Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation - Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.

1. valutare l&#39;effetto di piccole molecole inibitori sulla Pellicle e la formazione di biofilm Colony <ol><li> Preparare una soluzione di 2x definito medio MSgg biofilm che inducono 25 senza il cloruro di calcio e ferro (III) cloruro esaidrato. Dopo la sterilizzazione del filtro, aggiungere il cloruro di calcio. Il mezzo è pronto all&#39;uso direttamente oppure può essere conservato a 4 ° C al buio. </li><li> Preparare la diluizione 1x MSgg il giorno dell&#39;esperimento. <ol><li> Diluire il mezzo 2x MSgg a 1x con acqua distillata sterile (pellicole) o agar sterile 3% calda (80 ° C) (biofilm) e aggiungere ferro (III) cloruro esaidrato ad una concentrazione finale di 50 pM (pellicole) o 250 pM ( biofilm). Aggiungere antibiotici o piccole molecole inibitrici alla concentrazione desiderata e mescolare bene. Ad esempio, per ottenere una concentrazione finale di 0,5 mM D-leucina in 30 ml di stabilire pellicole o biofilm, aggiungere 196,6 ml di un 76,3 mM (10 mg / ml) di soluzione D-leucina. NOTE:. La composizione finale 1x MSgg sono descritte nella Tabella 1 Rispetto alla ricetta originale 25, il mezzo conteneva 50 ug / ml treonina e la concentrazione di ferro per crescere colonie biofilm su terreno solido MSgg stato aumentato 2.5x per ottimizzare la morfologia delle colonie rugosa . </li></ol></li><li> Dopo la solidificazione del agar, asciugare le piastre MSgg solidi in una cappa biologica per 30-45 minuti prima della inoculazione. </li><li> Per selezionare inibitori specifici che interferiscono con i meccanismi di formazione pellicola (figura 1), esclude che le concentrazioni utilizzate influenzano planctonici e crescita statica. <ol><li> Determinare crescita planktonic (aumento della densità ottica nel tempo in coltura liquida) in una curva di crescita semplice misurando la densità ottica a 600 nm ogni ora fino alla fase di crescita stazionaria. </li><li> Per confermare che la torbidità cultura misurata rappresenta conta di cellule vive, determinare il numero di unità formanti colonia (CFU)di cellule in fase di crescita planctonici da una coltura agitando dopo diversi punti temporali. </li><li> Per valutare l&#39;effetto di piccole molecole inibitrici sulla crescita pellicola statica, cellule raccolto alla fine di una incubazione di 3 giorni a 23 ° C da 24 pozzetti coltura cellulare e, inoculato nelle stesse condizioni come descritto nelle sezioni 1,7-1,9 e determinare la CFU. Per questo controllo, utilizzare un ceppo pellicola con deficit che manca i operoni che codificano per i componenti della matrice extracellulare (vale a dire, B. subtilis Δ epsH, Δ TASA). NOTA: Questo ceppo è in grado di crescere in condizioni statiche, ma a differenza di un ceppo selvatico pellicle-formatura, è carente nella capacità di galleggiare all&#39;interfaccia liquido-aria, la cui crescita è favorita a causa di un aumento dei livelli di ossigeno 26. Così, questo da matrice extracellulare e la tensione pellicola-carente è un ceppo di riferimento consigliato per valutare la crescita in condizioni statiche. NOTA: Per la specifica exampio del non canonica D-amino acido D-leucina descritte di seguito, un effetto sulla planctonici e la crescita statica a concentrazioni che interferivano con la formazione di pellicola è stato escluso 12,17. I metodi per determinare planctonici e crescita statica sono descritte in dettaglio 17. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig1.jpg" /> Figura 1. panoramica concettuale per l&#39;identificazione di un robusto apparato sperimentale per valutare l&#39;inibizione specifica della formazione di biofilm. I criteri di selezione per le piccole molecole inibitrici che indicano l&#39;interferenza specifico con la formazione di biofilm, senza effetto pronunciato sulla crescita planctonici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="5"><li> Streak fuori B. subtilis da un C magazzino -80 ° (LB culture di 10 9 cellule / ml congelati in glicerolo al 20%) per isolare singole colonie su una piastra di agar-% 1,5 LB con una punta sterile o un bastoncino applicatore. </li><li> Crescere notte a 30 ° C. </li><li> PUNTO CRITICO: Per una robusta inibizione pellicola dagli acidi non canonica D-amino come D-leucina, crescere una singola colonia prelevata dal% piastra di agar-1.5 LB in 3 ml brodo LB a 37 ° C per 4 ore in un agitazione incubatore (velocità di agitazione 200 rpm). Sostituire il brodo LB con il mezzo MSgg biofilm che inducono prima inoculazione mediante centrifugazione cultura 1,5 ml di avviamento per 4 min a 6.000 xg, rimuovere con attenzione il surnatante e ri-sospensione il pellet in 1,5 ml di mezzo MSgg. Il resto della coltura può essere scartato. Importante: Per garantire la robustezza del sistema, la densità ottica a 600 nm (OD 600) della coltura starter lavato dovrebbe essere compreso tra 0,6 e 1. </li><li> Durante la crescita della coltura starter, preparare un 12-pozzetti di coltura cellulare plate multidish contenentg 3 ml di terreno MSgg senza o con un intervallo di concentrazione della piccola molecola inibitore (ad esempio, 0,3, 0,5, 1 mM D-leucina 17). Per escludere effetti di bordo, distribuire la collocazione delle diverse concentrazioni di tutta la piastra multidish. In alternativa, utilizzare 24 pozzetti coltura cellulare piastre multidish contenente 1,5 ml di terreno MSgg. </li><li> Inoculare pozzetti della coltura cellulare piastra multidish 12 pozzetti con 3 ml di coltura starter lavato (1: 1.000 diluizione). NOTA: Un rapporto di diluizione inferiore, cioè, 1: 500 può essere utilizzato. Questo riduce il tempo di sviluppo delle pellicole. </li><li> Grow le pellicole a 23 ° C in condizioni statiche per tre giorni. Non spostare le pellicole durante questo tempo, in quanto può influenzare la morfologia superficiale finale della pellicola. </li><li> Acquisire le immagini con un&#39;esposizione binoculare e omogeneo di fulmini. In alternativa, fare una foto delle pellicole con una fotocamera ad alta risoluzione. Per evitare artefatti causati da inconsisangoli di luce tenda e ombre, scattare foto top-down con la telecamera fissa su un treppiede e utilizzare una fonte di luce morbida e grande a 45 ° da entrambi i lati. NOTA: Un metodo alternativo per studiare B. subtilis pluricellularità è il saggio colonia di biofilm su, terreno solido biofilm che inducono MSgg. Come pellicole, questo test permette lo studio dei processi spazio-temporali. Una volta che la gamma attiva delle piccole molecole inibitrici è determinata, il loro effetto sulla formazione di biofilm colonia può essere studiato. </li><li> Per crescere colonie biofilm, simmetricamente individuare 1,5 ml di non lavato precoltura (Passo 1.7) sul MSgg 1,5% agar essiccato con l&#39;aiuto di un modello - 4 gocce per Petri di 8,5 cm di diametro. Lasciate che le gocce adsorbono alla piastra prima di muoversi. NOTA: Il modello consente di ottenere una distribuzione uniforme delle colonie biofilm all&#39;interno della zona dove si coltivano le cellule. Per preparare il modello, disegnare l&#39;area totale della crescita su scale originali, dividerlo alla parità di settaors e marcare il centro. Per un giro Petri di 8,5 cm di diametro, questo assegna 14 centimetri 2 di una colonia biofilm. </li><li> Incubare le piastre a 30 ° C per tre giorni. Durante questo tempo, colonie biofilm sviluppano e formano un tridimensionale, struttura rugosa. </li><li> Scattare foto come al punto 1.11. </li></ol> 2. Etanolo Resistenza Assay <ol><li> Crescere biofilm come descritto ai punti 1,1-1,7 e 1.12-1.14. </li><li> Dopo 68 h di crescita a 30 ° C, tagliare le colonie biofilm in due parti uguali con l&#39;aiuto di una lama di rasoio e il modello. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig2.jpg" /> Figura 2. Esempio disegno sperimentale per valutare la resistenza delle cellule biofilm colonie di agenti sterilizzanti. (A) Template utilizzato per la distribuzione uniforme delle colonie biofilm attraverso una piastra di Petri e per il taglio. (B)immagini top-down non trattati wild-type biofilm coltivate per 68 h su terreno solido, definito biofilm che inducono MSgg a 30 ° C. L&#39;ingrandimento mostra come una colonia biofilm può essere tagliato in due metà uguali. (C) Le due metà uguali biofilm sono trattati allo stesso modo (il controllo, PBS) o sia con PBS o agente sterilizzante e trattati come descritto. Bar Scala:. 