저자는 크리스토퍼 씨 응우 엔, 아론 헌터와 슈 리브 포트의 Jumpstart, SMART 및 Biostart 교육 프로그램의 지원뿐만 아니라, 생물 물리학, 슈 리브 포트, LA의 100 주년 대학 루이지애나의 부서를 인정하고 싶습니다.

150mm 직경 전단 반지의 1. 건설 (그림 1) 주 : 전단 링은 외측 페트리 접시 크기를 변화 상이한 총 표면적 세포 수율 장치에서 생성 및 전단력의 범위를 개발하여 다양한 크기를 생성하도록 구성 될 수있다. 이 보고서는 98cm 2 (그림 2)의 전체 면적에 대한 내부 100mm 접시와 결합 된 150mm 요리에 대해 설명합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig1.jpg" /> 도 1 전단 링 조립체. 도면의 상부에는 부분적으로 조립 된 전단 고리를 나타낸다. 단단한 시일이 완전 내외 식기 사이에 형성되지 않은 경우 전송 피펫과 3mm의 구멍을 염화 메틸렌 0.5 ml에 주입한다. 전단 고리 내측 주위 EDG 실리콘 고무 접착제의 두께 1㎜ 비드를 적용하여 정지 밀봉전단 링 상단의 전자. 도면의 하단 부분은 조립 전단 고리를 나타낸다. 청색 도금 내피 세포의 영역을 나타낸다. 외부 및 내부 빨간색 화살표가 궤도 쉐이커에 배치 된 전단 링 내부의 전단 링과 미디어의 궤도 운동을 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig2.jpg" /> (안 비율로 도시)는 150mm 전단 링 그림 2. 표면 측정. 최고 패널이 궤도 회전에 응답하여 외부 링으로 유체의 원심 이동을 보여줍니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 를 생성하여 전단 링 건설 템플릿 만들기150 밀리 원의 중심에 배치 된 100mm 내경 프레젠테이션 소프트웨어 150mm 외연 단면도. A4 흰색 용지에 템플릿을 인쇄합니다. </li><li> 피펫 150 밀리 유리 페트리 접시에 염화 메틸렌 (디클로로 메탄)의 10 ㎖. 염화 메틸렌 대부분 플라스틱 가용화 및 플라스틱 부품 가입 여기서 사용 된 바와 같이 접시 유리하지 폴리스티렌 (또는 다른 비닐 수지) 인 것이 중요하다. 주의 : 적절한 후드 환기 모든 건설 용 장갑을 사용하십시오. 메틸렌 클로라이드를 접촉 자극이며 간독성이다. </li><li> 외부 전단 링 템플릿 상에 150mm 플라스틱 페트리 접시를 맞 춥니 다. </li><li> 회전 공구를 사용하여 100mm 접시의 중심에서 3mm의 구멍을 뚫는다. 시추에서 생산되는 모든 플라스틱 부스러기를 제거합니다. </li><li> 장갑을 낀 손으로 잡고 있지만, 반전 약 3 초 동안 메틸렌 클로라이드 풀에 이전 단계에서 100mm 페트리 접시의 위쪽 가장자리를 찍어. </li><li> 트랜스선봉은 신중하게 표시된 템플릿 상에 100mm 접시를 정렬하는 150mm 접시의 중심 상에 100mm 접시 가장자리 다운 &quot;젖은&quot;. 메틸렌 클로라이드는 100mm와 150mm 요리 접합 플라스틱 융합된다. 조심스럽게 100mm 접시를 시계 방향으로 회전하고 몇 번 반 시계 방향으로 150 밀리미터 접시에 우수한 접착 성을 보장하기 위해. 참고 : 외부 접시의 중심에 내부 접시의 적절한 정렬을 보장하기 위해 상당한주의를 기울입니다. 편심 정렬은 전단 링에서 서로 다른 위치에서 전단 응력의 변화가 발생할 수 있습니다. 염화 메틸렌 실수로 100mm 접시의 위치 동안 150mm 페트리 접시의 바깥 쪽 트랙 부분에 물방울을 허용하지주의하십시오. 이는 유동 교란을 일으킬 수있는 표면에 요철을 만들어 세포가 성장되는 바닥면에 플라스틱을 용융한다. </li><li> 염화 메틸렌 건조되면, 이상 새로 결합 된 배양 접시를 뒤집어 신중을 보장하기 위하여 접촉 포인트를 검사꽉 도장은이 배양 접시 사이에 형성되고있다. </li><li> 단단한 시일이 완전히 형성되지 않으면, 전송 피펫과 3mm의 구멍을 염화 메틸렌 0.5 ml에 주입. 접시를 들고 부드럽게는 염화 메틸렌 가장자리에 도달 할 수 있도록 회전합니다. 주 : 너무 빨리 회전하면, 염화 메틸렌 세포가 성장할 표면 변형과 전단 파괴 링은 150mm 접시의 외측 부분으로 유출 할 수있다. 누출 전단 링은 폐기해야합니다. </li><li> 실리콘 고무 시일의 3mm의 비드를 적용하여 100mm 접시 구멍을 봉쇄. </li><li> 평평한 절삭 헤드가 장착 된 회전 공구를 사용하여, 캡 아래 튜브의 적어도 1cm 떠나는 15 ml의 폴리스티렌 원뿔형 조직 배양 튜브의 상부 3cm 부를 잘라. 밋밋은 절삭 헤드의 평탄면을 사용까지 절단 튜브의 에지 연마. 연마에 의해 생성 된 모든 플라스틱 부스러기를 제거합니다. </li><li> 상에 차단 15 ml의에게 원뿔 튜브를 추적약 0.5 cm 떨어진 접시 가장자리로부터 마커와 150mm 접시 뚜껑. 