The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

참고 :이 프로토콜의 모든 절차는 영국 홈 오피스 에딘버러 수의학 대학에서 정한 지침에 따라 수행된다. 위관 마우스 1. 감염 <ol><li> 6 개월까지 4 ° C에서 증류수에 보관 Heligmosomoides polygyrus L3 유충. </li><li> 사용 전에 증류수에 L3 유충을 세 번 세척 : 원심 분리기 (브레이크) 10 분 300 XG에, 물을 제외한 모든 500 μl를 제거 (방해 펠렛 L3 유충을 피하기 위해) 및 펠릿 때마다 재현 탁. </li><li> 세 번째 세척의 경우, 그 구멍을 넓혀 200 μL 팁 컷 정확한 볼륨 (일반적으로 40 ml) 및 흡인 20 μl를 물을 추가합니다. (모바일 및 최적의 해부 현미경으로 50 배 확대하여 봅니다 보통) 60mm 배양 접시의 표면에 두 개의 20 μL 샘플을 놓고 L3 유충을 계산합니다. concentratio 증류수에 최종 펠렛을 재현 탁1 ㎖ 당 2,000 L3 유충의 명. </li><li> 라이프 사이클 생산을위한, 400 H. 8 주 된 F1 (C57BL / 6xCBA) 쥐를 감염 구강 투여에 의한 증류수 200 μL에 polygyrus L3 유충 (목덜미에 의해 수직 위치에 마우스를 억제하고 부드럽게 위장으로 입과 식도를 통해 무딘 위관 바늘을 통과). 선동 각각의 감염 (유충은 물에 빨리 정착) 및 흡인 1 ML의 주사기에 200 μL에 철저하게 사전; 끝이 둥근로 전용 위관 바늘을 사용합니다. 젊은 쥐의 실험 감염 (구 6~8주), 또는 다른 근친 균주 (예 : C57BL / 6 BALBc)의 경우, 200 L3 유충 쥐를 감염. </li></ol> 2. 전파 및 H. 유지 보수 polygyrus <ol><li> 대형 플라스틱 욕조의 중심에 숯을 넣고 차가운 수돗물을 최소 30 분을 위해 그것을 통해 실행 할 수 있습니다 (씻지 않은 활성탄 L3 유충에 독성). 욕조에서 물을 배출하고 t에 숯을 배치완전히 건조 될 때까지, 실내 공기에 노출 떠나는 흡수지 층, WO. </li><li> 계란이 필요한 경우 (필요한 경우 가위), 최초의 집게로 결장 중 대변을 다 쳤어요. L3 유충의 다수가 필요한 경우, 와이어 그리드에 마우스를 위치시키고 며칠 동안 분변 펠렛을 수집한다. </li><li> 다만 종이 필터에 부착 할 정도로 감쇠 일관성을 달성하기 위해, 한 적어도 하나의 비율로 과립 숯 대변 섞는다. 페트리 접시에 일부 젖은 필터 종이의 중앙에 얇게 바르고 습기 상자에이 배치 12-14일의 어둠 속에서 (일부 젖은 종이 타월과 물 접시를 추가). </li><li> 이후 7 일에서 L3 유충을 제거하고 용지가 폐기되기 전에 적어도 2 번의 그들을 수집합니다. 애벌레는 여과지의 가장자리 주위에 고리를 형성하고; 페트리 접시에서 필터 종이를 들어 올려 50 ㎖ 튜브에 (펫 및 플레이트 당 멸균 물 5ml를 사용하여) 판으로 남아있는 유충을 씻어. </li><li> 승강기및 여과지 오프 나머지 유충 50 ㎖ 튜브에 증류수를 플레이트에 남아 수확. 10 분 동안 300 XG에 유출 물 용액을 원심 분리기. 증류수로 유충을 세 번 세척하고 필요한 때까지 증류수 50 ml를 4 ° C에 저장합니다. 주 : 유생 생존을 유지하고, 적어도 6 개월 이상 감염성. </li></ol> 성인 H. 3. 