저자는 데이비드 란 게 나 우 수족관 공간; 아낌없이 제공 감사 하 고 싶습니다. 에릭 스톤, 존 C. 무어와 진 탕에 대 한 여기에 사용 된 zebrafish 스트레인 조달에 대 한 레너드 Zon의 연구소에서 zebrafish 유지 보수 및 시 약, 및 앤 로버트 슨와 엘리엇 Hagedorn 도움이. 그들은 또한 옥 타 비오 Hurtado photolithographic 기술에 대 한 조언을 감사 하 고 싶습니다. FE는 어린이 미국 호주 협회 위한 Shriner의 병원에서 동호회에 의해 투자 되었다. 이 작품은 NIH에 의해 투자 되었다 GM92804를 부여.

애벌레의 microinjection 프로토콜 2011N000127에서 매사 추세 츠 종합 병원 분과 연구 동물 관리에 의해 승인 되었다.
1. 장치 제조
참고: 모든 컴퓨터 보조 그리기 (CAD) 파일 여기에서 설명 하는 사진 평판 마스크를 디자인 하는 데 사용 (그림 1) 다운로드를 위해 사용할 수 있습니다. 링크 테이블의 자료를 참조 하십시오.
<ol><li>표준 photolithographic 기법7를 사용 하 여 클래스 1000 클린 룸에 마스터 형 웨이퍼를 조작. 미세 배열 및 채널에 대 한 제조업체의 지침에 따라 순차적으로 3 별도 마스크를 사용 하 여 3 계층에 에폭시 기반 부정적인 감광 제 패턴: 얕은 기능에 대 한 100 µ m, 중간 기능에 대 한 200 µ m 및 400 µ m에 대 한 깊은 기능. 이미징 장치에 대 한 두 가지 패턴 레이어 얕은 기능과 깊은 기능에 대 한 600 µ m에 대 한 400 µ m를 사용 하 여 경우</li>
	<li>15 cm (그림 2)을 주조에 대 한 페 트리 접시의 기초를 완성 된 웨이퍼를 테이프.</li>
</ol>2. Microstructured 표면 배열-PDMS의 준비
<ol><li>장치를 사용할 수 있도록입니다 (PDMS), 금형으로 마스터 웨이퍼를 사용 하 여 캐스팅. 초기자의 5 g PDMS 단위체의 50 g을 결합 하 고 플라스틱 플라스틱 포크와 접시의 무게에 철저 하 게 혼합.</li>
	<li>신중 하 게 금형 혼합물을 따르십시오.</li>
	<li>1 시간에 16-25 inHg (54-85 kPa)에서 진공 desiccator에 드.</li>
	<li>치료는 PDMS, 적어도 3 h 65 ° C에서 구워. PDMS 확고 하지만 유연한 고체를 치료 한다.</li>
	<li>메스의 팁과 웨이퍼 표면 사이 접촉을 유지 하는 메스를 사용 하 여 마스터 웨이퍼 장치 주위 잘라 신중 하 게 합니다. 집게를 사용 하 여, 웨이퍼와 깨끗 한 10 cm 배양 접시, 기능 쪽 (그림 3)에 PDMS 복제 껍질.</li>
	<li>산소 플라즈마 35 플라즈마 오븐을 사용 하 여 장치 취급 hydrophobicity를 줄이기 위해 s.</li>
	<li>Zebrafish 태아 매체 (E3) 168 mg/L 에틸 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5)의 포함 된 커버. 전송 피 펫을 사용 하 여 장치의 표면에 물이 흐르는 깊은 기능에서 모든 거품을 제거 합니다.</li>
</ol>3. Microstructured 표면 배열-Agarose의 준비
<ol><li>네거티브 PDMS 몰드를 만들기 위해 먼저 산소 플라즈마와 PDMS 장치 취급.</li>
	<li>
1H, 1H, 2H, 불활성 표면8만들려고 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) 실 란 증기 PDMS 장치 취급. 간단히:
	<ol>
<li>수 처리 기능-사이드 업 연기 후드 내에서 진공 챔버에 PDMS를 놓습니다.</li>
		<li>PDMS, 옆 작은 오픈 유리 또는 알루미늄 접시를 놓고 신중 하 게 PFDTS의 200 µ L 플라스틱 (98 %silane) 접시에. 주의: PFDTS silane 높은 휘발성은, 물으로 강력 하 게 반응, 가연성 이며 접촉에 심각한 피부 및 안구 손상의 원인. 사용 하기 전에 자세히 읽기 MSDS입니다.</li>
		<li>진공 챔버를 닫고 진공 15-30 분, 또는 PFDTS silane 완전히 증발 때까지 적용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>장치를 페 트리 접시에 놓고 2.1-2.3 단계에서 설명한 대로 준비 신선한 PDMS 몰드로 사용 합니다.</li>
	<li>적어도 3 h, 65 ° C에서 구워 다음 처리 장치에서 신선한 PDMS의 전체 레이어를 껍질과 신선한 배양 접시에 놓습니다. 이 다음 agarose를 부정적인 형으로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>Agarose를 준비 하려면 낮은 고 온도 agarose E3에서 전자 레인지에서의 2% 솔루션은 agarose는 완전히 녹아 때까지 끓인 다.</li>
