다운스트림 순환 프리 DNA 응용을 위한 표준화된 액체 생검 사전 분석 프로토콜

이것은 순환하는 자유 DNA를 기반으로 하는 다운스트림 액체 생검 애플리케이션을 위한 혈액 샘플의 처리 및 저장을 위한 표준 프로토콜입니다. 이 기술은 몇 년 동안 사용되어 왔지만 이것은 출판 된 최초의 표준 프로토콜입니다. 대부분의 중개 또는 과학 실험실에서 사용할 수 있는 표준 장비로 쉽게 따를 수 있습니다.

프로토콜은 모든 실험실 직원이 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 샘플을 수집하고 저장하는 방법을 표준화하는 데 도움이되며, 이는 궁극적으로 클리닉에 영향을 미치고 정밀도가 가장 중요한 동일하거나 유사한 다운 스트림 분석을 수행하는 여러 센터 간의 변동성을 줄입니다. 이 방법은 종양학 연구 및 임상 응용 분야에서 특히 유용합니다.

그러나 액체 생검이 사용되는 다른 비암 질환에도 적용될 수 있습니다. 혈액 샘플을 원심분리한 후 제거할 혈장이나 혈청의 양을 아는 것은 어려울 수 있지만 이 특정 지침을 따르면 도움이 됩니다. 나머지 프로토콜은 실험실에서의 제한된 경험으로 따르기가 매우 쉽습니다.

절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자 인 호르헤 (Jorge)가 될 것입니다. 시작하려면 신선한 혈액이 들어있는 튜브를 실온에서 1600 회 g에서 10 분 동안 원심 분리하고 최대 휴식을 취하십시오. 원심 분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하십시오.

혈청 상청액의 상부 단계는 투명하고 황색을 띠게됩니다. 샘플에 용혈 징후가 있는지 확인하고 적절한 경우 용혈 유무를 기록합니다. Class II 생물안전 캐비닛에서 혈청을 250마이크로리터 분취량으로 수집 튜브로 옮깁니다.

부분 표본에는 올바르게 레이블이 지정되어야 합니다. 즉시 혈청을 섭씨 영하 80도에서 보관 상자에 똑바로 얼리고 샘플 보관 시간을 기록합니다. 샘플이 필요한 4시간 내에 처리되었는지 확인합니다.

EDTA 튜브를 실온에서 1600회 g에서 10분 동안 원심분리하고 최대 브레이크를 적용합니다. 원심분리 후, 혈장 상청액은 투명하고 황색을 띠게 될 것이다. 샘플에 용혈 징후가 있는지 확인하고 일회용 혈청 피펫을 사용하여 세포층을 방해하지 않고 혈장을 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

세포층 위에 약 5 밀리미터의 작은 잔류 혈장 부피를 남겨 둡니다. 용혈이 관찰되면 추가 분석을 위해 샘플을 폐기하십시오. 혈장을 원심분리 및 15-밀리리터 원심분리 튜브로 원심분리하여 제1 원심분리 단계로부터 이월된 임의의 잔류된 온전한 혈액 세포를 제거한다.

튜브 바닥의 셀 펠릿이 아닌 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하고 일회용 혈청학적 피펫을 사용하여 1-4밀리리터의 혈장을 1-4밀리리터의 폴리프로필렌 극저온 바이오스 또는 Eppendorfs로 옮깁니다. 혈장이 혈액 세포로 오염되는 것을 피하기 위해 튜브 바닥에 잔류량의 혈장을 남겨 두어야합니다. 즉시 저장 상자에 플라즈마를 섭씨 영하 80도에서 똑바로 얼리고 샘플 보관 시간을 기록합니다.

샘플에 레이블이 올바르게 지정되고 필요한 4시간 내에 처리되었는지 확인합니다. P1000을 사용하여 세포층을 수집하고 여과 된 팁을 2 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 즉시 냉동하여 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

다운스트림 애플리케이션에 사용할 수 있는 고품질 cfDNA 추출의 예가 여기에 나와 있는 반면, 이 그래픽 이미지는 게놈 오염 수준이 높은 부적합한 샘플의 예를 나타냅니다. 혈장 또는 혈청 분획은 노란색이어야합니다. 이는 개별 샘플에 따라 다를 수 있습니다.

용혈 된 샘플은 폐기해야합니다. 혈장 분획을 제거할 때 세포 펠릿을 제거하지 않도록 주의하십시오. 이 프로토콜은 면역 검출 기술을 사용하여 혈청 및 혈장 샘플에서 비코딩 RNA 또는 단백질의 검출과 같은 다른 핵산 기반 및 단백질 애플리케이션에도 사용할 수 있습니다.

이것은 많은 실험실에서 사용되는 매우 표준적인 기술입니다. 이 프로토콜은 연구자가 분석을 수행하는 방법을 표준화하는 데 도움이 되며, 이는 향후 임상 응용 분야에 필요한 중요한 측면입니다.