약 원의 가장자리 1~2mm을 여백을 남겨 그려진 원 안에 구멍을 드릴. </li><li> 드릴 구멍을 통해 차단 원뿔 튜브 탑을 배치합니다. 전달 피펫을 사용하여, 150mm의 뚜껑 원뿔형 튜브에 결합하는 원뿔형 튜브의 절단 모서리에 염화 메틸렌 250 μL를 적용한다. </li><li> 상단 페트리 접시의 내주 주위에 실리콘 고무 밀봉 제의 1 mm 두께의 비드를 적용하여 150mm 접시 상 150mm 뚜껑을 밀봉. </li></ol> 전단 반지의 2. 살균 <ol><li> 피펫 인산 약 10 ㎖를 15 ㎖의 원뿔형 튜브 포트를 통해 새로 형성된 전단 링에 완충 식염수. 전단 링 내부의 이물질을 제거하기 위해 주위에 소용돌이 친다. 파스퇴르 피펫 / 진공 흡입기와 인산염 완충 생리 식염수를 제거합니다. </li><li> 이물질이 제거 될 때까지 이전 단계를 반복합니다. </li><li> steri하려면리제 전단 링, UV 조사와 70 % 에탄올 세정을 조합하여 사용한다. <ol><li> 액세스 포트를 통해 배출 캡, 피펫 70 % 에탄올의 약 10 ml의 나사를 풀고, 그리고 다시 뚜껑을 조입니다. 회전 전단 링의 내부를 철저히 세척 보장, 전단 링을 여러 번 뒤집어. </li><li> 흄 후드에서 초과 70 % 에탄올을 대기음. 스프레이 병으로, 철저하게 70 % 에탄올로 모자와 액세스 포트를 스프레이. </li><li> 완전히 건조 될 때까지 조직 문화 후드 내에서 자외선 아래에서 전단 링과 캡을 놓습니다. </li></ol></li><li> 세포 배양 도금에 사용되는 때까지 건조한 후, 실온에서 다시 모자 및 저장 멸균 전단 링을 조입니다. </li></ol> 3. 전단 응력 연구 <ol><li> 형질 내피 세포주 4 분할 비 : 통상적으로 (1)를 이용한 표준 세포 배양 프로토콜 다음 멸균 전단 링 내피 세포 접시. 참고 : 쥐 망막 microvascular 내피 세포 상업적으로 수득 하였다. 인간의 두뇌 내피 세포 (hCMEC / D3) 세포는 박사 피에르 - 올리버 Couraud (INSERM, 프랑스)에서 관대 한 선물로 제공하고 완전한 내피 기초 매체 (EBM)에서 배양 하였다. </li><li> 문화가 이전의 흐름 연구의 시작에 합류에 도달 할 수 있습니다. 조직 배양 배지 30 ㎖ (10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 암포 테리 가진 둘 베코 변형 이글 배지)를 사용한다. 3 일마다 세포 배양 배지를 바꾸고 7.5 % CO 2 및 92.5 %의 실내 공기와 37 ℃에서 세포를 유지한다. </li><li> 인큐베이터에서 궤도 통을 놓습니다. 참고 : 궤도 셰이커는 일반적으로 무거운 (&gt; 10kg). 선반 응력과 진동을 최소화하기 위해 인큐베이터의 바닥 선반에 궤도 통을 놓습니다. </li><li> 궤도 통에 실험 전단 반지를 놓습니다. 같은 인큐베이터 안에 정적 대조군 전단 반지를 놓습니다. </li><li> 쉬 내에서 최대 전단 응력을 추정방정식과 귀 반지 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq1.jpg" /> 어디에 <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq2.jpg" /> 진탕 기의 회전 반경 (cm 단위)이며 <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq3.jpg" /> 매체의 점도 (포이즈 단위)이며 <img alt="식 (4)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq4.jpg" /> (g / ㎖)에서, 매체의 밀도, <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq5.jpg" /> (24) (회전 / 초)에서의 회전 주파수이다. </li><li> 전단 응력 응용 프로그램 (예를 들어, 72 시간)의 원하는 기간 동안 통에 전단 링을 떠나, 원하는 회전 수 (예를 들어, 90 RPM)에 궤도 통에 회전 설정을 시작합니다. 참고 : 인큐베이터 온도가 37 ° C는 실험 기간 내내 유지하기 위해 초기에 모니터링해야하므로 궤도 셰이커가, 열을 생성 할 수 있습니다. 또한,이야듣고 반지는 회전 인큐베이터 내에 배치 후 환경 챔버 (예를 들어, 모듈 형 인큐베이터 실) 및로 전송할 수 있습니다. </li><li> 셀 층을 원하는 시간에 대한 전단 인큐베이터에서 전단 링을 제거에 노출 된 후. 전단 링 뚜껑을 당겨 원하는 엔드 포인트 분석 (예를 들어, 웨스턴 블로 팅, 형광 활성 세포 정렬 등) (25) 검사에 대한 세포 및 / 또는 미디어를 검색 할 수 있습니다. </li></ol>

