Name: using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
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This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.

1. 실리콘 웨이퍼 금형 제작 참고 : 포토 마스크 AutoCAD 소프트웨어 설계 및 상업 회사에 의해 제조된다. 이 디자인은 다른 패턴 (세 층을 포함 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">보충 파일 1</a> ). 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 층의 높이가 각각 약 4 ㎛의 10㎛, 및 50㎛의이다. 실리콘 웨이퍼 몰드 소프트 리소그래피 9, 10을 이용하여 포토 마스크에서 만들어졌다. <ol><li> 10 분 수증기를 증발시켜 200 ℃에서 실리콘 웨이퍼를 구워. 스핀 코팅 네가티브 포토 레지스트 SU-8을 실리콘 웨이퍼 상. 참고 : 스핀 코트 SU-8 3005 (30)의 첫 번째 레이어를 생성하기 위해 5,000 rpm에서, SU-8 2010 년 3,000 rpm에서 30 초는 두 번째 레이어를 생성하기 위해, 그리고 SU-8 3025 2000 rpm에서 30 초는을 생성하는 셋째 층. </li><li> t 전에 코팅 된 웨이퍼를 소프트 베이크패턴 전사를 그. 정렬하고, 마스크 얼 라이너를 사용하는 &quot;직접 접촉&quot;모드에서 웨이퍼를 노출. 주 : 소프트 베이크 제 층 95 ℃에서 2 분, 두 번째 층의 95 ° C에서 3 분간, 및 제 3 층, 95 ° C에서 15 분간 웨이퍼. 하여 100mJ / 제 2 층 cm, 130 mJ의 / 제 2 층 cm, 200 mJ의 / 제 3 층에 대한 cm 2의 노광량을 사용한다. </li><li> 노출 후, 웨이퍼를 후 구워 SU-8 개발을 사용하여 개발한다. 는 N 총 2 하드 베이크 30 분 동안 200 ℃에서 웨이퍼를 이용하여 웨이퍼를 건조. 주 : 실리콘 웨이퍼가 몰드 패턴면이 위로 향하게하여, 스카치 테이프를 이용하여 15cm 직경의 플라스틱 페트리 접시에 고정된다. 일반적으로, 우리는 다수의 미세 유체 칩은 동시에 제조 될 수있는 동일한 금형 여러 동일한 칩 구조물을 넣어. 각 주형은 미세 유체 칩을 제조하기 위해 여러 번 재사용 될 수있다. </li></ol> 2. 미세 유체칩 제조 <ol><li> 균형에 깨끗한 무게 보트를 놓고 균형을 용기를. 체중 배에 PDMS 기반의 50g을 부어. </li><li> 체중 보트 PDMS 경화제 5 g을 넣고 (w /를 PDMS 기재 1:10의 비율 w). 주 :이 양 몰드와 15cm 직경의 배양 접시에 기초한다. 다른 크기의 페트리 접시를 사용하는 경우, 시약의 양을 조정한다. </li><li> PDMS의 기재하고 일회용 피펫 경화제 교반한다. 계량 보트의 가장자리에서 시작하고 서서히 안쪽으로 이동합니다. 작은 기포가 혼합물에 걸쳐 형성 할 때까지 몇 분 동안 철저하게 저어; 철저하게 혼합 PDMS 중합 필수적이다. </li><li> 천천히 페트리 접시에 붓고, 혼합물; 혼합물을 완전히 실리콘 웨이퍼 금형을 포함한다. </li><li> 10 분은 PDMS 혼합물로부터 모든 공기 방울을 제거하기 위해 진공 페트리 접시를 배치했다. 기포가 혼합물의 표면에 남아 있으면, 그들을 밖으로 날려 피펫을 사용합니다. </li><li> 실리콘을 품어약 2 시간 동안 75 ° C의 오븐에서 PDMS 몰드와 웨이퍼. </li><li> 부드럽게 웨이퍼 금형의 구조에 손상을 피하고, 실리콘 웨이퍼 금형 오프 중합 PDMS 층을 박리. 대안 적으로, 단일 에지 산업 면도날을 사용하여, 패턴의 주위에 최소 5 mm 마진으로 실리콘 웨이퍼를 금형에서 직접 PDMS 컷; 부드럽게 웨이퍼 몰드 오프 PDMS 층을 박리. </li><li> 패턴면이 위로 향하게하여 작업대에 PDMS 층을 놓는다. 조심 구조 손상을 피하기 위해 각각의 단일 칩의 에지에서 충분한 마진을 유지하는, 단일 에지 산업 면도날 개별 칩을 잘라. </li><li> 위로 향하는 패턴면, 각각의 채널 측에 곧장 입구 및 출구를 통해 원형 펀치 구멍 펀치 펜 (0.75 mm ID)를 사용한다. 참고 :이 구멍이 매체의 흐름에 대한 경로를 만듭니다. 따라서, 원을 통과하고, PDMS 층을 통해 모든 방법을 펀치 중요하다. 