0. 우리의 프로토콜은 분화 과정과 기능의 기초가 되는 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 시험관 내에서 파골세포를 생성하는 최적화되고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 단 일주일 만에 많은 수의 기능적으로 활동적인 파골 세포를 생성 할 수 있다는 것입니다. 높은 분화 수율은 정제된 단핵구를 사용하고 제때에 사이토카인을 첨가함으로써 달성됩니다.
파골세포는 모든 형태의 관절염에서 뼈 파괴를 담당하며, 이 방법은 분화 및/또는 기능을 조절할 수 있는 새로운 치료 화합물을 스크리닝하는 도구를 제공합니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 박사 과정 학생 인 Patricia Riedlova가 될 것입니다. 시작하려면 혈액을 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮겨 PBMC를 분리하십시오.
신선한 혈액의 경우 동일한 부피의 멸균 PBS로 희석하거나 백혈구 원뿔과 버피 코트의 경우 1:3 비율로 희석합니다. 반전으로 혈액을 부드럽게 섞는다. 3 밀리리터의 밀도 구배 배지가 들어있는 15 밀리리터 튜브를 준비하고 밀도 구배 배지 위에 8-10 밀리리터의 희석 된 혈액을 천천히 겹쳐서 혼합을 피하십시오.
브레이크 없이 실온에서 30분 동안 튜브를 400 x g로 원심분리합니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫으로 상단 층을 조심스럽게 버립니다. PBMC를 포함하는 아래의 간기 층을 수집하고 이 층을 새로운 50밀리리터 튜브로 옮깁니다.
세포를 멸균 PBS로 최대 50-밀리리터까지 현탁시키고, 완전 브레이크를 이용하여 실온에서 10분 동안 300 x g에서 원심분리함으로써 잔류 밀도 구배 배지를 세척하였다. 잔류 혈소판을 제거하려면 원고에 설명된 대로 원심분리 과정을 반복하고 분리 및 정제된 PBMC를 20밀리리터의 PBS에 재현탁하고 표준 방법에 따라 혈구계를 사용하여 계수합니다. CD14+단핵구를 풍부하게 하려면 1 x 10을 7번째 PBMC에 적절한 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮기고 세포를 300 x g에서 5분 동안 펠릿화합니다.
상층액을 버리고 세포 펠릿을 세포 분리 완충액에 재현탁한 후, 뚜껑을 덮은 상태에서 100마이크로리터당 10마이크로리터의 항체 칵테일로 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 100 마이크로 리터 당 10 마이크로 리터의 자성 나노 입자 비드를 추가하고 뚜껑을 덮은 상태에서 3 분 동안 배양합니다. 세포 분리 완충액으로 부피를 2.5 밀리리터까지 보충하십시오.
튜브를 자석에 넣고 뚜껑을 연 상태에서 3분 동안 배양합니다. 이제 튜브가 여전히 자석에 있는 동안 반전에 의한 한 번의 연속 이동으로 음의 세포 집단을 버립니다. 자석에서 튜브를 제거하고 자성 비드에 부착된 농축 CD14+단핵구를 세포 현탁액 완충액 2.5밀리리터에 재현탁하여 세척하고 튜브를 다시 자석에 넣습니다.
앞에서 설명한 대로 분리된 세포의 수를 계산합니다. 수집된 세포를 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버린 후, 10% FBS를 갖는 완전한 알파 최소 필수 배지에서 밀리리터당 100만 개의 세포로 세포를 재현탁한다.
파골 세포를 분화시키기 위해 M-CSF를 밀리리터 당 25 나노 그램의 최종 농도로 세포 현탁액에 첨가하고 피펫 팅으로 완전히 혼합하여 세포 현탁액을 균질화합니다. 플레이트를 100 마이크로리터의 현탁액을 플랫 바닥 96-웰 플레이트에 웰 당 편평하게 한다. 다음으로, 배양 시스템에서 배지 증발 및 가장자리 효과를 방지하기 위해 도양된 세포 주위에 웰당 200마이크로리터의 멸균 증류수를 추가합니다.
5% 이산화탄소로 섭씨 37도에서 약 18-20시간 동안 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. M-CSF 및 RANK 리간드로 보충된 신선한 배지를 준비합니다. 배양 후 P200 피펫을 사용하여 흡인하여 배지의 절반을 조심스럽게 제거하고 M-CSF 및 RANK 리간드가 보충된 신선하고 따뜻하고 완전한 배지로 교체하고 최종 농도는 밀리리터당 25나노그램입니다.