1 cm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="3"><li> Sollevare attentamente ciascuna metà della colonia biofilm dalla piastra di agar con una piccola spatola e spostarlo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 500 ml di tampone fosfato salino (PBS). Se necessario, raschiare le cellule rimanenti dalla piastra e trasferirli provetta pure. NOTA: La seconda metà della colonia biofilm viene trattato differentemente, a seconda che esso è il controllo o per testare la resistenza alla steriAgenti Lizing. </li><li> Per il controllo, incubare la seconda metà della colonia biofilm in 500 microlitri di PBS come al punto 2.3. Per valutare la resistenza agli agenti sterilizzanti, trasferire la seconda metà della colonia biofilm a 500 microlitri 50% (v / v) etanolo. NOTA: sterilizzazione alternativo agenti come ipoclorito di sodio possono essere usati. Per tutti gli agenti sterilizzanti utilizzati, determinare il tempo di concentrazione e incubazione attiva in un esperimento preliminare. </li><li> Incubare le colonie biofilm per 10 min sul banco a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare le colonie biofilm per 5 min a 18.000 xg e rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta. Aggiungere 300 ml di PBS. </li><li> Sonicare cellule leggermente (ampiezza 10%, impulso 5 sec) con lo micropunte di un sonicatore. NOTA: L&#39;energia sonicazione deve essere sufficiente ad aggregati biofilm separati. Tuttavia, troppo dura sonicazione può lisi delle cellule. Confermare in anticipo al microscopio ottico che l&#39;energia sonicazioneutilizzati non lisare le cellule e che tutti gli aggregati sono dissolti. </li><li> Aggiungere 700 microlitri di PBS fino ad un volume finale di 1 ml. Eseguire una diluizione seriale (a 10 -7) in PBS e diffondere 100 ml di 3 diluizioni su una piastra di agar-% 1,5 LB utilizzando microsfere di vetro sterili. NOTA: Le diluizioni ottimali per essere placcato dovrebbe essere determinata in un esperimento preliminare, in quanto dipende dalla quantità di cellule nella colonia biofilm di interesse e il tasso di sopravvivenza delle cellule in risposta all&#39;agente sterilizzante. </li><li> Incubare le piastre notte a 30 ° C, contare il CFU e determinare CFU / ml. Dalla finale CFU / ml di ciascuna delle colonie mezzo biofilm, calcolare la percentuale di sopravvissuti. NOTA: Quando eseguito e analizzato come descritto, le due metà della colonia di controllo biofilm e trattata contro etanolo trattata la metà della colonia biofilm greggia dovrebbe produrre differenze inferiori al 10% della conta delle cellule vitali, verificando la simmetria o la resistenza della colonia , faucibusctively. In alternativa, i risultati possono essere rappresentati in totale CFU. I conteggi di cellule di controllo e non trattato colonia biofilm dovrebbero rimanere nello stesso ordine di grandezza. Al contrario, i conteggi cellulari del mezzo etanolo trattata di una piccola molecola biofilm colonia trattati dovrebbero scendere da un minimo di due ordini di grandezza la rivendicazione per una maggiore sensibilità all&#39;agente sterilizzante. </li></ol> 3. biofilm Colony Preparazione del campione per la microscopia elettronica a scansione <ol><li> Crescere colonie biofilm come descritto nei passaggi 1,1-1,7 e 1.12-1.14. </li><li> Preparare una serie fresca di 2% (v / v) glutaraldeide, 3% (v / v) di paraformaldeide in 100 mM cacodilato di sodio, 5 mM di tampone di cloruro di calcio, pH 7.3. Preparare 5 ml di fissativo per ogni capsula di Petri di 8,5 cm di diametro. ATTENZIONE: glutaraldeide e paraformaldeide sono pericolosi. li maneggiare con dispositivi di sicurezza all&#39;interno di una cappa chimica. Eliminare le soluzioni ed i materiali contaminati al hazrifiuti ardous. </li><li> Aggiungere con cautela il fissativo alle colonie biofilm, senza l&#39;erogazione direttamente sulla parte superiore dei biofilm. NOTA: A causa del carattere idrofobico della colonia biofilm, le colonie staccano lentamente dalla agar ed iniziano a galleggiare. </li><li> sigillare accuratamente le piastre con una striscia di Parafilm. Incubare su un agitatore rotante per 2 ore a