이 프로토콜은 임상 또는 환경 샘플의 감염 가능성을 알릴 수 있는 감지 분자를 얻기 위해 감염성 바이러스와 비감염성 바이러스를 구별할 수 있는 DNA 앱타머를 선택하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 바이러스의 구조나 서열에 대한 사전 지식이 필요하지 않기 때문에 신종 바이러스를 포함한 다른 많은 바이러스에 대한 선택적 앱타머를 얻는 데 적용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 감염성 바이러스의 임상 진단 및 환경 모니터링을 위한 앱타머 센서를 개발하여 누군가가 전염성이 있는지 또는 환경 소독 방법이 의도한 대로 작동하는지 감지할 수 있습니다.
선택은 특히 처음 접하는 사람들에게 어려운 과정이 될 수 있습니다. PCR 조건을 최적화하고 qPCR로 선택 진행 상황을 모니터링하는 것이 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생 인 Marcos Gramajo가 될 것입니다.
시작하려면 초기 단일 가닥 또는 SS-DNA 라이브러리와 프라이머를 설계합니다. 표준 탈염 정제를 통해 상업적 공급원으로부터 DNA 올리고를 얻는다. SS-DNA 라이브러리와 프라이머를 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 정제한 후 에탄올을 침전시킵니다.
다음으로, 감염성 및 비 감염성 바이러스의 원액을 얻거나 텍스트 원고에 설명 된대로 준비하십시오. SS-DNA 라이브러리의 변성을 위해 10마이크로리터의 100마이크로몰 SS-DNA 라이브러리와 240마이크로리터의 SELEX 완충액을 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 95도에서 건조한 욕조에서 15 분 동안 가열 한 다음 튜브를 얼음 위에 15 분 동안 놓습니다.
양성 선택을 위해 SELEX 버퍼에 250마이크로리터의 SS-DNA 라이브러리를 50마이크로리터의 감염성 바이러스와 혼합합니다. 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오. 그런 다음 0.5 밀리리터 필터에 1 밀리몰 T20 시퀀스 400 마이크로 리터를 추가하여 비특이적 부위를 차단합니다.
필터를 30분 동안 배양합니다. 필터를 14, 000 G에서 10분 동안 원심분리하여 T20 용액을 제거한다. 그런 다음 필터를 SELEX 버퍼로 세 번 세척하여 과도한 T20 서열을 제거합니다.
다음으로, SS-DNA 라이브러리 감염성 바이러스 혼합물을 차단된 100 킬로달톤 필터 및 원심분리기에 첨가하여 결합되지 않은 서열을 세척한다. 400 마이크로 리터의 SELEX 버퍼를 추가하고 원심 분리하여 필터를 세 번 세척하십시오. 필터에 분획을 유지하고 플로우 스루를 버립니다.
결합된 시퀀스를 용리하려면 원심분리기 필터의 수집 튜브를 교체하고 8몰 요소가 포함된 SELEX 버퍼 300마이크로리터를 필터에 추가합니다. 필터를 섭씨 95도에서 15분 동안 가열한 다음 원심분리하여 용출된 서열이 포함된 플로우 스루를 수집합니다. 완료되면 10% 표백제로 재료를 씻으십시오.
다음으로, 이전 단계에서 수집 한 SS-DNA 감염성 바이러스 용액을 차단 된 10 킬로 달톤 필터에 첨가하고, 14, 000 G에서 15 분 동안 원심 분리하고 플로우 스루를 버린다. 필터를 300 마이크로 리터의 SELEX 완충액으로 세 번 세척하여 원심 분리로 요소를 제거하고 플로우 스루를 버립니다. 깨끗한 수집 튜브에서 거꾸로 뒤집고 5분 동안 원심분리하여 필터의 용액을 회수합니다.
피펫을 사용하여 회수된 용액의 최종 부피를 측정하고 Round 1A 샘플로 라벨을 붙입니다. 1차 라운드에서 라운드 1A 샘플의 90%를 템플릿으로 사용하고 최적화된 조건으로 PCR을 실행합니다. 스트렙타비딘 변형 마그네틱 비드 또는 MB를 사용하여 SS-DNA를 회수하려면 제품을 50마이크로리터 분취량으로 분할하고 50마이크로리터 MB가 들어 있는 미세원심분리기 튜브에 추가합니다. 실온에서 온화한 교반으로 튜브를 30분 동안 배양합니다.
그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 올려 MB를 분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거합니다. 튜브에 200 마이크로 리터의 바인딩 및 세척 버퍼를 추가하여 MB를 두 번 세척하십시오. 그런 다음 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 피펫팅을 통해 MB를 균질한 용액으로 다시 일시 중단하기 전에 두드립니다.
튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓고 상층액을 제거합니다. 두 번째 세척 후 MB를 100마이크로리터의 SELEX 완충액에 재현탁하고 용액을 섭씨 95도에서 10분 동안 가열합니다. 즉시 튜브를 마그네틱 랙에 넣고 SS-DNA 풀이 들어 있는 상층액을 수집합니다.
