaluating the efficacy of organic peroxyacids (peracetic, perpropionic, and perlactic acids and a commercial peracetic acid-based disinfectant) for eradicating dairy biofilms using a combination of static and dynamic methods. All the disinfectants were tested on the strongest biofilm-producing bacteria in either a single or a mixed biofilm using the minimum biofilm eradication concentration (MBEC) assay, a static high-throughput screening method. A contact time of 5 min with the disinfectants at the recommended concentrations successfully eradicated both the single and mixed biofilms. Studies are currently ongoing to confirm these observations using the Center for Disease Control (CDC) biofilm reactor, a dynamic method to mimic in situ conditions. This type of bioreactor enables the use of a stainless-steel surface, which constitutes most industrial equipment and surfaces. The preliminary results from the reactor appear to confirm the efficacy of organic peroxyacids against biofilms. The combined approach described in this study may be used to develop and test new biological or chemical formulations for controlling biofilms and eradicating microorganisms.

This protocol describes an approach combining static and dynamic methods to evaluate the efficacy of organic peroxyacids for eradicating biofilms in the dairy industry. This approach may also be used to test the effectiveness of new biological or chemical formulations for controlling biofilms.

정적 방법과 동적 방법을 결합한 접근법을 사용하여 낙농 생물막을 박멸하기 위한 유기 과산화산의 효능 평가

The presence of biofilms in the dairy industry is of major concern, as they may lead to the production of unsafe and altered dairy products due to their ...

유학을위한 방법론

요약

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