우리는 현미경에 도움이 토론 게리 Laevsky 감사합니다. NIH에 의해 투자 된이 작품은 ERG에 R01GM061107 및 R01GM067758을 부여

주 : 근육을 제거 (도 1)에 대한 절차는 유충 필렛을 제조하는 전술 한 방법의 변형이다. 선행 근육 제거를 수행하는 단계는 간단하게 설명하고 리더 상세한 설명은 이전 연구 10, 11로 지칭된다. 차가운 식염수 1. 해부 애벌레 <ol><li> 차가운 HL3.1 식염수 15 차가운 칼슘 2 + - 무료 HL3.1 식염수 (11) (표 1)의 작동 희석을 준비합니다. 접시의 바닥을 충당하기 위해 충분한 차가운 생리 식염수와 실리콘 엘라스토머 접시에 애벌레를 놓습니다. 참고 : 식염수의 선택에 관한 토론을 참조하십시오. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 배 HL3.1 식염수 (PH 7.2) </td></tr><tr><td> 5 mM의 HEPES </td></tr><tr><td> 70 mM의 염화나트륨 </td></tr><tr&gt; <td> 5 밀리미터의 KCl </td></tr><tr><td> 1.5 mM의 염화칼슘 2 (칼슘 - 무료 식염수를 위해 생략) </td></tr><tr><td> 4 밀리미터의 MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 밀리미터의 NaHCO3 </td></tr><tr><td> 5mM의 트레 </td></tr><tr><td> 115 MM의 자당 </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 4 ° C에서 필터 소독 및 저장 </td></tr><tr><td> 참고 : 체액 곤충 구성을 모방 </td></tr></tbody></table> 차가운 식염수 표 1. 구성. <ol start="2"><li> 복부면을 위로 유충을 배치합니다. 유충의 복부 표면은 전방에서 후방으로 실행하는 기본 애벌레 기관 튜브에 의해 복부 dentical 벨트와 지느러미 측에서 식별 할 수 있습니다. 전방 - 후방 방향으로 유충을 스트레칭과에 머리와 꼬리를 핀곤충 핀을 사용 접시 해부 실리콘 엘라스토머. 한쪽 끝에서 시작하여 다른 방향으로 진행, 복부 정중선을 따라 잘라 미세 해부 가위를 사용합니다. 참고 :이 방향은 다 신경 세포의 일반적 연구 등의 클러스터를 유지합니다. </li><li> 유충이 절개 된 후, 책을 여는 것처럼 해부 접시 네 모서리를 고정. 중추 신경계, 창자 및 기관을 포함한 내부 장기를 잡아 제거하는 집게를 사용합니다. 필렛이 팽팽하지만 최대한 뻗어있다 그래서 곤충 핀을 조정합니다. 참고 : 근육은 분절 경계에서 몸 벽에 고정된다. 근육이 몸 벽의 대부분을 커버하지만, 그들은 지느러미 중간 선 부근의 좁은 영역에 존재하지 않는다. </li></ol> 2. 근육 제거 <ol><li> 근육 조직이 존재하지 유충의 지느러미 중간 선을 찾습니다. 이 평평한 가능한 방향으로 근육 조직 아래에 삽입 될 수있는 하나의 셉 단자를 배치합니다. </li><li> 에서 시작지느러미 중간 선은 세그먼트의 전방 경계 근처에 조심스럽게 집게와 표피 사이의 접촉을 최소화하기 위해주의하면서 근육과 표피 사이의 겸자 단자를 밀어 넣습니다. </li><li> 하나의 고정 점에서 몸 벽 근육의 부착을 깰 위로 집게를 잡아 당깁니다. 관심의 나머지 헤미 세그먼트 (들)에 대해이 과정을 반복합니다. 참고 :이 프로토콜은 각각 다 신경 세포의 수상 돌기 필드의 후방의 보존을 최적화합니다. 수지상 필드의 앞쪽 부분을 유지하려면, 각 세그먼트의 후방 끝 부분에 집게의 단자를 삽입하는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 애벌레 필렛이 최대로 모든 방향으로 뻗어되도록 곤충 핀을 다시 조정합니다. </li><li> 그것은 아직도 25 분 동안 PBS에서 감기, 새로 제조 한 4 % 포름 알데히드를 사용하여 해부 접시에 고정되어있는 동안 필렛을 수정합니다. </li><li> PBS에 5 번 씻어. </li><li> 접점을 최소화하기 위해주의하면서 조심스럽게 나머지 고정 점에서 근육 조직을 멀리 당겨 집게를 사용하여표피와 CT. </li><li> 고정 해제 및 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 해부 접시에서 필렛을 제거합니다. 이전 11 설명 된 바와 같이, 모든 후속 세척, 차단 및 면역 형광 염색 단계를 수행합니다. </li></ol> 3. 마운트 애벌레 필렛 <ol><li> 우선 가능한 샘플이 평평하게하기 위해 미세 해부 가위를 사용하여 머리와 꼬리를 제거합니다. 커버 슬립에 직면 필렛의 내면 antifade mountant에 커버 슬립에 필렛을 탑재합니다. </li><li> 커버 슬립에 현미경 슬라이드를 삽입하고 설치 매체를 분산 부드럽게 누르십시오. 위에 현미경 슬라이드 플립과 매니큐어를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 밀봉. 프레젠테이션은 적어도 한 달 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol>