컬렉션 polygyrus 웜 <ol><li> 도 1에 도시 된 바와 같이 미리 변형 Baermann 준비 장치. </li><li> 십사일 감염 후 발췌 마우스. </li><li> 70 % 에탄올로 복부를 씻으십시오. 복부를 통해 피부를 잘라 전방 복벽을 공개 철수. 복강를 입력 정중선 절개를합니다. </li><li> (원위부 직장에 근위 십이지장에서) 전체 크고 작은 창자를 제거합니다. 건조 페트리 접시에 놓습니다. </li><li> 전체 길이를 따라 장을 직선화; 대변​​ 함유 대장을 절제; 나중에 계란 준비를위한 별도의 접시에이를 배치합니다. </li><li> 때문에 내 내강 벌레 십이지장 종종 붉은 모양의 비교적 두꺼운 벽에 의해 증명되는 어른 벌레가 포함되어 소장의 근위 20cm를 절제. 행크스 &#39;액 5 mL를 (100mm 직경) 페트리 접시에 놓고, 37 ° C (접시 당 두 개의 표본)로 가열. </li><li> 가위 (라운드 종료 가위이 가장 아르)와 종 방향 웜 가득 근위 창자 부분을 열고 웜을 제거하기 위해 두 개의 유리 슬라이드 라이닝 장 내부에 아래로 긁어. 그런 다음 깨끗한 창자 벽을 폐기합니다. </li><li> 작은 모슬린 가방에 팁 웜, 주식 폐쇄 및 유리 깔때기 (그림 1)의 가장자리 주위에 클립으로 고정합니다. </li><li> 행크스 &#39;솔루션으로 깔때기를 작성하고 각 깔때기에 웜의 약 4 페트리 접시를 추가합니다. </li><li> 1 ~ 2 시간 동안 37 ° C 배양기에 넣어 장치, 부드럽게 반까지 교반하면 빠지지모슬린 필터를 막다 수있는 장 준비에서 파편. 모슬린 가방 외부 이물질의 유출을 방지하기 위해주의 -이 최종 HES 제제의 오염의 원인이됩니다. 성인 웜 천천히 모슬린 천 통해 이주 및 유리 시험관의 하단에 정착한다. 조심스럽게 (이 시점에서 웜을 잃지 않도록주의하면서) 싱크를 통해 연결 고무 호스에서 테스트 튜브를 분리합니다. </li><li> 플라스틱 피펫을 사용하여, 50 ㎖ 튜브에 웜을 전송하고 씻어 여섯 번 행크스와 함께 &#39;솔루션 (웜 stripette와 미디어, 중력 침전 제거 할 수 있도록 허용, 추가 행크스의 40 ml의&#39;솔루션을 다섯 번 반복). 참고 : 웜 문화는 이후이 시점에서 멸균 보관해야합니다. <ol><li> 층류 후드로 이동 100 U / ml의 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 체외 문화에 대한 준비와 보충 멸균 행크스 &#39;솔루션에 다른 여섯 번 씻는다. </li></ol></li><li> 카운트그 구멍을 넓혀 노란색 팁 인하와 함께 찍은 20 μL의 두 샘플을 채취하여 복구 어른 벌레; 접종 유충의 양의 약 50 %를 기대합니다. </li></ol> 중간 준비, 성인 웜을 세척 4. HES에 대한 문화를 설정 <ol><li> RPMI의 약 10 ml의 3.11에서 벌레를 적시는 벌레가 완전히 덮여 수 있도록 각도로 튜브 휴식을 떠나, 20 분 동안 10 % 겐타 마이신으로 보충. </li><li> 층류 후드에서이 작업을 수행 행크스 &#39;솔루션 다시 여섯 번 씻어 (5 U 보충 / ㎖ 페니실린 및 5 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신). </li><li> H. 