이 작품은 과학 기술부에서 부여에 의해 지원되었다 (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). 우리는 박사 감사합니다. 원고를 읽기위한 베티 우 셰 행정 원장과 하와이 대학에서 스탠포드 대학 박사 피터 호프만에서 NTU에 치엔 쿠오 리, 리 저보니, 농업 생명 공학의 기술 지원 NTU에서 윤 치엔 박사 웬 - 치 웨이 기술 자문에 대한 중앙 연구원에서 연구 센터.

8에서 여성 마우스 - 연령 12 주 본 연구에 사용되었다. C57 / BL6 야생 - 타입 (WT)와 결핍 IL-15 (IL15 - / -) 마우스는 각각 국립 실험 동물 센터 (NLAC), 대만, 타 코닉 농장에서 구입 하였다. IL15 +/- 이형의 단면으로부터 제 3 세대의 비율 결핍 IL-15 (IL15 - - /) 및 IL-15을 보이면서 (+/- IL15 및 IL15은 + / +) 1을 나타내었다. IL15의 유전자형 - / - 생쥐는 PCR 분석에 의해 확인 하였다. 마우스는 실험 동물 센터 (LAC), 국립 대만 대학교 의학 (NTU) 대학에서 특정 병원체 무료 (SPF) 시설에서 유지되었다. 마취 대상 및 방법을 포함한 모든 동물의 절차는 공중 보건 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (동물 프로토콜 20130225 승인의 진술서)의 국립 대만 대학 의과 대학 및 대학의 승인 동물 프로토콜에 따라 수행되었다. &lt;P 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 1. 침의 제조 참고 : 침술 바늘은 핸들과 바늘 끝 (그림 1A)로 구성된 의료 장치입니다. 침술 바늘의 직경은 0.35 mm (28 G)는 0.2 mm (36 G)에서이었다. 우리는 피부를 따끔 따끔하는 동안 잠재적 인 과도한 세포 손상을 방지하기 위해 바늘의 최고 지점을 선택합니다. 13mm (0.5)에 25 mm (1.0)에 40 mm (1.5) 및 길이 50 ​​mm (2.0)를 포함하는 0.2-mm 바늘 길이의 4 가지가있다. 13mm 길이 10 개 바늘의 번들 C57BL / 6 마우스의 피부에 바늘을 진동하는 동안 가장 편안한 그립을 제공했다. 이 방법은 큰 동물의 피부에 이상 손으로 연구자에 의해 수행되는 경우 매개 변수를 수정할 수 있습니다. <ol><li> 멸균, 비발 열성 패키지에서 침을 제거합니다. 멸균 드레이프에 바늘을 놓습니다. </li><li> 난 10 바늘을 함께 결합하는 접착 라벨 테이프를 사용NA 번들 (도 1b). 참고 : 10 개 바늘 기하학적 원통 모양을 형성하도록 배치된다. 편의를 위해, 접착 테이프를 적용하기 전에 구성을 안정화 파라핀 필름의 조각을 사용한다. 모든 바늘 포인트가 동일 평면 상에 있는지 확인합니다. 대신 하나의 바늘의 번들을 사용하면 바늘과 피부의 접촉 면적을 증가시켜 최대 DNA 주입을 용이하게합니다. </li></ol> 2. 많은 양의 준비 및 독소가없는 플라스미드 DNA <ol><li> 플라스미드 DNA 화학적 유능한 박테리아 세포를 형질. </li><li> 선택한 LB 배지 함유 항생제 3ml를 단일 박테리아 콜로니를 접종하고, 밤새 진탕하에 37 ℃에서 배양한다. </li><li> C. 항생제를 LB 배지 100 250 mL로 37 ℃에서 밤새 진탕 : 1의 세균 배양을 희석하여 배양을 확장 </li><li> 고해서 양질를 사용하여 DNA를 대량으로 준비Y, 제조업체의 지침에 따라 내 독소 무료 플라스미드 준비 키트. 참고 : Acufection 프로토콜은 높은 순도와 플라스미드 DNA를 대량으로 필요합니다. 고품질의 사용은, 내 독소 무료 및 열 정제 플라스미드 DNA를 권장합니다. </li><li> 멸균 수에 DNA를 용출시켰다. acufection에 대한 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 작은 씩에 ​​보관 DNA. 참고 : 일관성있는 플라스미드 DNA의 발현을 확인하기 위해 DNA의 반복 동결과 해동을 피하십시오. </li><li> acufection 무균 PBS에 1 ㎎ / ㎖로 플라스미드 DNA를 희석. </li></ol> Acufection 3. 절차 주 : DNA의 최적 량 및 대상 피부면의 면적이 다른 유전자 변화 및 더 최적화 될 필요가있다. 찌름 힘 횟수 피부 두께에 따라서 달라질 수있다 또한 피부의 각질층 느슨하게. 