	<li>부정적인 PDMS 몰드에 붓는 뜨거운 agarose 고 흐르는 뜨거운 agarose에 의해 전송 피 펫을 사용 하 여 기능 장치 취재 agarose에서 모든 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>일단 거품이 제거 되는 agarose 설정 하 4 ° C에서 냉동.</li>
	<li>손으로 밑에서 PDMS를 변형 하 여 부정적인 PDMS 몰드에서 agarose 블록을 제거, 새로운 배양 접시, 및 MS-222를 포함 하는 e 3와 젖은 agarose 블록을 전송 합니다.</li>
</ol>4입니다. PDMS 이미징 장치 준비
<ol><li>장치를 사용할 수 있도록, PDMS, 금형으로 마스터 웨이퍼를 사용 하 여 캐스팅. PDMS 단위체의 50 g 5 g (동일 단계 2.1에서에서 사용) 초기자 및 플라스틱 플라스틱 포크와 접시의 무게에 철저 하 게 혼합 결합.</li>
	<li>신중 하 게 금형 혼합물을 따르십시오.</li>
	<li>1 시간에 16-25 inHg (54-85 kPa)에서 진공 desiccator에 드.</li>
	<li>치료는 PDMS, 적어도 3 h 65 ° C에서 구워. PDMS 확고 하지만 유연한 고체를 치료 한다.</li>
	<li>마스터 웨이퍼에서 소자를 잘라내어 포트 1.5 m m 펀치를 사용 하 여 밖으로 펀치.</li>
	<li>치료 장치 및 6-잘 유리 하단 잘 산소 플라즈마 35 접시 s, 단계 2.6에에서 설명 된 대로.</li>
	<li>10 분 동안 85 ° C 열판에 그것을 배치 하 여 한 장치 기능-사이드-아래 6 잘 플레이트의 각 유리 coverslip에 본드. 참고: 확인 하 고 성공적인 결합, 한쪽 집게를 사용 하 여 보 세 장치 회사 압력을 적용. 장치는 유리 coverslip에 연결 된 유지 되어야 합니다.</li>
</ol>5. 제 브라 문화
<ol><li>표준 기술3를 사용 하 여 2 dpf 문화 zebrafish 태아.</li>
	<li>Dechorionate 배아 포 셉 또는 1 mg/mL 효소를 사용 하 여 그들을 수 있도록 장치에 로드 하기 전에 적어도 30-60 분 (참조 자료 테이블)3 을 혼합.</li>
	<li>배아는 E3 (168 mg/L) MS-222 (pH 7.5) 25 X의 1 mL을 추가 하 여 재고 솔루션을 사용 하 여 그들의 페 트리 접시에 anaesthetize</li>
</ol>6. Microstructured 표면-디벗 배열에 Zebrafish의 방향
<ol><li>배아의 쉽게 조작할 수 있는 e 3의 얇은 (1-2 m m) 층에 의해 포함 되는 그것의 페 트리 접시에 2.7 (그림 3A) 단계에서 PDMS 블록을 준비 합니다.</li>
	<li>전송 피 펫을 사용 하 여 PDMS 블록의 표면에 배아 (조건 당 일반적으로 10-20)의 필요한 수를 전송 합니다.</li>
	<li>Micromanipulation 도구를 사용 하 여 (머리 루프 또는 이와 유사한), 배아 microstructured divots (그림 3A)에 밀어. Divots의 사용은 지 느 러 미 및 복 부 방향에 특히 적합 합니다. 참고:와 엄격한 divots (지 느 러 미 및 복 부)에 맞게, 배아, 디벗을 병렬로 블록의 표면에 위치 하 고 머리 루프를 사용 하 여 위치에 그들을 압 연. 깊이 디벗으로 그들을 밀어 그들을 안정적으로 유지 하는 데 도움이 됩니다.</li>
</ol>7. Microstructured 표면-에서 Zebrafish의 방향을 Microstructured 채널
<ol><li>E3 PDMS 블록 microstructured 채널 (그림 3B) e 3의 수준, 블록의 가장자리 아래로 떨어지면 하지만 여전히 존재 저수지와 채널에는 PDMS에 얇은 층에서 때까지 전송 피 펫을 사용 하 여 패턴을 그립니다.</li>
	<li>가장자리를 오버플로 하지 않도록 주의 되 고 전송 피 펫을 사용 하 여 저수지에 단계의 5.3 10 배아를 전송.</li>
	<li>머리 루프를 사용 하 여 적절 한 채널의 입구에 깔때기에 각 배아를 조작 하 고 태아의 머리는 채널 쪽으로 고 태아는 적절 한 방향으로 채널 입력 되도록 방향.</li>
	<li>각 태아 orienting microfeatures 장소에 그것을 유지 하는 데 도움이 채널 벽에 도달할 때까지 머리 루프를 사용 하 여 채널 아래로 슬라이드. Microstructured 채널의 사용은 특히 측면 방향에 대 한 권장 됩니다. 참고: microinjection 중 슬라이딩 배아를 줄이기 위해, 저수지에서 e 3를 그려서 표면 장력의 양을 조정 해보십시오.</li>
</ol>8입니다. 제 브라 microinjection
<ol><li>
Microinjection 바늘을 준비 합니다.
	<ol>
<li>앞에서 설명한4micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 붕 규 산 유리 microcapillary 바늘을 확인 합니다. 결과 바늘 약 10 m m의 테이퍼 길이 한쪽 끝 지점으로 테이퍼 합니다.</li>