<ol>
	<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+Drosophila+sensory+neurons.">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+Drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space.">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li><li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+Drosophila+sensory+neurons.">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li><li>Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+regulates+a+developmental+transition+in+epithelial+cells+that+restricts+sensory+dendrite+growth.">The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth.</a> Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).</li><li>Meltzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermis-derived+Semaphorin+promotes+dendrite+self-avoidance+by+regulating+dendrite-substrate+adhesion+in+Drosophila+sensory+neurons.">Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila.">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics.">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. (57), e3111 (2011).</li><li>Gustafsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+flow+quantified+beyond+the+diffraction+limit+by+spatiotemporal+image+correlation+of+structured+illumination+microscopy+data.">Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data.</a> Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).</li><li>Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+response+mediated+by+the+TRP+channels+NOMPC,+NANCHUNG,+and+INACTIVE+in+chordotonal+organs+of+Drosophila+larvae.">Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae.</a> PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기 프로토콜 초파리 유충 필렛의 근조직의 수동 제거를 위해 설명된다. 이 프로토콜은 이전에 애벌레 해부 기술 10, 11 설명 수정합니다. 유충은 실리콘 엘라스토머 접시에 해부 한 후, 지느러미 중간 선이 있습니다. 단일 셉 가닥은, 그 평탄한 가능한 방향으로 조심스럽게 지느러미 중간 선 근처의 근육 조직과 표피 사이에 삽입됩니다. 포셉 부드럽게 관심의 각 애벌레 세그먼트에...

초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포는 그들의 유전자 조작에 복종 할 의무 그들이 이미지화 할 수있는 용이성에 신경 발달을 연구하기위한 귀중한 모델을 제공합니다. 이 감각 뉴런은 수상 돌기의 형태 형성 1-3을 제어하는 다양한 경로의 식별 수단이되고있다. 다 뉴런의 네 가지 클래스 (클래스 I - IV) 애벌레 표피 신경을 분포시키다. 이러한 신경 세포는 수상 돌기는 주로 2 차원 배열을 형성 4,5-으로 기저막와 표피 사이에 놓여. 네 개의 클래스, 클래스 IV 다 신경 세포는 다른 동물의 감각 뉴런과 같은 가장 높은 분기 아버과를 가지고,이 아버의 동화는 개발 6-9에 대한 주변 조직에서 고유 요소뿐만 아니라 큐, 특히 표피가 필요합니다 . 연구 방법 등의 연결 및 추가-신경 사실을 확인하는 방법ORS 면역 형광에 의해 반응계 내에서 단백질 발현을 검출하는 능력에서 수지상 형태 형성 이득을 제어한다. 유충의 외부 표피는 항체에 꿰 뚫을 수없는, 그러나이 장애는 쉽게 잘 확립 된 해부 방법 10, 11을 통해 애벌레 필렛의 준비에 의해 극복된다. 그러나, 기저막 단지 내부 놓여 체벽 근육 조직 DA 신경 세포 및 상피 세포의 가시화를 향해 여러 과제를 제공한다. 우선, 근육 조직, 체벽 대부분 라인은 크게 신경 또는 표피 조직에서 나오는 형광 신호를 가린다. 이것은 실질적으로 샘플 신호 대 잡음비를 감소시킨다. 둘째, 많은 관련 단백질은 근육 조직에서뿐만 아니라 신경 세포 또는 표피에서 발현 될 수있다. 이 근육 유래 형광 신호는 신경 세포 또는 표피에서 형광 신호의 상기 모호한 검출 쉽다. 마지막으로, 아니 현미경 기술의 발전서브 회절 해상도에서 샘플 w 허가 이미징 및 상피 세포 (12, 13)를 신경 세포에서 발현되는 단백질의 현지화 안목과 주변에 특히 도움이 될 수 있습니다. 그러나 잡음비 및 커버 슬립을 시료의 근접에 강한 신호로부터 초해 현미경 이점 통해 촬상. 신호 대 잡음 비를 감소 이외에 유생 체벽 근육 거리시켜 초 해상 현미경 방법으로 달성 될 수있는 개선 된 이미지 해상도를 한정 커버 슬립에서 DA 뉴런. 면역 형광 분석을위한 과제 외에도, 근육 조직은 애벌레 몸 벽에 감각 뉴런에서 전기 생리 기록에 대한 장벽을 제공합니다. 그것의 제거는 따라서 감각 뉴런 (14)의 신경 생리 학적 조작 도움이됩니다. 여기 초파리 유충 근조직의 수동 제거하는 방법이 기재되어있다. 우리는 우리의 프로토콜 페이지 입증그렇지 근조직 의해 가려 단백질 ermits 면역 촬상 클래스 IV 다 뉴런의 시각화를위한 신호 대 노이즈 비율을 개선하고, 더 나은 DA 신경 단백질 및 세포 구조의 공간적 관계를 식별하기 위해 초해 현미경의 사용을 가능하게하며 표피.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-D</td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>for dissecting plates</td></tr><tr><td>Austerlitz insect pins, 0.1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Fostec 8375 light source</td><td>Artisan Technology Group</td><td>62792-4</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade mounting medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Prolong Diamond antifade mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36970</td><td>for structured illumination microscopy</td></tr><tr><td>Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Coracle antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>C615.16</td><td>supernatant, dilute 1:50</td></tr><tr><td>Mouse anti-Discs large antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>supernatant, dilute 1:50</td></tr><tr><td>Rabbit anti-dsRed antibody</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>dilute 1:1,000</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>dilute 1:1,000</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>dilute 1:500</td></tr></tbody></table>