이러한 조건은주의 깊게 acufected 진 트랜스크리의 발현 수준을 평가 한 후 결정해야한다QRT-PCR에 의한 점. <ol><li> 마우스 체중을 복막 주사 tribromoethanol (GM 체중 당 400 μg의)을 관리. 참고 : 2,2,2- tribromoethanol 일반적으로 마우스에 사용 된 주사 마취 에이전트입니다. 용액은 2- 메틸 -2- 부탄올 중 2.5 %를 함유하는 증류 물 (200 mL) 중이 아닌 약제 학적 등급 2,2,2- tribromoethanol (2.5 g)를 용해시킴으로써 제조된다. </li><li> 마취하에 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 안과 연고를 사용합니다. 참고 : - 2 분 마취 효과는 1에서 유도됩니다. 수술 전에 마취의 충분한 깊이를 보장하기 위해 발가락 핀치 반사를 확인합니다. </li><li> 지느러미 측면 피부를 면도하고 모발에 케라틴 단백질을 용해 제모 크림을 적용합니다. 참고 : 머리를 제거하는 제모 크림의 사용은 피부에 DNA의 주입을 용이하게합니다. </li><li> 제모 크림을 닦아 물을 적신 면봉을 사용합니다. 주 : 제모 크림은 물에 용해입니다. 크림 줘야의 완전 제거L은 기름기 표면을 방지하고 더 나은 찌름 결과를 확인합니다. </li><li> 피부 표면을 소독하기 위해 70 % 에탄올에 적신 멸균 면봉을 사용합니다. </li><li> 마크 미리 측정 스텐실 면도 한 피부의 목표 영역 (1cm X 1cm). 참고 : 대상 사이트를 표시하는 것은 위아래 정의 된 영역 내에서 바늘 번들을 적용하는 데 도움이 될 것입니다. 이 실험 실험 간 변동을 최소화하는 표면적 DNA에 동일한 양의 전달을 보장하는 것이 중요하다. </li><li> 피부에 표시된 플라스미드 DNA (μg의 10)의 10 μL 강하를 놓는다. 참고 acufection위한 DNA의 양은 다른 유전자 발현 벡터의 종류에 따라 달라진다. 사용되는 DNA의 양을주의 깊게 관심의 실험을 수행하기 전에 적정해야한다. 10 μL 작은 액적이며 ​​샤프트 동안 굴러없는 면도를 면도하고 피부에 잘 앉는다. 마우스 A를 비교하는 10 μL 빈 벡터 DNA로 처리 된 마우스의 대조군을 포함연구 유전자 cufected. </li><li> 침술 바늘 번들 (그림 1B)를 누른 상태에서 100 배 또는 피부가 사라집니다 PBS의 DNA에서 수분까지 상하 운동으로 표시된 표면을 찌르. 참고 : 피부 표면의 일부 홍반이 발생할 수 있습니다. 피가 깊은 상처를 피합니다. PBS에서 DNA로부터 수분 (10 μL)을 피부에 사라지면 피부 표면에서의 움직임을 샤프트 위아래의 수는 동작 가능하게 결정된다. 이 acufection-전달 유전자 가장 일관된 결과를 제공했기 때문에 우리는 30 초에 100 번을 결정했다. 해당하는 경우, 바늘은 최대 6 개의 표적 피부 찌르는 (1cm X 1cm 각)에 대해 재사용 될 수있다. acufection 사이에 70 %의 에탄올과 PBS에서 바늘을 씻어. 그들이 무딘 또는 교차 오염을 방지하기 위해 다른 플라스미드 DNA에 대한 때 새 바늘로 변경합니다. </li><li> 웨이크까지 체온을 유지하기 위해 가열 패드 acufected 마우스 놓는다. </li><li> 그들이있을 때 자신의 케이지에 마우스를 반환회복 충분한 의식. 참고 : 않은 acufected 쥐의 케이지에서 별도의 새장에 acufected 마우스를 유지 (케이지 미만 5 동물). </li><li> 장소에 물병을 넣고 IVC (개별 환기 케이지) 랙에 새장을 반환합니다. </li></ol> 4. 수술 후 케어 <ol><li> 시술 후 첫 48 시간 동안, 밀접하게 행동 변화 (불안, 교반 또는 섭식 장애) 또는 비정상적인 모양 (거친 털 코트 또는 구부리고 자세)를 포함한 모든 불편에 대한 마우스를 모니터합니다. </li></ol> IL-15ΔE7-acufected 스킨의 제 퀴 모드 (IMQ) 치료 참고 : acufected 유전자의 전사 발현과 단백질 생산은 관심의 플라스미드가 삼일 형질 전환 후 각성제의 다른 유형으로 처리 할 수와 acufected 일 3. 마우스에 감지 할 수 있습니다. 우리는 IMQ 크림과 IL-15ΔE7-acufected 마우스 피부를 처리하여 여기에 설명한다. IMQ는 imidazoquinolin 아민 승인 F이고또는 외부 생식기 및 주 산기 사마귀 (13)을 치료. 국소 IMQ 처리는 판상 피부 표피 증식 및 피부 호중구 침윤 12, 14, 15의 발현과 마우스에서 인간 건선과 같은 피부 질환을 유발하는 것으로되어있다. 