준비 polygrus 미디어. </li><li> 11.1 ml의 45 % 글루코오스 (최종 농도 RPMI1640 0.2 % 글루코스를 포함 1.2 %), 100 × Peniclllin - 스트렙토 마이신 (최종 농도 5 U / ㎖ 페니실린 5 ㎖를 넣고 500 RPMI1640 ml의, 층류 후드에서 무균 유지 5 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신), L 글루타민 5 ㎖ (2 mM의 최종 농도) 및겐타 마이신 5 ㎖ (최종 농도 1 %). FCS를 추가하지 마십시오. </li><li> 배출 T25 플라스크로 나누어지는 웜, 약. 15 ML의 H. 1,000 벌레 polygyrus 플라스크 당 미디어, 37 ° C 배양기 (5 % CO 2) 삼주에 대한 정직한 곳. </li></ol> HES 5. 준비 <ol><li> 문화의 24 시간 후 첫 컬렉션을 따로 설정, 두 번 일주일 이상 더 이상 간격으로 문화 문화 매체를 HES가 함유 수집 (때문에 LPS 오염 및 호스트 단백질의 높은 수준 - 개별적으로 처리하거나, 삭제할 수 있습니다). 별도의 명확 날짜 및 배치 번호가 표시 각각의 컬렉션을 유지합니다. H. 같은 부피로 교체 각 행사에 polygyrus 미디어. </li><li> 원심 5 분 동안 400 x g에서 미디어 HES가 함유. 이어서 50 ㎖ 튜브에 0.2 ㎛의 저 단백질 - 결합 필터를 통해 살균 필터. -20 ° C 냉장고에 보관 명확하게 HES (c)의 웜 수확의 날짜와 날짜 표시ollection. </li><li> 문화 HES 컬렉션 21 일 후, 벌레를 폐기합니다. </li><li> (보통 냉동 콘텐츠로부터, 상기 제 24 시간 컬렉션을 포함하지 않음), 및 질소 가압하에 한외 여과 장치에서의 필터 3000 MWCO를 통해 농축 HES 상청 500-1000 ml의 풀. 참고 : 필터 실행 건조 들어 가지 않도록주의해야합니다. <ol><li> 필터 장치를 설정 첫째 교반하면서 3 × 20 ​​분 동안 증류수 1 리터 비이커에 아래 3 kDa의 막 반짝이는면을 세척합니다. 필터 멤브레인 광택면을 위로하여 제조업체의 지침에 따라 한외 여과 장치를 조립합니다. 4 ° C에서 캐비닛의 장소 및 풀링 HES을 집중하기 시작하기 전에를 통해 증류수 50 ㎖를 전달합니다. </li><li> 볼륨이 2-5 ml의 농축 될 때까지 (하루에 100-140 ml)을 필요에 따라 여과 장치에 HES의 각 튜브를 추가합니다. </li></ol></li><li> 피라 50 ㎖를, HES - 함유 배지에서 오염물을 제거하기 위해서 추가PBS 및 여과 장치 및 ogen없는 한 다음 약 2 ㎖의 아래로 농축시킨다. 두 번이 단계 (총 PBS 150 ㎖)를 반복합니다. 층류 후드에서 15ml의 튜브 (0.2 μm의 필터) 필터 소독 HES로 옮기고, 분광 광도계 (10 E = 280) 또는 브래드 포드 분석법을 이용하여 단백질 농도를 측정한다. </li><li> 나누어지는, -80 ° C에서 배치 번호와 날짜, 동결 레이블. </li><li> 사용하기 전에 HES의 각 배치의 제조 업체의 프로토콜에 따라 발색 LAL 분석을 수행합니다. LPS 레벨은 1 μg의 단백질 당 1 U LPS보다 많은 경우, 생체 내 또는 시험 관내 실험 배양이 배치를 사용하는 것을 고려하지. </li><li> 별도로 동일하게 24 시간에 수집을 HES 방법; 적합하지 기능적 실험 그것이 모노클로 날 항체의 친 화성 정제에 의해 단리 될 수있다 개별 분자의 유용한 소스가있는 동안은, LPS 및 일부 숙주 단백질을 포함 할 것이다. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