에 있는지 확인구멍에서 PDMS 열을 제거합니다. </li><li> 구멍에 다시 펀치 펜 바늘을 삽입하여 모든 펀치 구멍을 확인하십시오. 바늘이 막힘이 없음을 나타내는 다른 측면에서 나올 수 있는지 확인합니다. 패턴 표면에 테이프를 적용 부드럽게 먼지를 청소 테이프를 벗겨. 이 단계에서 적어도 세 번 반복합니다. 살균을 유지하기 위해 PDMS에 스카치 테이프의 깨끗한 조각을 남겨주세요. </li><li> PDMS의 반대편에서이 절차를 반복뿐만 아니라 테이프의 마지막 조각을 둡니다. </li><li> 0.13-0.17 mm의 두께, 24 mm X 30mm의 커버 유리를 준비한다. 표면 소독, 먼지 제거하여 유리에 70 % 에탄올을 분무 건조; 또한, 멸균 된 유리를 물로 세정하고, 먼지 제거 장치에 의해 건조 될 수있다. </li><li> 플라스틱 판에 커버 글라스와 PDMS로 이동. PDMS의에서 스카치 테이프를 제거하고 위를 향하도록 패턴면을 넣습니다. 전송 중에 패턴 표면과의 접촉을 피하십시오. </li><li&gt; 플라즈마 시스템의 플라스틱 판을 놓는다. PDMS의 산소 플라즈마 처리를 다음과 같은 동작 파라미터 친수성 표면 렌더링 커버 유리 적용 노광 (75 개)들; 가스 안정화, 20 CC / 분; 압력, 200; 전력, 100 W. </li><li> 조심스럽게 모두 친수성 표면 (플라즈마 처리 중에 직면하는면)을 연결하는 커버 유리 위에 PDMS를 배치했다. PDMS의 커버 유리 사이에 기포가 없는지 확인합니다. </li><li> 적어도 2 시간 동안 75 ° C의 오븐에서 PDMS 칩 인큐베이션. 참고 : 불충분 한 미세 유체 실험시 현미경에 액체 누출의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 약간 핀셋 가장자리에서 PDMS를 올려 PDMS와 커버 글라스 사이의 결합을 확인하는 것이 중요하다. 부드럽게 성공적인 결합을 나타내는 커버 유리에서 분리되지 않아야 PDMS 리프팅. </li></ol> 3. 실험 준비 <ol><lI&gt; 튜브 제조. <ol><li> 70 % 에탄올 용액을 별도로 PDMS 칩 제조 전에 1 일 입출력 튜브 담근다. </li><li> 튜브를 세척 멸균 물 5 mL를 주사기를 채우기. 주사기에 튜브를 연결하고 물에 튜브를 세척하여 각 튜브를 씻으십시오. </li><li> 에탄올 잔기 청소 세정 공정을 3 회 이상 반복한다. </li></ol></li><li> 반드시 구조가 일관되고 그대로 만들기 위해 10X 목표와 광학 현미경으로 PDMS 채널을 검사합니다. 스카치 테이프를 사용하여 현미경 플랫폼 상에 PDMS 칩을 안정. 참고 : 장치를 처음 만드는 특히, 백업 칩이 있다는 것을 확인하기 위해 2 단계에서 한 번에 여러 개의 칩을합니다. </li><li> 멸균 물을 5 ML의 주사기를 채우십시오. 주사기 펌프와 주사기를 고정하고, 해당 입력 및 출력 튜브를 삽입한다. 약 10 분 동안 칩을 씻어 750 μL / h의 세정 속도를 설정한다. 분기 채널의 기포이 기간 중에 씻겨한다; 남아있는 거품이있는 경우, 수동으로 거품을 제거하기 위해 속도를 조정합니다. </li><li> 효모 샘플 준비. <ol><li> 3,000 × g으로 5 분간 두 1.5mL 용량의 마이크로 원심 튜브에 용액 제조 효모 샘플 (OD 600 0.6-0.8)의 양도 1 원심 분리기. </li><li> 각 튜브에서 뜨는의 대부분을 제거하고 0.5 mL의 샘플을 형성하기 위해 나머지를 결합합니다. </li></ol></li><li> 주사기 펌프를 일시 중지하고 PDMS 칩으로부터 입력 튜브를 제거한다. </li><li> 수동 각 입력 튜브 (길이 1~2 cm)의 작은 기포를 흡입하도록 주사기 펌프를 역방향. 효모 샘플에서 빨아로 이동합니다; 기포는 샘플 경계를 표시하고 그려 얼마나 많은 샘플을 나타냅니다. 참고 : 주사기에 샘플을 흡입하지 마십시오. </li><li> 다시 PDMS 칩에 입력 튜브를 삽입하고 750 μL / h의 속도로 셀로드를 다시 펌프. </li><li> 10 분 동안 펌프 주사기를 남겨n 및하면 현미경으로 세포 로딩 진행을 검토; 기둥을 중지의 60 % 이상에서 성공적으로 로딩 것이다 트랩 세포. </li><li> 영양 용액으로 전환 세포 배양 400 μL / h의 속도를 조절한다. </li><li> 현미경 선택 관측 위치. 주 : 수명 측정의 경우, 이미지는 40X 대물 광학 현미경에 의해 15 분마다 한번 촬영 하였다. 형광 리포터 분석을 위해, 이미지는 60X 대물 오일과 형광 현미경에 의해 15 분마다 한번 촬영 하였다. </li></ol>