주 : 플라스미드 벡터는 C 말단 (PEF-IL-에서 IL-2 신호 펩티드 및 FLAG 태그 측면 연장 인자 -1 α의 조절 (PEF)하에 전장 마우스 IL-15의 cDNA를 포함 뱀 포드 등에 의해 기술 된 바와 같이 제조 하였다 (15), 5859 염기쌍). (16). 플라스미드 잔기에서 처음 16 개 개의 아미노산을 삭제하기 위해 IL-15 주형 33 사용 - SOE 의해 IL-15ΔE7 (PEF-IL-15ΔE7, 5,811 염기쌍)에 IL-15 유전자의 엑손 7 48 (합성 오버랩 연장) PCR 방법 (17). 성공적이었다 세균성 식민지IL-15ΔE7 형질는 제한 효소 절단에 의해 확인되고 DNA 서열 12, 18 따랐다. 프로토콜 2 단계에서 설명 된 바와 같이 내 독소가없는 플라스미드 DNA를 대량으로 제조 하였다. <ol><li> tribromoethanol (GM 체중 당 400 μg의)의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 acufected 마취 하에서 건조를 방지하기 위해 눈 안과 의사 연고를 적용한다. 수술 절차를 시작하기 전에 마취의 충분한 깊이를 보장하기 위해 발가락 핀치 반사를 확인합니다. 주 : 2cm X 2cm 피부가 IMQ 치료되기 때문에, 필 - 15ΔE7 플라스미드 DNA (용량 당 10 μL PBS에서 10 μg의) 2 투여 2 개 표적 부위에 acufected된다 (1cm X 1cm 각). </li><li> 표 피부 (2cm X 2cm)을 acufected 면적의 측면. </li><li> 국소 표시된 면적에 IMQ 크림을 적용하는 Q-팁 어플리케이터를 사용합니다. 주의 : 단계 5.1 첫 번째 투여 하였다 (60 mg / 투여 량)에 대해 수행된다.다음 연속 투여가 아닌 마취 된 쥐에 적용됩니다. </li><li> 고화질 캠코더와 함께 매일 IMQ 처리 지느러미 피부의 변화를 문서화합니다. 참고 : 한 사람이 또 다른 기록하는 동안 마우스를 보유하고 있습니다. 스틸 사진을 촬영하고 나중에 편집됩니다. </li><li> IMQ 처리 후 4 일째 또는 7 일째 경추 탈구 하였다 tribromoethanol의 과량 (GM 체중 당 800 μg의)을 주입하여 마우스를 안락사. 피부는 절개되고 처리된다 (- 4.5 4.1 단계). </li></ol> 마우스 피부 6. 균질 현탁액 <ol><li> 꼬리의 기지에서 수평 컷을 만들기 위해 수술 가위를 사용합니다. 사지의베이스에 양자 진행하고 앞다리의베이스에 측면을 따라 수직으로 절단하는 것을 계속한다. </li><li> 조심스럽게 앞쪽에 후부에서 하부 조직으로부터 피부를 벗겨. 등쪽 피부를 잘라 가위를 사용합니다. 멸균 페트리 접시에 피부를 놓습니다. </li><li> 대상을 절제하기 위해 메스를 사용하여피부 즉시 액체 질소에 동결. 참고 실험 실험 간 변동을 최소화하기 위해 각각의 마우스에 대해 고정 된 동일한 acufected없이 피부의 크기 (1cm X 1cm) 또는 IMQ 처리를하여 (2cm X 2cm). </li><li> 핸들과와 유 봉, 사전 냉장 2 칸 박격포의 중심에 냉동 피부 조직을 놓습니다. 조직을 분쇄하기 위해 박격포에 리드 망치를 사용합니다. </li><li> 신속 RNA 추출 또는 단백질 용 해물을 얻기 위해 50 μL의 PBS 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 튜브에 세포 용해 시약 500 μL를 포함하는 새로운 튜브로 분쇄 된 조직을 놓는다. </li></ol> 스킨 부분의 제 H &amp; E 염색과 면역 <ol><li> 카세트에서 피부 조직을 놓고 하룻밤 4 % 파라 포름 알데히드에 젖어. </li><li> 우리의 경우에는 LAC, NTU에서 병리학 실험실에서 수행 하였다 퍼가 부 조직. 주 : 단면 5 ㎛의 두께로 절단한다. 장소 조직 섹션에 ì양전하를 슬라이드 위에 기능. </li><li> 15 분 동안 65 ° C에서 슬라이드를 가열한다. </li><li> 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다. 회 100 %, 95 %, 80 %, 75 %, 60 % 및 재수 50 % 에탄올 (각 5 분)에 순차 침지 한 다음 5 분간 크실렌 대체물을 포함하는 탱크에 대응하는 랙을 담근다. 염색 전에 3 분 동안 수돗물 슬라이드를 담근다. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 수행합니다. 