H.의 수명주기 안정적으로 일관된 방식으로 polygyrus 진행됩니다. 자연 섭취 또는 0 일에 L3 유충의 구강 투여 후, 낭종이 10 일에서 장 루멘으로 어른 벌레로 부상 한 후 유충의 moults로 진행하고, 5 일에 의해 십이지장 장막에서 형성되기 시작, 계란에서 대변에서 볼 수 있습니다 14 일 및 육아종 일 (21) 전술 (그림 6에 요약) 프로토콜에서 십이지장 장막 표면에 볼 수 있습니다 H.의 높은 처리량 생산 가능 미래의 실험 및 라이프 사이클 감염 가능한 L3 유충의 안정적인 복구에 추가 polygyrus의 배설-분비 제품 (HES). H.의 polygyrus 감염은 OVA 나 데르 P 1 (집 먼지 진드기 알레르기 항원) (14)에 따라 천식 모델에서 보호 될 것으로 나타났다. 또,기도 염증의 억제는 CD4 + CD25 +로 전송 될 수있다 </sup&gt; T 조절 세포는 14 또는 CD19 + CD23 하이 규제 B 세포로부터 24 H. 비 감응 polygyrus 쥐를 -infected. 자가 면역, H. 모델에서 polygyrus 감염은 다발성 경화증 (9)의 실험적인자가 면역성 뇌척수염 (EAE) 모델의 억제로 도시되었으며, 진압 감염된 마우스 (24)로부터 CD4 + T 세포 또는 CD19 + B 세포 중 하나와 함께 전송 될 수있다. 자극 (25) 수상 세포 반응성) 억제 CD4의 b) 유도 : Heligmosomoides polygyrus 배설-분비 제품 (HES)를 포함하여, 숙주 면역 반응을 조절하고 (도 7에서 설명하는) 다수의 메커니즘에 의해은 Th2 매개 염증 억제 + + Foxp3를 조절 T 세포 18. 및 c) IL-33의 생산 (20)의 봉쇄. 를 관리 할 때 HES가 보호 될 것으로 나타났다t 과민성 또는 도전 천식 (19)의 OVA-명반 모델 및 조기 IL-33 릴리스의 억제를 통해, 알터 추출물 알레르기 (20)와 비강 내 투여시. HES의 LPS 오염의 회피는 종종 미래의 면역 학적 실험의 성공을 위해 매우 중요합니다. 여기에 설명 된 프로토콜,이 달성의 중요한 단계는 (2.10 참조)과 문화의 첫 24 시간을 제외 ES 솔루션을 설정하는 최종 HES 준비를 입력하지 않는 Baermann 장치의 모슬린 가방에 포함 된 그 파편을 보장하는 (5.1 참조). 최근 몇 년 동안, HES는 철저하게 26, 27 확인 된 370 별개의 단백질과 단백체 수준에서 특징으로하고있다. 또한, 제 4 단째는 유충 ES 프로테옴 분석 (28)에 실시되었다. 3의 계속 강하게 면역 원성 공지 HES의 주요 글리 칸 성분을 특성화 포함하고, 마이크로 RN 분비그는 50 ~ 100 nm의 소포 또는 엑소 좀 (벅 등., 게시를 위해 제출)에 캡슐화되어있다. 이 높은 면역 기생충에서, 그리고 HES의 분자 구성 요소를 식별하는 광범위한 단백체 데이터와 ES의 수집에 대한 재현성 프로토콜의 설립으로, 무대는 이제 식별 및 H.에서 개별 분자의 치료 테스트 설정 호스트 면역 체계에 중요한 영향을 중재 할 수 polygyrus.