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J. 위니 윤은 아네트 Funicello 재단에서 연구비가 있습니다. J. 스티븐 알렉산더는 신경과, LSUHSC-S의 부서에서 연구 지원을하고 있습니다.

전단 내피 세포를 노출 전단 고리 시스템의 구성은 전단 응력의 연구를 수행하는 간단한 방법이다. 그럼에도 불구하고, 우수한 전단 반지와 더 나은 결과를 얻기위한 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 완전 밀봉 된 샘플간에 일치 전단 응력을 생성 할 수있는 미디어 누출을 방지하기 위해 내부 및 외륜 사이에 만들어 져야한다. 완벽한 밀봉이 수행되지 않은 경우, 메틸렌 클로라이드의 최소량은 ?...

시스 - 조절 요소 (6)의 기동, 히스톤 아세틸 트랜스퍼 라제 활성 (7) 및 전단 응력에 응답 요소 (SSRE) 5-8 - 유체 전단 응력은 내피 유전자 프로그램 1을 조절하는 것으로 나타났다. 조직 인자 (9) 및 조직 플라스 미노 겐 활성제 (TPA) (10) 식을 변조함으로써 응력의 영향을 응고 향해 내피 기여 전단. 전단 응력은 PDGF-B의 합성 및 응답 (8)을 조절함으로써 혈관 신생 (11)와 선박 개조의 제어에 영향을 미친다. 내피는 엔도 텔린-1, 유로 텐신 II 및 relaxin도 전단 (12)에 의해 혈관 활성 매개체의 adrenomedullin 규제 유도. 내피 산화 질소 합성 효소의 생산 및 산화 질소 생산의 전사는 모두 전단 의존 10이다. 전단은 내피 세포의 ICAM-1의 발현 (13)를 제어한다. 따라서 powerfu 수 있습니다 흐름에 의한 전단 응력에서야 베드로 내피 응답의 큰 다양성에 영향을 미친다. 중요한 혈관 맥동 이제도 14 혈관성 치매 모두 정상 혈관 노화 형태의 병태 생리에서 중요한 역할을하는 나타나고 심지어 다발성 경화증 (15)와 같은 다른 신경 퇴행성 질환에 기여할 수있다. 동맥 및 정맥 내피 세포를 본질적으로 생체 내에서 다양한 혈류 흐름 패턴에 노출되며, 많은 다른 내피 세포 표현형 16을 발휘할 수있다. 크기 및 흐름의 주기성에 따라 내피 세포에 미치는 영향은 유전자 또는 단백질 발현 (17, 18)의 변화를 반영 할 수있다 염증성 세포의 활성화 및 아폽토시스를 포함 할 수있다. 내피 세포 반응에 대한 연구는 충분히 이러한 전단 패턴을 생성 체외 모델에서 생산 때문에 어려움에 의해 복잡하게 남아 현상을 전단합니다. 많은 다른 experimental 프로토콜 세포 단층 내피 유체 전단 응력을 적용하기 위해 개발되었다. (21) - 가장 일반적으로 사용되는 시스템들 중 하나는 상기 챔버 (19) 내에서 균일 한 층류를 생성하는 평행 평판 유동 챔버이다. 연동 펌프는 대개 일반적으로 생체 내의 많은 위치 22에서 발견되는 유동 특성 요점을 되풀이 할 수 주기적 유동을 생성하도록 접속된다. 또 다른 일반적인 셋업 유체의 전단 스트레스 콘 (23)의 회전 속도에 의해 결정되는 &#39;콘 플레이트&#39;모델을 사용한다. 그들과 비슷한 두 시스템 및 기타 배열은, 설정 많은 실험실에 상대적으로 비싸고 액세스 할 수 있습니다 구성 요소를 요구하는 지루한 될 수 있습니다. 이러한 전류 모델의 다른 중요한 제한은 동시에 상대적으로 낮은 표면적, 각각 행할 수 복제 연구의 상대적으로 낮은 수있다. 이것은 시간 및 공동 증가<html> 이러한 접근 방식의 mplexity. 따라서, 단방향 및주기적인 전단을 유도하는 이상적인 모델은 상대적으로 큰 표면적 연구 복제의 높은 숫자를 쉽게 설정할 수 있습니다 하나, 각각 수 있습니다. 또한, 상기 모델은 많은 사용자를 위해 엄청난 비용이 될 수있는 상당히 복잡한 설치가 필요합니다. 기본적인 실험 재료를 사용하여 유체 전단 교란을 제조 할 수있는 모델은 여러 가지 이점을 가질 수 있습니다. 