주 : H &amp; E 염색은 LAC, NTU에서 병리학 실험실에서의 요청에 따라 수행 하였다. </li><li> 면역 조직 화학 염색을 위해, 비특이적 백그라운드 염색을 감소시키기 위해 5 분 동안 실온에서 차단 용액으로 차단 부. 참고 : 블록 솔루션은 상업적으로 면역 염색 기술로 개발되고있다. 어떤 동물 혈청이 제품에 포함되지 않습니다. </li><li> 블록 솔루션을 씻어 PBS에서 슬라이드를 찍어. </li><li> 1:10 PBS에서 차단 용액을 희석하고, 2 % 소 태아 혈청 (FBS) (희석액)을 추가한다. </li><lI&gt; 피펫 적절히 희석 차 항체 부분 상에 실온에서 60 분 동안 배양한다. 참고 : 항체를 희석 용액에 희석된다. 염색이 항체 농도는 1에서 최적화되었다 : 800 내지 1 : 200 Ki67 (클론 SolA15) 및 Ly6G (클론 1A8)에 대해 각각. 이 농도는 배경 얼룩없이 별개의 얼룩을 보여 발견된다. <ol><li> 동일한 용액은 이차 항체의 비특이적 결합에 대해 제어하는 ​​차 항체를 생략과 동일한 실행 한 직렬 섹션 얼룩. </li></ol></li><li> 세척을 5 분마다 TBS 세 번 더하기 0.1 % 트윈 -20 (TBST 용액)을 슬라이드. 세척 사이의 변경 솔루션입니다. </li><li> 각 구역에 표지 된 중합체의 한 방울을 피펫 및 40 분 동안 실온에서 배양한다. 주 : 표지 중합체 상업적 된 Fab &#39;단편 감소 옥시다아제 및 이차 항체 아미노산 중합체를 조합하여 제조된다. 시약은 사용 준비가마우스 조직 절편의 면역 조직 화학 염색. </li><li> 워시는 5 분마다 TBST에 세 번 슬라이드. 세척 사이의 변경 솔루션입니다. </li><li> 피펫 3,3&#39;- diaminobenzindine 조직 섹션 위에 tetrahydrochloride (DAB) 솔루션과 갈색 침전물이 밝은 필드 현미경 아래에 보일 때까지 실온에 서 보자. 주 : DAB는 퍼 옥시 다제의 존재 하에서 석출하는 시간은 약 30 분이다. </li><li> 과산화 효소 활동을 중지하기 위해 물에 슬라이드를 담가. 핵 염색 메틸 녹색 솔루션의 딥 슬라이드. 워시는 5 분마다 PBS에 세 번 슬라이드. </li><li> 영구 장착 매체 (부 당 8 μL)으로 덮여 염색 섹션 위에 커버 슬립을 놓는다. </li></ol> 제 사진 및 분석 스테인드 조직 절편의 <ol><li> 명 시야 현미경으로 H &amp; E 염색 IHC 조직 절편을 시각화. 현미경에 연결된 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 사용하여 이미지를 캡처. Q 들어uantitative 분석, 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다 <ol><li> 20 배 목표와 scanscope를 사용하여 전체 스테인드 섹션을 검색합니다. </li><li> 표피의 1 mm 세그먼트 내의 표피 두께를 측정하고, 세그먼트 내의 Ki67 면역 세포의 수를 계산. 참고 : 정량 분석은 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 표피 두께 기저층과 표피의 최 외곽 층 사이의 거리에 의해 정의된다. </li><li> 바로 국소 IMQ 처리 피부 아래의 피부 영역 (230 X 270 μm의 구형 2)에 Ly6G 면역 세포의 수를 계산. </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+via+hair+follicles+by+topical+application+of+naked+DNA+to+normal+skin.">Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin.</a> Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).</li><li>Kennedy-Crispin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes'+response+to+injury+upregulates+CCL20+and+other+genes+linking+innate+and+adaptive+immunity.">Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity.</a> J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).</li></ol>