이 복구 단계를 반복하여 50 마이크로 리터의 SELEX 버퍼를 추가합니다. 회수된 분획의 최종 부피를 측정하고 Round 1X로 표시합니다. SS-DNA 풀의 변성을 위해 Round 1X 샘플의 60%를 취하여 50마이크로리터의 SELEX 완충액과 혼합합니다.
건조한 수조에서 샘플을 가열한 다음 튜브를 얼음 위에 15분 동안 놓습니다. 다음으로, 반대 선택 단계로서 SELEX 완충액에 변성된 SS-DNA 풀을 각 바이러스 50 마이크로리터와 혼합하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 원심분리 필터에서 비특이적 부위를 차단한 후, 바이러스 용액과 함께 인큐베이션된 변성된 SS-DNA 풀을 차단된 100 킬로달톤 필터에 첨가한다.
필터를 14, 000 G에서 10 분 동안 원심 분리하고 플로우 스루를 수집하십시오. 300 마이크로 리터의 분획을 취하여 밀리 리터 당 1 억 개의 카피를 함유 한 50 마이크로 리터의 감염성 바이러스와 혼합하십시오. 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
텍스트에 설명된 대로 표준 qPCR 마스터 믹스 및 정제된 SS-DNA 라이브러리의 희석액을 준비합니다. qPCR을 실행하여 임계값 주기를 결정합니다. 실행 후 표준 곡선을 사용하여 라운드 1A 및 라운드 1X에서 SS-DNA의 양을 정량화합니다.
그런 다음 결합된 DNA 양을 초기 DNA 양으로 나눈 값으로 용리 수율을 계산하고 용출 수율 대 반올림 수를 플로팅합니다. 마지막으로, 서로 다른 라운드에 대한 용융 곡선을 플로팅합니다. 고처리량 염기서열 분석을 위해서는 상업적으로 이용 가능한 적절한 키트를 선택하십시오.
높음, 중간 및 낮음 보강을 나타내는 선택 라운드의 여러 풀과 각 풀의 어댑터에서 서로 다른 인덱스 쌍을 사용하여 최종 풀을 준비합니다. 그런 다음 준비된 최종 라이브러리를 시퀀싱 시설로 보냅니다. 염기서열 분석을 위해 염기서열은 시퀀싱 시설에 의해 역다중화되었습니다.
명령행 프로그램 Cutadapt를 사용하여 시퀀싱 어댑터 및 선택 프라이머를 제거하십시오. 그런 다음 FASTX-Toolkit 프로그램을 사용하여 저품질 시퀀스를 제거합니다. 그런 다음 역방향 파일의 FASTX-Toolkit FASTX_reverse_ 보수 기능을 사용하여 역방향의 시퀀스 파일을 정방향의 시퀀스 파일과 병합합니다.
그런 다음 내장된 CAT 프로그램을 사용하여 파일을 단일 파일로 병합합니다. FASTAptamer 분석 툴킷을 사용하여 다양한 선택 풀에서 염기서열의 강화를 분석할 수 있습니다. 먼저, FASTAptamer 카운트 및 FASTAptamer 클러스터 함수를 사용하여 유사한 시퀀스를 클러스터로 그룹화합니다.
다음으로, FASTAptamer 보강 함수를 사용하여 시퀀스와 군집의 보강에 대한 정보를 가져옵니다. 서열 분석을 통해 얻은 농축 정보로부터 후보 앱타머 서열을 식별합니다. 여러 압타머 서열을 선택하고 결합 분석을 사용하여 초기 스크리닝을 수행합니다.
이 분석에서 qPCR을 사용하여 감염성 SARS-CoV-2 특이적 압타머의 SELEX 진행을 모니터링했습니다. 용출 수율은 처음에 SELEX의 각 라운드마다 증가했으며 8 라운드와 9 라운드에서 평준화되었습니다. 용융 곡선을 비교함으로써, 섭씨 77도에서 79도까지의 높은 용융 온도에서 피크로부터의 이동이 관찰되었다.
또한, 마지막 두 라운드에서 낮은 용융 온도에서의 피크가 관찰되었습니다. 연속 선택 라운드에서 얻은 순차적 SARS2 AR10에 대한 백만당 판독 수의 상대적 풍부도가 표시됩니다. SARS2 AR10의 예측된 구조는 바이러스 인식에 관여할 수 있는 줄기 루프 영역을 포함하는 구조화된 2차 구조를 보여주었습니다.
앱타머가 확보되면 또 다른 유형의 센서인 전기 광학 장치에 통합되어 바이러스 감염성을 알릴 수 있는 포털 및 신속한 바이러스 검출 테스트를 개발할 수 있습니다. 다양한 변종 또는 고정관념의 바이러스에 특이적인 앱타머를 확보할 수 있어 사회에 가장 큰 위협이 되는 변종을 신속하게 모니터링할 수 있을 것으로 기대하고 있습니다.