		<li>이 경우 100 nM chemoattractant에 주입 하는 솔루션을 준비 (N-Formylmethionine-leucyl-페닐알라닌 (fMLP) 또는 Leukotriene b 4 (LTB4))와 100 nM 70 kDa Rhodamine dextran 추적 프로그램 PBS에.</li>
		<li>가늘게 가늘게 한 피 펫을 사용 하 여 바늘에 솔루션의 5 µ L 로드 팁 (자료 표 참조).</li>
		<li>마그네틱 스탠드에 장착 하 고 picopump microinjector에 연결 된 micromanipulator에 바늘을 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>집게와 테이퍼 팁을 곤란 하 게 하 여 45 ° 각도로 바늘의 팁을 휴식.</li>
	<li>1 주입 bolus 크기 조정 picopump 컨트롤러에 주입 시간을 조정 하 여 nL.</li>
	<li>Microinjection 바늘의 각도 조정 합니다. Micromanipulation 컨트롤러에 45 °의 바늘 각도 일반적으로 태아의 길이에 평행 하 게 바늘으로 좋은 출발점. 험한 각도 microinjection 동안 태아의 측면 움직임을 최소화 하기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>왼손으로 페 트리 접시와 오른쪽으로 바늘 micromanipulator controlling, microinjection,이 경우 otic 소포의 의도 사이트로 최대한 바늘 가까이 가져. 참고: otic 소포 직사각형 기관 후부 두 작은 뚜렷한 어두운 직사각형 구조 (otoliths)를 포함 하는 눈으로 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>Micromanipulation 컨트롤러를 사용 하는 바늘의 팁, 소포 내 (이 경우 otic 소포)에 대상 조직을 관통 하 고 picopump 발 스위치를 사용 하 여 미리 설정 된 볼륨을 주입. 참고: 조직 침투를 저항 하는 경우 부드럽게 micromanipulation 컨트롤러 노브 도청 보십시오.</li>
	<li>배아를 출시, E3 표면 위쪽에서 전송 피 펫을 사용 하 여 아래쪽 또는 배아 주변 E3에 출시 되는 접시를 소용돌이 흐름.</li>
	<li>MS-222 전송 피 펫을 사용 하 여 없이 e 3의 복구 접시에 배아를 전송.</li>
</ol>9. 장치 이미징 PDMS를 사용 하 여 배아의 심사
<ol><li>포트를 통해 흐르는 E3 (+ MS-222) 단계의 4.7 장치 프라임. 이 행 해질 수 있다 1000 µ L 피 펫 또는 좁은 팁 전송 피 펫을 사용 하 여.</li>
	<li>채워 잘 e 3 + MS-222 장치 덮여 때까지.</li>
	<li>잘 사용 하 여 각 전송 피 펫에 8.7 단계에서 4 삽입 된 배아를 제공 합니다. E3 + MS-222 (5.3 단계)를 로드 하기 전에 1-2 분 동안 배양 하 여 배아 미리 마 취 될 수 있습니다.</li>
	<li>Micromanipulation 도구를 사용 하 여 (머리 루프 또는 이와 유사한), 동양 (꼬리 1 또는 머리-첫 번째, 사용 하는 장치에 따라), 원하는 방향으로 영상 채널의 입구에서 배아 및 장치 (그림 4A)에 부분적으로 그들을 밀어. 이 장치에 균등 하 게 그들을 그릴 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>배아 채널 (그림 4B) 이미징에 대 한 올바른 방향으로 그려집니다 때까지 1000 µ L 피 펫 또는 전송 피 펫을 사용 하 여 포트에서 장치를 통해 E3를 그립니다. 참고: 트래핑 지점 과거 배아를 빨 아 하지 않도록 주의 하십시오,이 배아를 손상 하 고 그들의 방향을 변경 합니다.</li>
	<li>(그림 4C) 이미징을 위한 현미경을 잘 플레이트를 전송 합니다.</li>
	<li>
이미지를 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여입니다.
	<ol>
<li>적절 한 렌즈를 선택 하 여 확대를 조정 합니다. 10 배는 일반적으로 이미징 zebrafish 호 중구 마이그레이션에 대 한 유용한 확대.</li>
		<li>각 신호는 분명, 하지만 하지 포화 되도록 광원 강도 및 각 채널에 대 한 노출 시간을 조정 합니다.</li>
		<li>각 채널에 대 한 이미지를 캡처하십시오. 여기, 우리가 사용 하는 녹색 형광 단백질 (GFP, 예: 470/22, Em: 525/50), 텍사스 레드 (TxRed, 예: 585/29, Em: 628/32) 채널을 전송. 멀티 채널 이미지 후 처리 하는 동안 결합 될 수 있다 (그림 4B-I).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