저자는 공개 재정적 이해에는이 없습니다.

acufected 플라스미드 DNA의 발현을 확인하기 위해 가장 중요한 단계는 균일 진동과 피부의 각질층을 느슨하게한다. 피부를 절단하지 않고 부드럽게 바늘을 누르는 동안, 힘이 표면을 누르기 힘든 충분해야한다. 1cm X 1cm의 면적에 10 μL의 용액에서 DNA의 흡수를 용이하게하기 위해, 바늘은 30 초에 100 회 상하 진동을한다. 하나는 피부를 찌를 필요가 힘을 결정하고 acufected 유전자의 최고 발현 수준을 산?...

피부 숙주 방어의 첫 번째 라인이다. 각질 세포 (KCS)는 인간과 쥐의 피부의 주요 세포 유형입니다. 환경 적 자극 (예를 들면 태양 광, 산소, 화학 물질 및 병원균 침입)에 응답하여, 관세청 활성화 및 IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF-α과 같은 염증성 사이토 카인 및 케모카인의 다양한 생산되고 α 및 GM-CSF 1. 이들은 피부에 면역 세포의 채용을 트리거합니다. 악화되는 피부 염증은 종종 급성 자궁외 접촉 피부염 및 만성 T 세포 매개 성 염증 (예를 들어 알레르기 성 접촉 피부염 및 건선) 2 등 다양한 인간 질병과 연관되어 있습니다. KC 활성화를 억제함으로써 피부의 염증 반응을 조절하는 것은 피부 염증을 치료하는 그럴듯한 방법입니다. 이 프로토콜은 일시적으로 면역 고해상도를 연구하기 위해 표피에서 사이토 카인 유전자를 표현하는 새로운 접근 방식을 설명합니다피부에 이러한 치료에 결과적 ponse. 표피는 피부의 가장 표층을 구성한다. 그러한 피부의 심층 들어가는 병원체 핵산과 같은 외부 물질을 유지하는 물리 장벽으로서 기능한다. 여러 바늘없는 기술은 표피 DNA 전달 3, 4 설립되었다. 용액 중의 DNA 또는 양이온 성 리포솜 또는 아데노 바이러스 벡터와 연관된 직접 이러한 각질층의 제거 또는 시약과 함께 탈모 치료 기법으로 변성 표피에 적용되었다. 각질화 된 상피를 제거하여 DNA는 면역 반응을 유도하는 5 각화 세포 및 랑게르한스 세포, 표피의 장벽 작용을 넘어 용이하게한다. 큰 표면적이 DNA 전송을 위해 사용할 수 있으며이 방법은 바늘을 포함하지 않지만, 요구 사항을 포함하여 단점이있다스트리핑에 의해 - (100 μg의 10), 피부 가혹하고 DNA 전달 부스터 6 않고 면역화 된 동물에서 면역 반응을 유도하는 일관성있는 결과 DNA의 대량 대한. 피부 벗은 DNA의 미립자 - 매개 세포 내 전달은 면역 반응을 7, 8을 유도하는 고효율 및 재현성 것으로 밝혀졌다. 휴대용 유전자 총 가압 헬륨 기류 (9)의 수단에 의해 크기가 2 ㎛의 직경의 플라스미드 DNA 코팅 된 금 입자는 피부의 표적 부위 도배 사용되고있다. 플라스미드 DNA는 아마도 피부 KCsand 수지상 세포에 의해 흡수되고, 단백질은 로컬 표현 또는 수지상 10 림프절로 이송된다. 유전자 총 시스템은 간단하고 제한된 기술 경험은 &quot;DNA의 BUL을 준비하고 제공하기위한 비용이 필요하지만하자 &quot;(즉, 금 분말, 헬륨 가스)와 유전자 총을위한 자체는 일반 응용 프로그램을 제한하고있다. 실험은 서로 다른 위치에서 수행 할 때 또한, 헬륨 가스 공급 시스템에 대한 요구 사항이 유전자 총 수송의 용이성을 제한합니다. Microseeding 단일 분사 입자 충격 (11)에 비해 유전자 전달의 높은 효율을 달성하는 것으로 입증되었다. Microseeding 입자 비드를 사용하지 않고 피부에 DNA를 전달하기 위해 문신 총을 사용한다 (11). 진동이 방법을 이용하여 피부에 미세 바늘이 가능성 직접 동시에 여러 세포에 DNA를 전송하므로 세포막을 긁어. 그러나, 0.254 mm 직경의 바늘 주사 다수과 관련된 통증이 단점이다. 여기에서 우리는 생체 내에서 DNA 전달에 대한 대안 접근 방식을 제공합니다. 은 &quot;acufection&quot; </str옹&gt; 우리는 여기에 설명 된 프로토콜은 마우스의 피부에 플라스미드 DNA를 전달하는 경제적이고 효율적인 방법을 제공합니다. 간략 10 개 침 (× 길이 13mm, 직경 0.2 mm)를 접착 테이프에 의해 다발로 결합 하였다. 관심있는 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA의 10 μg의와 PBS의 10 μL의 볼륨은 면도, 제모 크림 처리 된 측면 피부에 배치되었다. 피부 표면 (1cm X 1cm)을 진동 침술 바늘 뭉치를 사용하여 각질층의 케라틴 느슨하게하고, 표면에 적용되는 플라스미드 DNA는 표피에 흡수시켰다. 피부 손상 모니터링하고 최소한의 것으로 밝혀졌다. acufected 피부 형질 감염된 유전자의 발현은 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR) 및 ELISA에 의해 확인 하였다. 피부 염증에 acufection-전달 IL-15ΔE7의 면역 조절 성 효과는 IMQ 처리 된 마우스 모델 (12)을 이용하여 증명되었다. acufection가 증명하는 동안 쉽고 덜 DEMA 수생체 내에서 DNA 전달을위한 방법을 웍 다른 유전자와 피부를 찌를 수있는 시간에 대한 DNA의 최적의 양은 신중하게 재현 가능한 결과를 얻기 위해 최적화되어야한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accu Handy Needle</td>
			<td>Accu</td>
			<td>36Gx0.5</td>
			<td>Medical device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NairTM Lotion</td>
