우리의 프로토콜은 마우스 조직에서 자가 식 및 족피 활동의 속도를 측정 할 수 있으며 이러한 활동 내에서 circadian 변화를 감지 할 만큼 민감합니다. 이 기술은 세포와 조직에서 단백질 이화작용을 평가하기 위하여 생체 내에서 이용될 수 있고 필요한 물질은 상대적으로 낮은 기술이고 어떤 분자 생물학 실험실든지에 접근하기 쉽습니다. 절차를 시연하는 것은 미하일 Ryzhikov, 내 실험실에서 포스트 닥터가 될 것입니다.
각 시간 시간 전에 15분 동안 leupeptin 및 bortezomib 스톡 솔루션을 실온으로 데우고 멸균 PBS의 해동 된 bortezomib을 희석하여 밀리리터 작업 용액당 50 밀리그램을 산출하십시오. 프로테아제 억제제 투여의 경우, 각 실험 동물에 1킬로그램당 40밀리그램 또는 1.6 마이크로그램의 루페프틴을 주입합니다. 부정적인 제어를 위해, PBS의 0.5 밀리리터와 마우스를 주입.
각 마우스를 주입된 처리의 모형에 의해 그룹화된 케이지로 돌려보내고 마우스가 표준화된 표에서 처리되거나 조작되는 시간을 기록합니다. 주입 후 2시간 후, 얼음에 15밀리리터 원추형 튜브를 적절히 라벨으로 붙인 7밀리리터의 얼음 냉균질화 완충제에서 각 희생된 실험동물로부터 수확된 좌간 엽을 침수한다. 모든 시료를 획득하면, 첫 번째 샘플과 전체 균질화 버퍼를 15 밀리리터 용량 Dounce 균질화로 옮기고 10스트로크의 느슨한 피스톤과 15개의 타이트한 피스톤스트로크로 샘플을 균질화한다.
결과 된 원유 균질화를 원래 튜브로 되돌리고 방금 입증 된 대로 다음 샘플을 균질화하십시오. 모든 시료가 균질화되었을 때, 퇴적물 동형 핵과 파편원심분리에 의한 핵과 파편을 원심분리하고 핵 후 상류체의 상위 4개 밀리리터를 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮긴다. 표준 프로토콜에 따라 이 첫 번째 상체 분획의 단백질 농도를 결정하고 필요에 따라 모든 시료의 농도를 밀리리터당 2.1 밀리그램으로 균질화합니다.
다운스트림 분석 및 품질 개선을 위해 정규화된 총 단백질 분획의 500마이크로리터를 영하 80도 의 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 제공합니다. 개별 미세 원심 분리 튜브로 나머지 총 단백질 분획의 각각 1.5 밀리리터를 전달하고 원심분리에 의한 단백질 샘플을 펠릿으로 옮긴다. 결과 두 번째 분획 수퍼나티의 1밀리리터를 얼음에 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기고 나머지 슈퍼나티를 흡인시합니다.
세척당 신선한 냉균질화 버퍼 1.5 밀리리터에서 3K 펠릿을 두 번 세척한 다음 SDS-PAGE 샘플 버퍼 200 마이크로리터에서 3K 펠릿을 다시 중단하고 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다. 20, 000 x g 및 섭씨 4도에서 20 분 동안 두 번째 분수 슈퍼 네이너티드를 회전시키고 결과 세 번째 세포질 분획 슈퍼나티를 새로운 미세 센트심분리기 튜브로 옮긴다. SDS-PAGE 분석을 위해 세포질 분획의 150마이크로리터를 4x SDS-PAGE 샘플 버퍼 50마이크로리터와 결합하고 세포질 분수 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다.
20K 펠릿에서 남은 상체를 흡인하고 세척당 신선한 냉동균화 버퍼 1.5 밀리리터로 샘플을 두 번 세척합니다. 그런 다음 SDS-PAGE 샘플 버퍼 100마이크로리터에서 20K 펠릿을 5분 동안 섭씨 95도에서 끓여보세요. 서부 블롯 분석을 위해, 표준 곡선 단백질을 1x 샘플 버퍼에서 1~3개씩 연속적으로 희석하여 총 6개의 희석제에 대해, 각 표준 곡선 샘플의 10마이크로리터를 26웰 중 1개의 SDS-PAGE 미디 젤로 로드한 다음, 선행 상용 분자량 표준을 로드합니다.
자가플럭스를 측정하려면 각 3K 펠릿 샘플의 12마이크로리터를 적절한 우물에 적재합니다. 프로테소피플록을 측정하려면 각 세포질 분획의 12마이크로리터를 적절한 우물에 적재합니다. 모든 제어 및 실험 샘플이 적재되었을 때, 표준 프로토콜에 따라 폴리 비닐리덴 불소 막으로 단백질을 전송하기 전에 SDS-PAGE에 의해 단백질 샘플을 분리한다.
거시토파지 플럭스를 분석하기 위해, 항p62 또는 항 LcB 항체를 함유한 3K 펠릿 샘플을 포함하는 블로트 멤브레인이 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 있다. 프로테소말 플럭스를 분석하기 위해, 항 리신 48 특이폴리 유비퀴틴 항체를 함유한 세포질 분획 시료를 함유한 블로트 멤브레인은 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 있다. 그런 다음 표준 이차 항체 및 이미징 장치를 사용하여 서부 블롯을 이미지화합니다.
표준 곡선과 실험 샘플 모두에 대한 관심 있는 대역에서 밀도 측정을 수행하려면 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 열고 멤브레인의 맨 위로 확장되는 블롯 이미지의 하단에 관심 있는 단백질 단조량을 포함하는 긴 사각형을 그립니다. 복사하여 붙여넣기하여 사각형을 나머지 샘플로 이동하여 사각형을 샘플 간에 일관되게 유지합니다. 정량화를 스프레드시트에 저장하고 선형 또는 다항회귀에서 직렬 희석된 표준 샘플을 사용하여 스프레드시트 내에서 밀도 표준 곡선을 생성하여 가장 적합한 표준 곡선 방정식을 얻습니다.
이 방정식을 사용하여 실험 샘플 내에서 관심 있는 단량의 양을 추정합니다. 플럭스 측정을 얻으려면 PBS 샘플의 평균 값에서 처리된 각 억제제 샘플의 추정 단백질 양을 동일한 시점에서 빼는다. 그런 다음 단방향 ANOVA를 사용하여 단백질 회전율에 있는 측두변의 통계적 유의를 평가합니다.
주어진 시점에서 자가식 플럭스를 위한 1차 판독은 리소좀 농축 된 3K 펠릿 분획에서 샴 샘플대 처리된 류페틴 사이의 대식체식파지 특이적 마커의 양에 차이가 있다. 일반적으로 결과는 독립적인 실험 전반에 걸쳐 비교를 단순화하는 평균으로 정규화됩니다. 프로테올리틱 플럭스를 측정하는 당사의 절차는 시간 의존적인 과정인 자가식 및 프로테아솜 기판의 축적을 일으키는 leupeptin 또는 bortezomib의 능력에 달려 있습니다.
이 기술은 생물학적 리듬이 간 단백질 이화증을 어떻게 프로그래밍하는지에 대한 탐구를 허용했습니다. 우리는 그것이 세포 가사 기능에 질병의 효력을 조사하기위한 길을 열어 줄 수 있기를 바랍니다.