Heligmosomoides의 polygyrus 밀접 높은 널리 인간 선충 기생충 일에 관련되어 자연 쥐의 위장 기생충이다. 이러한 Nippostrongylus의 brasiliensis, H. 다른 선충 모델과는 대조적으로 polygyrus 일관는 숙주 면역 반응을 억제하는이 채용 여러 강력한 면역 조절 메커니즘의 직접적인 결과로 생쥐의 만성 감염을 확립한다. H.의 polygyrus은 직접 수명주기를 가지고 : 감염 L3 유충이 FECO 구강 전송 섭취 (또는 실험실 설정에서 구강 투여에 의해 관리), 그들은 같이 장 루멘으로 돌아 가기 전에 십이지장과 encyst의 장막 층으로 이주 그러자 약 팔일 초기 감염 후 성인 웜. 상대와 계란 생산은 10 일에 의해 발생하며 다에서 배설-분비 제품의 문화와 수집을위한 성인 벌레를 수확 할 수있다Y (14) 이후 3. H. polygyrus 또한 감염된 감염 마우스 4-6, 및 H.의 증가 수준에서 증가 유산균으로, 공생 미생물에 존재하는 상호 작용 유산균 6 마우스의 노출 다음 polygyrus 감염. H.와 활성 감염 polygyrus가 7-10 많은자가 면역 동물 모델에서 면역 병리에 대하여 보호하는 것으로 나타났다, 11, 12 및 알레르기 성 대장염 13-16. 결과적으로이 기생충의 아웃풋 - 분비 분자의 가능성에 큰 관심이있다 ( &quot;HES&quot;)는 생체 (17, 18)에서 병리학을 다운 조절합니다. 사실, 보호 효과는 이제 18, 20 확인되는 경로를 통해 HES 제품 (19)와 쥐의 치료 다음 볼 수 있습니다. 여기에서 우리는 그것의 분비 제품의 신뢰성 Heligmosomoides의 polygyrus의 생산 및 복구를 위해 프로토콜을 설명즉 추가의 생화학 적, 면역 기능의 조사 범위에 대해 사용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1183">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Material Name</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:157px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Amicon concentrator</td>
			<td style="width:83px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">5112</td>
			<td style="width:157px;">Model 8050 50 ml 
			http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM 
			_NF-5122</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Hanks&#8217; buffered salt solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">H9394</td>
			<td style="width:157px;">500 ml 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Penicillin streptomycin</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">15070-063</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:83px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">25030-081</td>
			<td style="width:157px;">200 MM 100ml 
			https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:83px;">Merck</td>
			<td style="width:143px;">1.09624.0500</td>
			<td style="width:157px;">18-35 mesh 
			http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Glucose solution</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">G8769</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 45% solution 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Falcon tubes</td>
			<td style="width:83px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">62.547.254</td>
			<td style="width:157px;">50 ml 
			http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">T25 Flasks</td>
			<td style="width:83px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">CLS430639&#160;</td>
			<td style="width:157px;">25cm vented flask 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&#38;region=GB</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Chromogenic LAL assay</td>
			<td style="width:83px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">50-647U</td>
			<td style="width:157px;">QCL-1000 assay 
			http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:209px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">15710-049</td>
			<td style="width:157px;">100 ml 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:209px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td>
			<td style="width:83px;">Gibco</td>
			<td align="right">11875093</td>
			<td style="width:157px;">500 ml; without L-glutamine 
			http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides의 polygyrus (이전 Nematospiroides의 dubius로 알려져 있으며, 또한 H. bakeri 일부에 의해 참조) 밀접하게 쥐에 만성 감염을 설정하는 여러 면역 메커니즘을 고용하고 위장 기생충이 널리 인간의 기생충 감염과 유사하다. H. polygyrus는 기생충 유래 면역 조절 분야에서 광범위하게 연구되었고, 강력하게 (활성 감염 및 격리 분비 제품 모두) 알레르기와자가 면역의 실험 모델을 억제하는 것으로 확인되었습니다. 이 문서에 설명 된 프로토콜은 H. 관리를 설명 자신의 배설-분비 제품 (HES)의 일관된 L3 유충의 생산, 성인 기생충의 복구 및 수집을위한 polygyrus 수명주기.