			<td>Church &#38; Dwight</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Use to remove hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Xyline substitute</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>6764506</td>
			<td>Deparaffinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4,840-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>152463</td>
			<td>Solvent for the dissolution of avertin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DifcoTM LB broth, Miller</td>
			<td>BD</td>
			<td>244620</td>
			<td>Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN&#9415; Plasmid Midi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12143</td>
			<td>Purification of plasmid DNA from E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>88-7215</td>
			<td>Measure IL-15 protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127601</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Ki-67</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-5698-80</td>
			<td>Antibody used for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td>
			<td>Nichirei Biosciences</td>
			<td>414341F</td>
			<td>Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Peroxidse substrate for immunohistochemical stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra V block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TA-060-UB</td>
			<td>Reduce nonspecific background staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8884</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta MountTM</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>M-5000</td>
			<td>Permanently preserving histochemical stains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04-693-116-001</td>
			<td>Inhibit protease activity in cell lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldara cream</td>
			<td>3M Parmaceuticals</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5% imiquimod cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bessman Tissue Pulverizer</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>189475</td>
			<td>Use to pulverize skin tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABI7900HT cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>quantitative real-time PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camcorder</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>HDC-SD60</td>
			<td>Image documentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bright-field microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanScope&#9415; XT</td>
			<td>Aperio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Whole-field image scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#9415; Research Imaging</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an economical dna delivery system by "acufection" and its application to skin research