여기, 우리는 사용 설명 장치 우리는 최근 2 dpf zebrafish microinjection의5, 촉진 하기 위하여 소개 하는 배아의 편리한 이미징에 대 한 간단한 agarose 무료 장착 장치 개발. 이러한 도구는 zebrafish 기법에 대 한 유용한 장치 제조를 위한 photolithographic 기술의 유틸리티를 강조 표시합니다.
우리는 발견 MSA 장치 특히 유용 세포 또는 입자의 주입을 위해 microinjection 바늘 ?...

Zebrafish의 기본적인 발달 생물학 대규모 유전 연구에서 다양 한 분야에 대 한 강력한 모델로 등장 하 고 화학 스크린1,2. 일상적인 유전자 조작, 유전자 overexpression, 최저, CRISPR/Cas9 mutagenesis, transgenesis 등 상업적으로 간단한, 쉬운--사용의 개발을 주도하 고 있다 단일 셀 zygote에 유전 물질의 microinjection에 의존 방향을 사출3계란 안정화를 사용할 수 있는 도구. 감염, 이식 등 다른 접근으로 나중 단계 태아 그리고 애벌레 더 큰 게이지 모 세관 바늘4를 사용 하 여 microinjection을 해야 하는 경우가 많습니다. 그러나, 더 큰 계기 바늘의 사용으로 밀거나 태아 롤링 없이 표적 조직에 침투 하기 어려운 중요 한 기술적 과제, 선물. 이러한 조건에서 절차 동안 건조를 방지 하는 것은 어렵다, 하는 동안 태아를 안정화 하는 데 필요한 적절 한 물 긴장 및 배아 수 있습니다 이상적으로 표적 조직에 주입에 대 한 지향.
Microinjection, 다음 그것이 주입된 태아 성공적으로 주입 되어, 그를 선택 하 고 초기 시간 포인트의 이미지를 캡처 화면 종종 유용 합니다. 이러한 과제를 해결 하기 위해 우리는 microinjection5, 그리고 빠른 이미지 기반 심사 후 주입을 위한 다양 한 방향에서 2 dpf 배아를 안정화 하는 데 도움이 microstructured 장치의 범위를 개발 했습니다.
이 장치에 충분 한 구조 해상도 얻으려면, 우리는 photolithographic 기술을 활용. 최근 미세 제작 추정 마이크로 전자 산업 등에서 일반적으로 사용 되는, 이러한 접근 1-1000 µ m, zebrafish 태아 그리고 애벌레의 조작에 적합 한 규모에서에서 배열 하는 수직 구조를 얻을 수 있습니다. 모든 장치입니다 (PDMS), 저렴 한, 생물학으로 비활성, 육체적으로 강력 하 고 투명 한은 사용 하 여 날조 되었다.
Microstructured 표면 배열 (MSAs) 꽃무늬 최고 표면 PDMS의 블록으로 포맷 했다, 계란 microinjection 위해 간단한 채널 agarose 블록에 유사한 일반적으로 사용. 포스트 주입 심사에 대 한 이미징 장치 6 표준 유리 바닥 6 잘 플레이트에 배열할 수 있다. 이 소자는 배아의 쉬운 로딩을 위한, 언로드 절차 편리 하 게 이미지 기반 구조 촉진 특정 배아의 수에 의해 개발 된 이전 그 장치 보다 더 많은 사용자 친화적인 방식으로 접근을 차단 합니다 비비 실험실6.