H. 감염에 대한 감수성 polygyrus는 마우스 균주 (표 1)의 유전 적 배경에 의해 고도로 제어되고; C57BL / 6 CBA 마우스는 21, 22, 매우 민감하다. 기생충의 라이프 사이클의 유지 관리를 위해,이 두 균주 사이의 F1 잡종 어느 모 균주에 비해 이환율 (과도한 장내 상피 손상)없이 훨씬 높은 웜 부담을 견딜 수있는 능력에 대해 선택되었다. 400 L3 유충의 구강 투여는 일반적으로 동형 접합 근친 균주의 실험 (예를 들어, C57BL / 6에 사용되는 200 L3 유충의 복용량 동안, (그림 2 성인 웜 부담의 결과로) F1 생쥐의 수명을 유지하는 데 사용됩니다 또는 BALBc). 그러나,이 용량은 장내 식물의 변화와 같은 동물 시설 사이에 다를 수 있습니다 환경 공동 요인에 따라 감소 될 필요가있다. HES의 일괄 재현 effi을 입증기능 분석에서 단백질 조성물 cacy; 배양의 각 연속 주에서 상등액 4 주 총까지 분석 한 결과 또한, 단백질 프로파일 (도 3) HES 농도는 브래드 포드 분석에 의해 측정 될 때. (5.5 참조) 매우 유사한 것으로 밝혀졌다, 총 단백질은 일반적으로 약 1 밀리그램 / ㎖ (그림 4)입니다. HES를 집중하는 다른 방법은 샘플 버퍼 염, 저 분자량 성분을 제거, 스윙 아웃 로터 원심 최대 4,000g에서 회전하는 원심 농축기 (예 VIVASPIN 3 kDa의 컷 - 오프 멤브레인)로된다. 원심 농도가 가장 작은 처리 볼륨 (1 ~ 10 ㎖)에 적합하고, 약 30 배의 최대 집중 계수로 제한됩니다. HES를 수집 할 때, 오염의 방지가 중요하다. 호스트 분자와 오염을 방지하기 위해, 우리는 HES-계속을 폐기마우스 소장에서 성인 웜 수확 후 첫 24 시간에서 문화 매체를 aining. 또한 발색성 LAL 분석 (5.7 참조​​) HES의 각 배치에 오염 LPS 레벨을 정량화. LPS의 1 U는 ~ 100 페이지 LPS 총점이 아래 수준은 23 무시할 간주됩니다. 우리의 손에, HES 대부분의 배치는이 한도가 크게, 0.23 U / μg의 인 HES의 LPS의 평균 농도 (그림 5)입니다. 병리학의 생체 내 모델에서 LPS의 효과는 (예를 들어 천식 반응의 억제) LPS (23)의 적어도 10 NG가 필요합니다. 따라서 100 페이지 LPS / μg의 HES와 배치에서 5 μg의 HES의 생체 관리 500 페이지의 LPS, 잘 아래 LPS가 문제가된다 유효 농도를 포함 할 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> 그림 1 : Baermann 장치 배어성인 H.의 수집을위한 MANN기구 설치 polygyrus (2 절에서 설명). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> 그림 2 : 14 일 400 L3 유충 평균 웜에 감염 후 평균 웜 부담은 14 일 400 L3 유충 감염 후 부담. 표시된 데이터 포인트는 C57BL / 6xCBA 마우스의 감염의 19 별도 라운드에서 있습니다. ± SEM이 표시 의미. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> 그림 3 : 문화의 주 연속 수집 HES 단백질의 문화 SDS-PAGE 프로필에 주 연속에서 HES의 단백질 프로파일. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> 그림 4 : </strong&gt; 500㎖의 ES-포함하는 배양 상층 액의 약 500 ml의에서 파생 된 11 가지 배치에서 HES 단백질의 미디어 수율에서 HES의 최종 수량. ± SEM이 표시 의미. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> 그림 5 : 리 물러의 ameobocyte 분석에 의해 측정 HES의 41 일괄 LPS 오염의 HES 수준의 LPS 오염. 중간 LPS 농도 = HES의 86 U 당 MG. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> 그림 6 : H. 애니메이션 회로도 HES의 분리에 애벌레와 어른 벌레의 회복을 통해 L3 유충의 구강 투여에서 키 수명주기 단계의 polygyrus 수명주기 개요. 그림 7 : HES와 그 기능 HES에 포함 된 수용성 매개체와 엑소 좀의 주요 면역 효과를 애니메이션 회로도. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 유전자형 (및 배경 균주) </td><td> 차 감염 표현형 </td><td> 참고 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 근친 균주 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> 매우 취약 </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6와 C57BL / 10 </td><td> 감수성 </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / C, DBA / 2, 129 / J </td><td> 중간의 </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </TD&gt; <td> 낮은 감수성 </td><td> (22), (32) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 사이토 카인 또는 사이토 카인 수용체 형질 </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> 더 취약 </td><td> (33) </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> 덜 영향 (a); 더 감수성의 변화 없지만 증가 육아종 (B) </td><td> (33) </td></tr><tr><td> (b) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ 유전자 변형 (C57BL / 6) </td><td> 저항하는 </td><td> (35) </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> 높은 생산력 </td><td> (36) </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 또는 BALB / c) </td><td> 매우 취약 </td><td> (22) </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c 또는 C57BL / 6) </td><td> 고도의 내성 </td><td> (37) </td></tr><tr><td> IL-9 형질 전환(FVB) </td><td> 저항하는 </td><td> (38) </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> 결핍은 Th2, 육아종 gormation 감소 </td><td> (39, 40) </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> 더 취약 </td><td> (33) </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> 감수성 변화 없음 </td><td> (33) </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> 높은 TH1, 감수성을 증가 </td><td> 41, 42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> T 세포 형질 전환 용 마커 </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> 변두리에 더 높은 생산력 </td><td> (43) </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> 높은 생산력 </td><td> (44) </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> 높은 생산력 및# 160; </td><td> (45) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 선천성 면역 궤적을위한 형질 전환 </td><td></td></tr><tr><td> 타입 1 인터페론 수용체 (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> 높은 생산력, 더 육아종 </td><td> (34) </td></tr><tr><td> 에서 MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> 더 많은 저항, 더 육아종 </td><td> (34) </td></tr><tr><td> C-KitW / 웨스트 버지니아 (WBB6) </td><td> 더 취약 </td><td> (46, 47) </td></tr></tbody></table> 표 1 : H.와 차 감염 유 전적으로 다른과 유전자 타겟으로 마우스 균주에 polygyrus.