단방향 주기적 전단 응력을인가하는 간단하고 매우 경제적 인 방법은 진탕 기 (24)에 원형 접시의 배치를 포함한다. 이 프로토콜은 매우 간단하며, 필요에 따라 복제 연구의 높은 수치는 비교적 큰 표면적을 각각 달성하기 위해 확장 될 수있다. 그러나, 접시의 중심에 위치한 셀은 동일한 혼합 접시에 세포 표현형 반응을 수득 주연을 따라 셀과 다른 흐름 패턴에 노출된다. _content &quot;&gt;이 현재 보고서에서 우리는 &#39;전단 링&#39;, 단방향 및주기적인 전단 응력을 만들기위한 우리의 모델의 구성 및 사용에 대해 설명합니다. 디자인을 전단 반지를 효과적으로 제한 &#39;혼합&#39;휴대 전단에 의한 표현형을 흐름을 제한하여 내륜의 배치를 통해 주위에 순환 배양 접시 내의 통로. 전단 링의 구성 및 동작이 간단하고 경제적이며 쉽게 널리 사용할 조직 배양 공급하여 오비탈 쉐이커 광범위한 수용하도록 확장 할 수있다. 이러한 모델 병태 생리적 수준에서 단방향주기적인 유동 패턴을 제공하기 위해 내피 세포 실험에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>100 x 20 mm plastic tissue culture dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>The dishes must be polystyrene</td></tr><tr><td>150 x 25 mm plastic tissue culture dish</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>The dishes must be polystyrene</td></tr><tr><td>150 mm glass Petri dish</td><td>Fisher</td><td>3160150BO</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polystyrene tissue culture plastic tubes</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Methylene chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D65100</td><td></td></tr><tr><td>silicone rubber sealant</td><td>DAP</td><td>7079808641</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>3 ml transfer pipette</td><td>Becton-Dickinson</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>printer paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotary tool and set</td><td>Dremel</td><td>4000-6/50</td><td></td></tr><tr><td>rotary tool cutting head</td><td>Dremel</td><td>EZ476</td><td></td></tr><tr><td>rotary tool drill head</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>distilled water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>orbital shaker</td><td>VWR</td><td>57018-754</td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat retinal microvascular endothelial cells</td><td>Cell Biologics</td><td>RA-6065</td><td></td></tr></tbody></table>