세포를 7-14 일 동안 파골 세포로 분화시키고 3 일마다 배지를 완전히 교체하십시오. 배지를 제거한 후, 분화된 부착성 파골세포를 준비된 고정액의 웰당 100마이크로리터로 고정하고, 1분 동안 배양한다. 부착 세포가 긁히지 않도록 웰 바닥을 만지지 마십시오.
웰을 300 마이크로 리터의 멸균 증류수로 3 회 세척 한 후 플레이트를 두드려 건조시키고 새로 준비된 염색 용액 100 마이크로 리터를 각 웰에 첨가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 어둠 속에서 20분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 염색 용액을 반전으로 제거하고, 플레이트를 웰당 300-마이크로리터의 증류수로 3회 세척한다.
종이 타월에 접시를 두드려 여분의 물을 제거하고 접시를 열어 두고 밤새 가벼운 건조로부터 보호합니다. 타일 옵션이 있는 명시야 현미경을 사용하여 10x 또는 20x로 이미지를 촬영하여 전체 웰 표면을 캡처합니다. 세포 계수기 플러그인이 있는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 3개 이상의 핵을 가진 TRAP+보라색 염색 세포로 식별된 파골세포를 수동으로 계산합니다.
1 x 10의 세포 밀도에서 웰당 5번째 세포까지 18웰 챔버 슬라이드에서 분리된 CD14+단핵구의 100마이크로리터를 웰당 플레이트합니다. 앞서 입증된 바와 같이 M-CSF 및 RANK 리간드가 있는 상태에서 3일마다 배지를 완전히 교체하여 파골세포를 분화합니다. 종료 시점에서, 배지를 부드럽게 제거하고, pH 7.4에서 예열된 PBS의 200 마이크로리터로 각 웰을 2회 세척한다.
계단 사이에 우물을 말리지 마십시오. PBS에 4% 포름알데히드 용액의 웰당 100마이크로리터로 샘플을 고정하고 부드럽게 흔들면서 궤도 셰이커에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS의 웰당 200-마이크로리터로 2회 세척한다.
PBS에 희석된 0.1%Triton x-100 용액의 웰당 100마이크로리터로 세포를 투과화하고 앞서 표시된 대로 10분 동안 배양합니다. PBS의 웰당 200 마이크로 리터로 두 번 세척하십시오. 비특이적 결합을 차단하고 신호를 증가시키려면 2% 소 혈청 알부민과 PBS 용액으로 만든 차단 용액 100마이크로리터를 추가합니다.
부드럽게 흔들면서 궤도 셰이커에서 실온에서 20분 동안 배양합니다. 차단 용액을 제거한 후 2% BSA/PBS 용액에 희석한 형광 공액 팔로이딘 용액 100마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. PBS의 웰당 200 마이크로 리터로 두 번 세척하십시오.
300 나노몰 DAPI를 함유하는 PBS의 용액의 웰당 100마이크로리터로 핵을 염색한다. 10 내지 15분 후에, DAPI 용액을 제거하고, 이를 웰당 100-마이크로리터-PBS로 교체한다. 적절한 면역형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 4-40x에서 염색을 시각화합니다.
성숙한 파골세포는 TRAP+다중 핵 세포로 정의됩니다. RANK 리간드의 추가는 용량 의존적 방식으로 증가하는 수의 큰 TRAP+다핵 파골세포를 생성했습니다. 단핵구로부터 파골세포 분화의 동역학을 2일 내지 14일의 배양 기간에 걸쳐 조사하였다.
다핵 파골세포는 5일째부터 관찰되었으며 7일째에 최적의 분화에 도달했습니다. 광물화 된 표면으로의 파골 세포의 분화는 둥근 구멍 또는 흡수 구덩이의 형성을 분석하여 흡수 활성을 평가할 수 있습니다. 흡수율은 M-CSF 단독과 비교할 때 M-CSF 및 RANK 리간드가 있는 경우 유의하게 증가합니다.
또한, 로테논을 사용한 처리는 용량 의존적으로 처리되지 않은 대조군과 비교하여 미네랄화된 표면의 재흡수를 잘 억제하였다. 파골세포 흡수의 로테논 의존성 억제는 ATP 생산의 억제와 관련이 있었다. 성숙한 OCS의 RANK 리간드 유래 액틴 고리의 단편화가 로테논의 존재 하에서 관찰되었다.
농축 된 단핵구가 혈소판을 포함하지 않는지, 세포가 올바른 밀도로 도금되는지, 가장자리 효과를 피하기 위해 주변 우물이 물로 채워져 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 파골세포가 어떻게 형성되는지, 그리고 기초 과학과 번역 과학 모두에서 파골세포의 기능에 영향을 미치는 요인을 기계적으로 조사하는 데 특히 유용합니다. 예를 들어, 이러한 과정을 조절할 수 있는 화합물이나 단백질을 사용합니다.