temperatura ambiente e successivamente trasferire le piastre a 4 ° C per una notte. </li><li> Il giorno successivo, rimuovere con cautela il liquido con una pipetta Pasteur di vetro collegato ad una pompa a vuoto. </li><li> Aggiungere con cautela 10 ml 100 mM cacodilato di sodio, 5 mM di tampone cloruro di calcio per lavare il biofilm e incubare per 5 min. Rimuovere delicatamente il liquido con la pipetta Pasteur di vetro da un angolo del piatto per evitare di danneggiare il biofilm e aggiungere la soluzione di lavaggio fresca delicatamente pipettando. Ripetere questa operazione una sola volta. </li><li> Per la disidratazione delle colonie biofilm, procedere con le seguenti operazioni: 2 x 5 min in DDH 2 O; 2x 20 min a 30% di etanolo; 2x 20 min in etanolo al 50%; 2x 20 min in etanolo al 70%; 2x 20 min in etanolo al 96%; 2x 30 min a 100% di etanolo. <ol><li> Aggiungere 15 ml di liquido per ogni piatto Petri di 8,5 cm di diametro in ogni passo e rimuovere il liquido accuratamente dopo ogni incubazione. </li></ol></li><li> Utilizzare uno dei due metodi differenti per asciugare i campioni da etanolo. <ol><li> Per l&#39;aria di essiccazione da etanolo: <ol><li> Tagliare un filtro di carta di cellulosa (diametro di 9 cm) in quarti. Brevemente immergere un quarto in 100% di etanolo, e poi trasferire con cura uno galleggiante biofilm colonia su di esso. Mettere la carta da filtro bagnata in una capsula di Petri foderato con carta da filtro. Coprire la piastra di Petri e lasciare che le colonie biofilm asciugare per una notte in una cappa chimica. </li></ol></li><li> Per punto critico (CP) -Essiccazione utilizzando anidride carbonica (CO 2) come fluido di transizione: <ol><li> Riempire il 75% della camera di critica macchina a punti di asciugatura con etanolo al 100%. Trasferire i campioni in un supporto, ogni campione nel proprio cHamber. Se necessario, tagliare il biofilm con le forbici in piccoli pezzi. Lasciare i campioni immersi in etanolo durante tutte le manipolazioni. Quindi, trasferire il supporto nella camera e chiudere la camera ermeticamente. </li><li> Raffreddare la camera al 7 ° C e iniziare a mescolare. Riempire la camera completamente con CO 2 liquida. Nel corso di un periodo di incubazione 7 min, lasciare che la miscela di etanolo con la CO 2. Poi, scarico 25% della soluzione. NOTA: Non svuotare la camera di sotto del livello del campione. </li><li> Ripetere il punto 3.8.2.2 quattro volte. </li><li> Ripetere il punto 3.8.2.2 cinque volte con un tempo di incubazione di soli 5 min. Infine, l&#39;etanolo dovrebbe essere completamente sostituita da CO 2. </li><li> Durante l&#39;ultimo giro, vuoto solo il 5% della camera. Spegnere l&#39;agitazione e il raffreddamento. Avviare riscaldamento della camera a 42 ° C. Ad una temperatura di 31,1 ° C e una pressione di 73,9 bar, il liquido CO 2 raggiunge il suo punto critico, lo stato in cui il ph gassosaase ha la stessa densità della fase liquida del solvente 27. Quando la temperatura raggiunge 42 ° C, incubare per 10 min. A 42 ° C, la CO 2 nella camera esiste come gas supercritico. NOTA: controllare costantemente la pressione della camera. La pressione non deve superare i 120 bar a 42 ° C. </li><li> Iniziare a rilasciare lentamente il gas con riscaldamento continuo. Ciò mantiene i campioni nella fase CO 2 -Gas e impedisce la deformazione della morfologia campione attraverso la tensione superficiale del liquido. Impostare il misuratore di portata a 5 l / h per la messa a punto la valvola di dosaggio che controlla il misuratore di portata. Attendere fino al rilascio del tutto la pressione nella camera. Ora aprire la camera e rimuovere i campioni con cautela dal supporto. </li></ol></li></ol></li><li> Coat un microscopio elettronico a stub con nastro di carbonio. Con l&#39;aiuto di pinzette, trasferire accuratamente le colonie biofilm sul stub. Collegare ogni colonia allo stub con l&#39;aggiunta di un sottile ponte da autonastro bon, che è cruciale per l&#39;eliminazione carica sotto il fascio di elettroni. In questa fase, gestire le colonie biofilm con cura in quanto sono molto fragili. Conservare i campioni in un essiccatore per almeno 24 ore o fino esame. </li><li> Il giorno dell&#39;esame