the assembly and application of 'shear rings': a novel endothelial model for orbital, unidirectional and periodic fluid flow and shear stress

적응뿐만 아니라 내피 표현형과 유전자 발현의 병리학 적 변화를 유도하여 정상 수준 및 혈관 생리학 및 병태 생리에 혈관 유체 전단 중요한 역할을 패턴에서 편차. 특히주기적인 단방향 흐름 유도 된 전단 응력의 영향은 여러 부적응 혈관 세포 형태, 특히 혈관 내피 세포에 대한 다양한 효과를 트리거 할 수있다. 지금까지 다양한 해부학 적 기원에서 내피 세포 배양되었지만, 깊이있는 유체 전단에 자신의 응답이 전단 모델의 상대적 복잡성에 의해 방해 한 분석 (예를 들어, 평행 판 유량 용기, 콘 플레이트 흐름 모델). 이러한 모든 훌륭한 접근 방식을 나타내는 반면, 이러한 모델은 봇에 도전을 작성, 기술적으로 복잡하고 상대적으로 길고 복잡한 설정 시간, 낮은 표면 영역, 자주 밀봉 가스켓을 필요로하는 펌프 및 가압에 대한 요구 사항을 포함하여 결점불임 여러 실험을 실행하기 위해 무능력의 시간 유지. 흐름과 전단의 높은 처리량 모델은 혈관 내피 전단 반응에 큰 진전 사용할 수 있었던 경우에는, 분자 수준에서 특히주기적인 전단 연구는보다 신속하게 고급 수 있습니다. 쉽게에 단방향,주기적인 전단 응력 연구에서 실험 복제의 높은 숫자를 허용하는 비교적 큰 표면적 소설, 간단한 - 투 조립, 저렴한 조직 문화 모델 : 여기, 우리는 건설 및 사용 전단 링을 설명 내피 세포.

여기에서 우리는 전단 링에서 배양 hCMEC / D3 뇌 내피 세포와 쥐의 망막 미세 혈관 내피 세포 단일 층 모두에서 대표적인 결과를 제시한다. hCMEC / D3 뇌 내피 세포 단층이 완전한 EBM에 합류하도록 성장시킨 후, 전단 링 72 시간 동안 진탕 기 상에 두었다. 단계 3.5에서의 방정식을 사용하여, 최대 전단 응력을 계산 <img alt="식 (6)" src=...