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	<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Polymenis, M., Kennedy, B. 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Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+of+the+yeast+G1/S+switch.">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

PDMS의 장치는 갓해야합니다. 그렇지 않으면, 장치에 관을 삽입함으로써 발생되는 기포를 제거하는 것이 어려울 것이다. 단계 3.4 세포를 집중하여 셀 로딩 효율을 개선하는 것이 중요하다. 실험의 처리량을 증가시키기 위해 동일한 PDMS 칩 4~6 모듈을 독립적으로 작동하는 펌프는 전형적으로 동시에 4~6 다른 실험 (상이한 균주 또는 미디어 조성물)을 수행하는 데 사용하기 위해 연결된다. <p class="j...

효모 신진 것은 노화 연구에서 강력한 모델 생물이다. 그러나 효모에서 기존의 수명 분석뿐만 아니라 노동 집약적뿐만 아니라 낮은 처리량 1, 2 인 미세 절제에 의존한다. 그들은 나이 또한, 기존의 미세 절제 방식은 하나의 어머니 세포에서 다양한 세포 및 분자 기능의 상세보기를 제공하지 않습니다. 미세 유체 장치의 개발은 효모 수명을 측정 할뿐만 아니라, 마더 셀 3, 4, 5, 6, 7, 8의 수명에 걸쳐 분자 마커 및 다양한 세포 표현형을 수행하는 자동화 된 방법을 사용할 수있다. 효모 세포는 미세 유동 장치에로드 된 후, 이들은 자동 시간 바퀴를 사용하여 현미경으로 추적 될 수있다전자 영상. 프로세싱 툴을 묘화의 도움으로, 다양한 세포 및 분자 표현형은 3 추출 할 수있다 (6)하여 얻는 것이 곤란 또는 불가능 이는 많은 등 수명, 크기, 형광 리포터 세포 형태학, 세포주기 역학 포함 8 기존의 미세 절제 방법. 미세 유체 장치는 몇 년 전 3, 4, 6, 7 성공적인 개발 이후 효모 노화 연구에 명성을 얻고있다. 몇몇 그룹은 이후에 이전 디자인 (5)의 변동에 게시 한 많은 효모 연구소는 연구를 위해 마이크로 유체 장치를 채택했다. 기하 급수적 인 성장을받은 세포 배양에서 관찰에 사용할 수있는 세 어머니 세포의 수는 miniscu입니다르. 따라서, 수명 측정을위한 마이크로 유체 장치의 일반적인 디자인 원칙은 어머니 세포를 유지하고 딸 세포를 제거하는 것입니다. 하나는 이러한 디자인은 효모는 비대칭 세포 분열을 겪는다는 사실을 사용한다. 다음은 장치 의지 트랩 큰 어머니 세포의 구조와 허용 작은 딸 세포가 씻겨합니다. 이 문서에서 설명하는 미세 유체 칩은 트랩 모 세포 연질 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 패드 (매달린 수직 열) (도 1)를 사용한다. 비슷한 디자인의 장치는 이전에 3, 4, 6, 7보고되었다. 이 프로토콜은 마이크로 유체 장치 및 저속 촬상 실험 최적화되어 직접적인 셀 로딩 방법을 제조하는 간단한 방법을 사용한다. 미세 유동 장치의 주요 매개 변수의 하나는 트랩 모 세포에 사용되는 PDMS 패드의 폭이다. 우리의 Device는 수명 전반에 걸쳐 추적 할 수 있습니다 신선한 어머니 세포의 상당 부분을 포함하여 각 패드에서 더 어머니 세포를 유지할 수 있습니다 넓은 패드를 사용합니다. 세포는 여러 세대하거나 전체 수명에 걸쳐 관찰이 필요 대해 추적 될 필요가있을 때 수명 측정에 더하여,이 프로토콜은 단일 세포 타임 랩스 영상 실험에 유용하다.