con il microscopio elettronico a scansione, le colonie biofilm per 2 minuti per polverizzazione catodica-coat in un angolo di 60 ° in un oro-palladio polverizzazione-dispositivo a induzione. Ripetere questa operazione due volte e ruotare i campioni di 120 ° in mezzo. Alla fine, i campioni sputter-coat volta per 3 min dall&#39;alto. Il sottile strato di 20 nm di oro-palladio migliora la conducibilità e migliora il contrasto del campione per l&#39;imaging SEM. </li><li> Conservare i campioni in un essiccatore per evitare la reidratazione del campione 28 fino l&#39;imaging con un microscopio elettronico a scansione 29,30. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bacillus subtilis forme robuste e altamente strutturati biofilm sia a liquido (pellicole) e su terreno solido (colonie). Quindi, serve come organismo modello ideale per caratterizzare la modalità d&#39;azione degli inibitori specifici biofilm. Il supporto solido, cellule formano strutture multicellulari con caratteristiche distintive che non sono evidenti in pellicole, come rughe irradiano dal centro verso il bordo. Così, pellicole e le colonie sono sistemi complementari per lo studio B. subtilis plu...

comunità batteriche multi-cellulari giocano un ruolo significativo in ambienti naturali e antropici, e può essere utile o altamente deleterio. Queste colonie multicellulari sono noti come biofilm, in cui le singole celle sono incorporate in una matrice sostanze polimeriche extracellulari autoprodotti (EPS). L&#39;EPS aderiscono fortemente le cellule alla superficie colonizzano. Essi servono come scudo contro le forze meccaniche e chimiche e creano stretto contatto tra cellule vicine, facilitando comunicazione cellulare 1. Un biofilm può essere visto come una comunità differenziate, in cui le cellule uso altamente regolati, orchestrato processi per coordinare le loro attività all&#39;interno della comunità, così come tra le specie 2-5. Il passaggio da un planctoniche, modalità di vita libera di crescita a uno stato biofilm è spesso associata a processi di sviluppo. Un buon esempio è il Bacillus subtilis batterio del suolo Gram-positivi, e quindi un undómëceppo sticated serve come un modello robusto organismo per studiare le fasi di sviluppo che portano alla formazione di biofilm. In questo batterio, cellule mobili si organizzano in strutture multicellulari cospicui che svolgono mansioni specializzate 4. Un gruppo di cellule, la matrice-produttori secernono esopolisaccaridi 6, la proteina amiloide ATAS 7,8, e la proteina di superficie hydrophobicity BSLA 9,10; ognuno dei quali partecipare all&#39;Assemblea degli EPS 11-13. Data l&#39;abbondanza di biofilm in nicchie naturali e antropici e il danno fatale putativo possono causare, vi è un urgente bisogno di trovare modi per prevenire la loro formazione. Gli inibitori di piccole molecole in grado di aiutare nella scoperta di nuovi percorsi normativi, enzimi e proteine ​​strutturali coinvolte nella formazione di biofilm, e, quindi, di promuovere approfondimenti nei complessi processi di assemblaggio comunità multicellulare. Come B. subtilis è un modello ben studiato per la biofilmazione 14,15, può essere utilizzato per valutare gli effetti di vari inibitori biofilm. Questo studio affronta quattro metodi fondamentali che sono fondamentali per la valutazione della risposta dei biofilm a piccole molecole inibitrici. Innanzitutto, per garantire che questi inibitori hanno un obiettivo specifico biofilm, la separazione degli effetti sulla crescita planctonici dall&#39;effetto sulla formazione del biofilm è critica. La maggior parte degli agenti antibatterici colpire le cellule nella loro fase di crescita planctonici, ma le molecole che hanno come target lo stile di vita biofilm sono rari. Inoltre, come le molecole che non influenzano la crescita planctonici non sono tossici, possono ridurre la pressione selettiva che favorisce i mutanti resistenti agli antibiotici 16. Per esempio, quando biofilm sono trattati con D-amminoacidi o alcune altre molecole parete cellulare interferente, o sono disturbati o smontati, ma questi inibitori riguardano solo lievemente planktonic 12,17 crescita. Al contrario, molti antibiotici alterano