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The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

총회와 &#39;전단 반지&#39;의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

the-assembly-application-shear-rings-novel-endothelial-model-for

Research

JoVE Journal

Biology

8.0K 조회수.  Louisiana State University Health Sciences Center in Shreveport. Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

연구

생체공학

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important applications in the quest for the development of novel therapeutics. Assays using static conditions fail to capture the dependence of adhesion on shear, limiting their correlation with in vivo environment. Parallel plate flow chambers that quantify adhesion under physiological fluid flow need multiple experiments for the generation of a shear adhesion map. In addition, they do not represent the in vivo scale and morphology and require large volumes (~ml) of reagents for experiments. In this study, we demonstrate the generation of shear adhesion map from a single experiment using a microvascular network based microfluidic device, SynVivo-SMN. This device recreates the complex in vivo vasculature including geometric scale, morphological elements, flow features and cellular interactions in an in vitro format, thereby providing a biologically realistic environment for basic and applied research in cellular behavior, drug delivery, and drug discovery. The assay was demonstrated by studying the interaction of the 2 &#181;m biotin-coated particles with avidin-coated surfaces of the microchip. The entire range of shear observed in the microvasculature is obtained in a single assay enabling adhesion vs. shear map for the particles under physiological conditions.

Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.

SynVivo 합성 미세 혈관의 네트워크를 사용하여 전단 접착지도의 생성

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and homeostasis of the vasculature system Therefore, deregulation in this signaling pathway results in severe vascular pathologies, such as pulmonary artery hypertension, hereditary hemorrhagic telangiectasia, and atherosclerosis. Endothelial cells (ECs), as the innermost layer of blood vessels, are constantly exposed to fluid shear stress (SS). Abnormal patterns of fluid SS have been shown to enhance TGF&#946;/BMP signaling, which, together with other stimuli, induce atherogenesis. In relation to this, atheroprone, low laminar SS was found to enhance TGF&#946;/BMP signaling while atheroprotective, high laminar SS, diminishes this signaling. To efficiently analyze the activation of these pathways, we designed a workflow to investigate the formation of transcription factor complexes under low laminar SS and high laminar SS conditions using a commercially available pneumatic pump system and proximity ligation assay (PLA).
Active TGF&#946;/BMP-signaling requires the formation of trimeric SMAD complexes consisting of two regulatory SMADs (R-SMAD); SMAD2/3 and SMAD1/5/8 for TGF&#946; and BMP signaling, respectively) with a common mediator SMAD (co-SMAD; SMAD4). Using PLA targeting different subunits of the trimeric SMAD-complex, i.e., either R-SMAD/co-SMAD or R-SMAD/R-SMAD, the formation of active SMAD transcription factor complexes can be measured quantitatively and spatially using fluorescence microscopy.
The usage of flow slides with 6 small parallel channels, that can be connected in series, allows for the investigation of the transcription factor complex formation and inclusion of necessary controls. 
The workflow explained here can be easily adapted for studies targeting the proximity of SMADs to other transcription factors or to transcription factor complexes other than SMADs, in different fluid SS conditions. The workflow presented here shows a quick and effective way to study the fluid SS induced TGF&#946;/BMP signaling in ECs, both quantitatively and spatially.

Here, we establish a protocol to simultaneously visualize and analyze multiple SMAD complexes using proximity ligation assay (PLA) in endothelial cells exposed to pathological and physiological fluid shear stress conditions.

근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 TGFβ/BMP/SMAD 신호의 시각화 및 정량화