removal of drosophila muscle tissue from larval fillets for immunofluorescence analysis of sensory neurons and epidermal cells

초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포는 신경 세포의 형태 형성의 메커니즘을 조사하는 인기 모델입니다. 다 신경 따라서 표피가 신경을 분포시키다 세포와 면역에 의해 모두 neuronally 및 epidermally 발현 된 단백질의 현장 시각화에서 자신의 분석 혜택과 통신 개발한다. 면역 실험 애벌레 필렛을 준비하는 전통적인 방법은 신경 세포와 표피 단백질 이미징 몇 가지 과제를 제시, 신체 벽의 대부분을 덮고있는 근육 조직을 그대로 둡니다. 여기에서 우리는 초파리 애벌레 필레에서 근육 조직을 제거하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은, 달리 근육 조직에 의해 가려 단백질의 촬상을 가능하게 신호 대 잡음 비를 향상시키고, DA 신경 발달을 연구 초해 현미경의 사용을 용이하게한다.

우리는 함께 막 마커로 표지 클래스 IV 다 신경과 중격 접합 단백질 Coracle (코라) 및 디스크 대형 (통해 Dlg)를 공동 시각화 면역 실험에서 신호 대 잡음 비를 향상시키기 위해 근육 제거의 유용성을 입증 CD4- tdTomato. 코라 이전 DA 신경 돌기는 상피 세포에 의해 둘러싼 다 신경 세포의 형태 형성 및 기능과 관련하여 연구를 4,6-9,16 돌기 한 많은 식?...

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Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포를 사용하여 신경 세포의 형태 형성의 연구는 면역에 의해 신경 세포와 표피 단백질의 현장 시각화 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 애벌레 몸 벽에서 근육 조직을 제거하여 다 신경 세포와 주변 표피 세포의 면역 형광 분석을 개선하는 절차를 설명합니다.

제거<em&gt; 초파리</em감각 뉴런과 표피 세포의 면역 형광 분석을위한 애벌레 필렛에서&gt; 근육 조직

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

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Research

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Neuroscience

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

8.9K 조회수.  Princeton University.  초파리 애벌레 수지상 arborization (다) 신경 세포를 사용하여 신경 세포의 형태 형성의 연구는 면역에 의해 신경 세포와 표피 단백질의 현장 시각화 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 애벌레 몸 벽에서 근육 조직을 제거하여 다 신경 세포와 주변 표피 세포의 면역 형광 분석을 개선하는 절차를 설명합니다. 

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Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

연구

신경과학

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

의 형태학의 분석 Drosophila</em유전 모자이크 사용하기> 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

유전학

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila 애벌레 NMJ의 해부

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

생물학

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Observation Microtubule networks in Drosophila Neuromuscular junctions and muscle cells(초파리 신경근 접합부 및 근육 세포의 미세소관 네트워크 관찰)

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

저자 스포트라이트: Understanding Microtubule Network in Drosophila Neuromuscular Junctions 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

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