drammaticamente la crescita planctonici, con little o nessun effetto sulla formazione di biofilm 17. In secondo luogo, che stabilisce un quadro sperimentale consistente e robusto per studiare l&#39;effetto delle piccole molecole è fondamentale. Abbiamo osservato che l&#39;intervallo di concentrazione attiva delle piccole molecole inibitrici era sensibile alle condizioni pre-coltura e alla configurazione sperimentale utilizzato per studiare l&#39;effetto di queste piccole molecole inibitrici. Diversi rapporti, in particolare quelli che studiano B. subtilis, rivelato variazioni nell&#39;intervallo di concentrazione in cui D-amminoacidi inibiscono la formazione di pellicole - i galleggianti biofilm batterici 12,17-19. I risultati qui presentati indicano che i seguenti fattori rappresentano differenze nella gamma di concentrazione attiva: le condizioni di pre-coltura (logaritmica 12,17 contro fase tardo-stazionaria 20 di crescita), il terreno di coltura utilizzato nella condizione di pre-cultura (ricco, indefinita [Luria Broth, LB] contro definito [glutammato monosodico-glycerol, MSgg]), il rapporto di inoculazione e soprattutto la rimozione del mezzo di precoltura prima dell&#39;inoculo. La temperatura di crescita pellicola statica mostrato un ruolo meno importante nella gamma attività della piccola molecola inibitore D-leucina, acido rappresentante D-amino utilizzato in questo studio. Infine, una volta che i biofilm sono trattati con inibitori biofilm specifici, metodi robusti e informativi sono necessari per caratterizzare gli effetti di questi inibitori sui biofilm fitness. Qui, due metodi per caratterizzare in modo indipendente l&#39;effetto di piccole molecole inibitrici sono descritte in dettaglio: (1) L&#39;effetto sulla singole celle all&#39;interno di una colonia di biofilm e la loro resistenza agli agenti antimicrobici. Le cellule in biofilm sono in genere più resistenti agli antibiotici rispetto ai batteri a vita libera 21-23. Mentre questo fenomeno è multifattoriale, la capacità dell&#39;EPS per ridurre la penetrazione antibiotico è spesso considerata come una spiegazione attraente 24 </sup&gt;. Questo metodo valuta la sopravvivenza delle cellule biofilm prestabiliti dopo l&#39;esposizione a sostanze antibatteriche. (2) L&#39;effetto sull&#39;architettura biofilm colonia, dalla grande alla piccola scala. colonie Biofilm sono caratterizzati dalla loro struttura tridimensionale e la presenza di EPS. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, cambiamenti nella morfologia cellulare, struttura colonia biofilm e l&#39;architettura e l&#39;abbondanza dei EPS possono essere visualizzati dal grande (mm) alla piccola scala (micron).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="897">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Luria Broth, Lennox</td>
			<td style="width:305px;">Difco</td>
			<td style="width:127px;">240230</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potassium phosphate dibasic&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher Scientific, 209.27 g/mol</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnesium chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Merck, 203.30 g/mol&#160;</td>
			<td>1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride anhydrous</td>
			<td>J.T. Baker, 110.98 g/mol</td>
			<td>1311-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma, 197.91 g/mol</td>
			<td>31422-250G-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iron(III) chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma, 270.30 g/mo)</td>
			<td>F2877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">zinc chloride anhydrous&#160;</td>
			<td>Acros Organics, 136.29 g/mol</td>
			<td>424592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">thiamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma, 337.27 g/mol</td>
			<td>T1270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-tryptophan</td>
			<td>Fisher Scientific, 204.1 g/mol</td>
			<td>BP395-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma, 165.19 g/mol</td>
			<td>P5482-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-threonine</td>
			<td>Sigma, 119.12 g/mol</td>