피부 면역 반응의 조절 장애는 수많은 인간의 피부 질환과 연관되어 있습니다. 피부 조직에 면역 관련 유전자의 직접 전송은 인간의 질병의 마우스 모델에서 피부 염증의 면역 변조를 조사 할 수있는 매력적인 방법입니다. 여기에서 우리는 마우스의 피부에 벌거 벗은 DNA를 전달 유전자 발현에 이르게 비용 효율적인 프로토콜을 제시한다. 상기 방법은 천공 ACU 매개 DNA 트랜스 fection를 나타내는 &quot;acufection&quot;를 만들어 낸된다. acufection을 수행하려면 마우스 피부 제 인산 완충 용액 (PBS)에 DNA 주입 후 세포 내로의 DNA 및 형질 흡수를 용이하게 침 다발로 가볍게 찔러 하였다. 플라스미드 DNA는 아마도 각화 세포 및 피부의 수지상 세포에 의해 용해 단백질로 발현된다. 바늘 자체와 기계 녀석은 피부 손상을 일으키거나 각질 세포의 활성화를 유도하지 않았다. 표현형질 전환 된 유전자의 2 일간 acufection 다음 전사 및 번역 모두 수준에서 피부에서 발견 된 7 일까지 유지했다. 이 acufection 방법의 개발에 주 목적은 IL-15의 미리 정의 이성체를 조사 하였다. 염증을 유도하기 위해, 피부에 표현하고이어서 수신자 같은 수용체 7 (TLR7) 작용제, 이미 퀴 모드 (IMQ) 처리이있어서, 부분적으로 삭제 엑손 7 (IL-15ΔE7)와 다르게 스 플라이 싱 된 IL-15 이성체이었다 사용. Acufection-전달 피부는 IL-15ΔE7 IMQ 유도 된 피부 염증의 각질 세포 증식, 상피 두께 및 호중구 모집을 억제 하였다. 피부 염증의 조절기구를 식별하는 관심이 증가함에 따라, 프로토콜은 여기에 기재된 생체 내에서 DNA 전달을위한 유전자 총 시스템 또는 microseeding에 비용 효과적인 다목적의 대안을 제공한다. 잠재적으로 새로운 기능의 검색을 허용 할 수있다피부 또는 피부 질환에 대한 새로운 치료법을 조사하는 유전자.