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides의 polygyrus 밀접 높은 널리 인간의 기생충 감염의 것과 유사 강력한 면역 조절 기능이있는 쥐의 선충이다. 여기에서는 H.의 장기적인 유지 관리 프로토콜을 기술 polygyrus 라이프 사이클.

재배<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus :</em&gt; 면역 선충 기생충과 은닉하는 제품

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.2K 조회수.  University of Edinburgh.  Heligmosomoides의 polygyrus 밀접 높은 널리 인간의 기생충 감염의 것과 유사 강력한 면역 조절 기능이있는 쥐의 선충이다. 여기에서는 H.의 장기적인 유지 관리 프로토콜을 기술 polygyrus 라이프 사이클. 

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Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases show Chagas disease up to three decades or later. Autoimmunity and parasite persistence are competing theories to explain the pathogenesis of Chagas disease 1, 2. To separate roles played by parasite persistence and autoimmunity in Chagas disease we inoculate the T. cruzi in the air chamber of fertilized eggs. The mature chicken immune system is a tight biological barrier against T. cruzi and the infection is eradicated upon development of its immune system by the end of the first week of growth 3. The chicks are parasite-free at hatching, but they retain integrated parasite mitochondrial kinetoplast DNA (kDNA) minicircle within their genome that are transferred to their progeny. Documentation of the kDNA minicircle integration in the chicken genome was obtained by a targeted prime TAIL-PCR, Southern hybridizations, cloning, and sequencing 3, 4. The kDNA minicircle integrations rupture open reading frames for transcription and immune system factors, phosphatase (GTPase), adenylate cyclase and phosphorylases (PKC, NF-Kappa B activator, PI-3K) associated with cell physiology, growth, and differentiation 3, 5-7, and other gene functions. Severe myocarditis due to rejection of target heart fibers by effectors cytotoxic lymphocytes is seen in the kDNA mutated chickens, showing an inflammatory cardiomyopathy similar to that seen in human Chagas disease. Notably, heart failure and skeletal muscle weakness are present in adult chickens with kDNA rupture of the dystrophin gene in chromosome 1 8. Similar genotipic alterations are associated with tissue destruction carried out by effectors CD45+, CD8&gamma;&delta;+, CD8&alpha; lymphocytes. Thus this protozoan infection can induce genetically driven autoimmune disease.

The inoculation of Trypanosoma cruzi in fertile eggs prior to incubation renders the parasite kDNA minicircle integration in embryo cells genome. Crossbreeding reveals the vertical transfer of the mutations to progeny. The kDNA integrates into coding regions at several chromosomes and the chickens die with an inflammatory autoimmune heart disease.

기생충은 치킨 모델에서 유전 힘입어 면역 Chagas의 심장 질환을 유발

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

연구

면역학 및 감염병학

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

세포에 붙어 Antileishmanial 검사에 대한 기생충 구조 및 변화 분석<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 인간 급성 백혈병 Monocytic 셀 라인에서&gt; Amastigotes

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

The immunomodulatory properties of human mesenchymal stem cells (MSC) appear increasingly relevant for clinical application. Using a co-culture system of MSCs and peripheral blood leukocytes pre-stained with the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), we describe the in vitro assessment of MSC immunomodulation on effector leukocyte proliferation and specific subpopulations.

인간 중간 엽 줄기 세포의 면역 속성 (MSCS)의 평가

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

변조 C 디 GMP가에서 시그널링 그건 작은 분자를 스크리닝하기위한 높은 처리량 설정 구축<em&gt; 녹농균</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

&quot;Acufection&quot;와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 DNA 전달 시스템의 개발

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

면역 마약 식별을위한 T 림프구에서 미토 겐 유도 블라스의 신속한 정량

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...