			<td>T8625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol anhydrous</td>
			<td>Bio-Lab Itd</td>
			<td>712022300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamic acid monosodium salts hydrate&#160;</td>
			<td>Sigma, 169.11 g/mol</td>
			<td>G1626-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-leucine</td>
			<td>Sigma, 169.11 g/mol</td>
			<td>855448-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ethanol anhydrous</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>830000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">razor blade</td>
			<td>Eddison</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">circular cellulose filter papers</td>
			<td>Whatman, 90 mm</td>
			<td>1001-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glutaraldehyde</td>
			<td>EMS (Electron Micoscopy Science), 25% in water</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>EMS, 16% in water</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium cacodylate</td>
			<td>Merck, 214.05 g/mol&#160;</td>
			<td>8.2067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride 2-hydrate</td>
			<td>Merck, 147.02 g/mol&#160;</td>
			<td>1172113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stub-aluminium mount</td>
			<td>EMS, sloted head</td>
			<td>75230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">carbon adhesive tape</td>
			<td>EMS</td>
			<td>77825-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker 37&#176;C</td>
			<td>New Brunswick Scientific Innowa42</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf table top centrifuge 5424</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:301px;">Digital Sonifier, Model 250, used with Double Step Microtip</td>
			<td>Branson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator 30 &#176;C</td>
			<td>Binder</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator 23 &#176;C</td>
			<td>Binder</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter System, 500 ml, polystyrene</td>
			<td>Cornig Incorporated</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotary Shaker - Orbitron Rotatory II</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S150 Sputter Coater&#160;</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CPD 030 Critical Point Dryer</td>
			<td>BAL-TEC</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Environmental Scanning Electron Microscope</td>
			<td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodologies for studying b. subtilis biofilms as a model for characterizing small molecule biofilm inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Il saggio pellicle è un metodo per studiare i processi altamente regolamentati e dinamici di B. subtilis pluricellularità. Oltre a questo, il saggio pellicle è adatto per testare una serie di condizioni sia di pre-avviamento o concentrazioni molecola di piccole dimensioni in un piatto multidish singola cella-cultura in un esperimento. Tuttavia, B. subtilis formazione pellicle è sensibile alle condizioni pre-coltura (ad esempio, crescita media del pre-coltura e la sua fase di crescita), il ...

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Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologie per lo studio<em&gt; B. subtilis</em&gt; I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

methodologies-for-studying-b-subtilis-biofilms-as-model-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

15.0K Views.  Weizmann Institute of Science. This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

Nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere Camera

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

L&#39;uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Ricorrente cheratite erpetica Stromal in Mouse, un modello per lo studio HSK umano

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Infezione sperimentale con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Come modello per lo studio Host Interferone-gamma Risposte

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modello murino di Gruppo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonizzazione vaginale

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...