일부 붉은 침술 바늘로 찌르는 후 첫 시간 이내에 분명 동안, 피부는 하루 2 지워지고 7 일까지 불리한 피부 반응 (그림 2A)를 따끔 따끔 후 관찰되지 않았다. 바늘 찌름 미처리 피부 (도 2b)과 비교하여 H &amp; E 분석 표피 orthokeratosis 최소한의 피부 침투를 매우 낮은 수준의 유도. 표피 두께 (도 2C) 및 Ki67 +<...

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Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

이 프로토콜은 마우스의 피부에 벌거 벗은 플라스미드 DNA를 표현하기위한 비용 효율적인 대안이다. 프로토콜의 전반적인 목표는 피부 염증의 특정 유전자의 기능적 역할을 묘사하기 위해 피부 조직에 면역 관련 유전자를 제공하는 것입니다.

&quot;Acufection&quot;와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 DNA 전달 시스템의 개발

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

development-an-economical-dna-delivery-system-acufection-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.4K 조회수.  National Taiwan University College of Medicine.  이 프로토콜은 마우스의 피부에 벌거 벗은 플라스미드 DNA를 표현하기위한 비용 효율적인 대안이다. 프로토콜의 전반적인 목표는 피부 염증의 특정 유전자의 기능적 역할을 묘사하기 위해 피부 조직에 면역 관련 유전자를 제공하는 것입니다. 

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Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

에 대한 부정적인 선택 마커의 개발 Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

연구

면역학 및 감염병학

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

siRNA 전달을위한 셀 타입의 특정 안티 HIV gp120 aptamers의 개발

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

핫 수성 - 페놀 추출에 의한 그람 음성 박테리아에서 정화와 Lipopolysaccharide의 시각화

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

개발<em&gt; 체외</em의 상호 작용을 연구&gt; 모델 시스템<em&gt; 에쿠스</em&gt;<em&gt; caballus</em높은 친 화성 수용체 FcεRI에&gt;의 IgE

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine via a series of lymphatic vessels and nodes that converge at the superior mesenteric lymph duct. Cannulation of the mesenteric lymph duct thus enables the collection of mesenteric lymph flowing from the intestine. Mesenteric lymph consists of a cellular fraction of immune cells (99% lymphocytes), aqueous fraction (fluid, peptides and proteins such as cytokines and gut hormones) and lipoprotein fraction (lipids, lipophilic molecules and apo-proteins). The mesenteric lymph duct cannulation model can therefore be used to measure the concentration and rate of transport of a range of factors from the intestine via the lymphatic system. Changes to these factors in response to different challenges (e.g., diets, antigens, drugs) and in disease (e.g., inflammatory bowel disease, HIV, diabetes) can also be determined. An area of expanding interest is the role of lymphatic transport in the absorption of orally administered lipophilic drugs and prodrugs that associate with intestinal lipid absorption pathways. Here we describe, in detail, a mesenteric lymph duct cannulated rat model which enables evaluation of the rate and extent of lipid and drug transport via the lymphatic system for several hours following intestinal delivery. The method is easily adaptable to the measurement of other parameters in lymph. We provide detailed descriptions of the difficulties that may be encountered when establishing this complex surgical method, as well as representative data from failed and successful experiments to provide instruction on how to confirm experimental success and interpret the data obtained.

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

장간막 림프 덕트 유관 쥐 모델 : 창자 림프 약물 운송의 평가에 응용

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that employs multiple immunomodulatory mechanisms to establish chronic infection in mice and closely resembles prevalent human helminth infections. H. polygyrus has been studied extensively in the field of helminth-derived immune regulation and has been found to potently suppress experimental models of allergy and autoimmunity (both with active infection and isolated secreted products). The protocol described in this paper outlines management of the H. polygyrus life cycle for consistent production of L3 larvae, recovery of adult parasites, and collection of their excretory-secretory products (HES).

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus is a murine nematode with powerful immunomodulatory capabilities that closely resemble those of highly-prevalent human helminth infection. Here we describe a protocol for the long-term maintenance of the H. polygyrus lifecycle.

재배<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus :</em&gt; 면역 선충 기생충과 은닉하는 제품

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

"Acufection"와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 DNA 전달 시스템의 개발

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에 대한 부정적인 선택 마커의 개발 Entamoeba histolytica