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

생화학

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

가 여러 명의 병렬 접시 흐름 챔버를 사용 하 여 스트레스에 노출 된 내 피 세포의 유전자 표정 분석

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and multidirectional shear stresses have all been postulated to stimulate a pro-atherosclerotic phenotype in endothelial cells, whereas high magnitude and unidirectional or uniaxial shear are thought to promote endothelial homeostasis. These hypotheses require further investigation, but traditional in vitro techniques have limitations, and are particularly poor at imposing multidirectional shear stresses on cells. 
One method that is gaining increasing use is to culture endothelial cells in standard multi-well plates on the platform of an orbital shaker; in this simple, low-cost, high-throughput and chronic method, the swirling medium produces different patterns and magnitudes of shear, including multidirectional shear, in different parts of the well. However, it has a significant limitation: cells in one region, exposed to one type of flow, may release mediators into the medium that affect cells in other parts of the well, exposed to different flows, hence distorting the apparent relation between flow and phenotype. 
Here we present an easy and affordable modification of the method that allows cells to be exposed only to specific shear stress characteristics. Cell seeding is restricted to a defined region of the well by coating the region of interest with fibronectin, followed by passivation using passivating solution. Subsequently, the plates can be swirled on the shaker, resulting in exposure of cells to well-defined shear profiles such as low magnitude multidirectional shear or high magnitude uniaxial shear, depending on their location. As before, the use of standard cell-culture plasticware allows straightforward further analysis of the cells. The modification has already allowed the demonstration of soluble mediators, released from endothelium under defined shear stress characteristics, that affect cells located elsewhere in the well.

This protocol describes a coating method to restrict endothelial cell growth to a specific region of a 6-well plate for shear stress application using the orbital shaker model.

메카노생물학적 연구를 위한 궤도 셰이커에 6웰 플레이트에서 내피 세포의 분할 성장

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the initial stage varies dramatically from the following process of neovascularization. Although there are plenty of models to simulate different stages of neovascularization, an in vitro 3D model that capitulates the initial process of neovascularization under the corresponding stimulations of normal vasculature microenvironments is still lacking. Here, we reconstructed an in vitro 3D model that mimics the initial event of neovascularization (MIEN). The MIEN model contains a microfluidic sprouting chip and an automatic control, highly efficient circulation system. A functional, perfusable microchannel coated with endothelium was formed and the process of sprouting was simulated in the microfluidic sprouting chip. The initially physiological microenvironment of neovascularization was recapitulated with the microfluidic control system, by which ECs would be exposed to high luminal shear stress, physiological transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distributions simultaneously. The MIEN model can be readily applied to the study of neovascularization mechanism and holds a potential promise as a low-cost platform for drug screening and toxicology applications.

Here, we provide a microfluidic chip and an automatically controlled, highly efficient circulation microfluidic system that recapitulates the initial microenvironment of neovascularization, allowing endothelial cells (ECs) to be stimulated by high luminal shear stress, physiological level of transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distribution simultaneously.

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood flow triggers a signaling cascade resulting in vasodilation thereby alleviating mechanical stress on the vascular wall. The pattern of shear stress is also well known to be a critical factor in the development of atherosclerosis with laminar shear stress being atheroprotective and disturbed shear stress being pro-atherogenic. While we have a detailed understanding of the various intermediate cell signaling pathways, the receptors that first translate the mechanical stimulus into chemical mediators are not completely understood. Mechanosensitive ion channels are critical to the response to shear and regulate shear-induced cell signaling thereby controlling the production of vasoactive mediators. These channels are among the earliest activated signaling components to shear and have been linked to shear-induced vasodilation through promoting nitric oxide production (e.g., inwardly rectifying K+ [Kir] and transient receptor potential [TRP] channels) and endothelium hyperpolarizing factor (e.g., Kir and calcium-activated K+ [KCa] channels) and shear-induced vasoconstriction through an undetermined mechanism that involves piezo channels. Understanding the biophysical mechanism by which these channels are activated by shear forces (i.e., directly or through a primary mechano-receptor) could provide potential new targets to resolve the pathophysiology associated with endothelial dysfunction and atherogenesis. It is still a major challenge to record flow-induced activation of ion channels in real time using electrophysiology. The standard methods to expose cells to well-defined shear stress, such as the cone and plate rheometer and closed parallel plate flow chamber do not allow real time study of ion channel activation. The goal of this protocol is to describe a modified parallel plate flow chamber that allows real time electrophysiological recording of mechanosensitive ion channels under well-defined shear stress.

The goal of this protocol is to describe a modified parallel plate flow chamber for use in investigating real time activation of mechanosensitive ion channels by shear stress.

잘 정의된 전단 응력 하에서 단세포 이온 전류의 전기 생리학적 기록

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

총회와 '전단 반지'의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

요약

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