<table><tbody><tr><td>3&#039;&#039; &amp;lt;111&gt; silicon wafer</td><td>Addison Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 and 3000 Series</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&amp;reg; 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>Include Sylgard&amp;reg; silicone elastomer base and curing agent</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-core&amp;trade; punch (I.D. 0.75 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002513</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&amp;reg; cover glass</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>3M Scotch Tape</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&amp;reg; Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Pure Ethanol, Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster&amp;trade;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>5 mL BD Syringe (Luer-Lock&amp;trade; Tip)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028)</td><td>Component Supply Company</td><td>SWTT-22</td><td></td></tr><tr><td>Needle Assortment</td><td>Component Supply Company</td><td>NEKIT-1</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>HACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>Lab Oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>Longerpump</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

실험 후, 균체 많은 세포와 분자 표현형의 수명은 녹화 시간 경과 화상으로부터 추출 할 수있다. 각 셀로부터 추출 될 수있는 다른 다양한 기능이 있기 때문에, 분석의 제 1 단계는, 위치 및 셀 경계 추적되고 각종 이벤트의 타이밍을 포함하는 세포 및 이벤트를 주석 등이다 신진 이벤트와 같은. 이러한 주석은 쉽게 미래에 다양한 기능을 세포의 동일한 세트로 복귀하고 분?...

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Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

이 문서에서는 마이크로 유체 칩의 생산과 수명 및 단일 효모 세포의 세포 표현형을 측정하는 미세 유체 실험의 설정에 최적화 된 프로토콜을 제공한다.

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

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Research

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7.7K 조회수.  Peking University.  이 문서에서는 마이크로 유체 칩의 생산과 수명 및 단일 효모 세포의 세포 표현형을 측정하는 미세 유체 실험의 설정에 최적화 된 프로토콜을 제공한다. 

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A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

여러 고유 긴장 유학을위한 마이크로 유체 장치

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

연구

생체공학

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

증식하는 연속 고해상도 현미경으로 관찰 신진 효모의 노화

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 Quantifying

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

생물학

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors contribute to alterations in the normal aging process. These factors intersect in complex ways, as evidenced by the wealth of documented links identified and conserved in many organisms. Most of these studies focus on loss-of-function, null mutants that allow for rapid screening of many genes simultaneously. There is much less work that focuses on characterizing the role that overexpression of a gene in this process. In the present work, we present a straightforward methodology to identify and clone genes in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, for study in suppression of the short-lived chronological lifespan phenotype seen in many genetic backgrounds. This protocol is designed to be accessible to researchers from a wide variety of backgrounds and at various academic stages. The SIR2 gene, which codes for a histone deacetylase, was selected for cloning in the pRS315 vector, as there have been conflicting reports on its effect on the chronological lifespan. SIR2 also plays a role in autophagy, which results when disrupted via the deletion of several genes, including the transcription factor ATG1. As a proof of principle, we clone the SIR2 gene to perform a suppressor screen on the shortened lifespan phenotype characteristic of the autophagy deficient atg1&#916; mutant and compare it to an otherwise isogenic, wild type genetic background.

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

Here is a protocol to identify genetic interactions through an increased copy number suppressor screen in Saccharomyces cerevisiae. This method allows researchers to identify, clone, and test suppressors in short-lived yeast mutants. We test the effect of the copy number increase of SIR2 on lifespan in an autophagy null mutant.

사카로미세스 cerevisiae에서 연대 수명을 조절하는 유전 링크의 특성화를 위한 억제기 스크린

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors ...

유전학

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

를 사용하여 연령에 의존 게놈의 불안정성 유학 S. cerevisiae 연대기 수명 모델

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 ​​대규모 방법

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

여러 고유 긴장 유학을위한 마이크로 유체 장치

증식하는 연속 고해상도 현미경으로 관찰 신진 효모의 노화

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 Quantifying

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

사카로미세스 cerevisiae에서 연대 수명을 조절하는 유전 링크의 특성화를 위한 억제기 스크린

를 사용하여 연령에 의존 게놈의 불안정성 유학 S. cerevisiae 연대기 수명 모델

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 대규모 방법

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

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Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 Quantifying

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ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 ​​대규모 방법

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