<table><tbody><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhsives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td></tr><tr><td>Low gelling temperature agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>For casting agarose devices</td></tr><tr><td>PFDTS silane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>For casting of negative PDMS molds</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>To anesthetize zebrafish</td></tr><tr><td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td><td>ThermoFisher</td><td>D1818</td><td>To trace microinjections</td></tr><tr><td>Leukotriene B4 (LTB4)</td><td>Cayman Chemicals</td><td>20110</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3506-50MG</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>15 cm Petri dish</td><td>Fisher scientific</td><td>08-757-148</td><td>For Casting from the master wafer</td></tr><tr><td>Glass-bottom 6-well plates</td><td>MatTek</td><td>P06G-0-20-F</td><td>For imaging devices</td></tr><tr><td>Borosilicate glass microcapillaries</td><td>World Scientific Instruments</td><td>TW-100-4</td><td>For microinjection needles</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z350796</td><td>For transferring zebrafish embryos</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Fisher scientific</td><td>E5242956003</td><td>For loading the microinjection needles</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15111-15</td><td>To punch ports in PDMS imaging devices</td></tr><tr><td>No. 11 Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>For cutting PDMS</td></tr><tr><td>Dumont No. 5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-10</td><td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td></tr><tr><td>Marzhauser Micromanipulator</td><td>ASI</td><td>MM33-R</td><td>For manipulating microinjection needle</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>MSC</td><td>SPI - 87242624</td><td>For mounting micromanipulator</td></tr><tr><td>MPPI-3 Picopump controller</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>To control microinjection volume and timing</td></tr><tr><td>EVOS inverted fluorescent microscope</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS FL</td><td>To image injected embryos</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>For visualizing microinjecion</td></tr><tr><td>AutoCAD software</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

Zebrafish 대규모 유전과 화학 스크린을 통해 기본적인 발달 생물학에 걸친 다양 한 인간 질병 및 실험 연구의 증가 범위에 대 한 유용한 도구 강력한 모델로 떠오르고 있다. 그러나, 많은 실험, 특히 감염 및이 종이 식 모델에 관련 된 microinjection와 배아와 힘 드는 기법 기술 및 전문 지식이 필요로 하는 애벌레의 이미지에 의존 합니다. 정밀도 현재 microinjection 기법의 처리량을 개선 하기 위해, 우리는 이전에 복 부, 등, 또는 측면 방향 동양 zebrafish 태아 2 일 게시물 수정 (dpf)에 안정화를 microstructured 장치의 시리즈를 개발 합니다 절차입니다. 배아의 이미징에 도움, 우리는 또한 채널 4 zebrafish 유리 커버 슬립에 대 한 동시에 옆 방향으로 간단한 장치 설계. 함께, 우리가 여기 제시 도구 zebrafish 기술의 최적화를 위한 유용한 장치를 생성 하기 위해 photolithographic 접근의 효과 보여 줍니다.

여기서 설명 하는 접근은 (그림 1)의 설계 및 제조 2 dpf zebrafish, photolithographic (그림 2)와 소프트 리소 그래피 (그림 3) 기법을 사용 하 여 함께 사용 하기 위해 장치를 보여 줍니다. 이 방법을 사용 하면 많은 설계 반복 및 수정, 빠른 테스트 하 고 변경 및 개발의 다른 단계에서 제 브라와 함께 사용 하기 위해 ...

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Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K 조회수.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

연구

생체공학

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

발생학

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

생물학

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

신경과학

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Zebrafish 애벌레의 향상 된 실험적인 조작에 대 한 장기 라이브 이미징 장치

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics Designs for Multiplexed Zebrafish Imaging

Zebrafish embryos are transparent and thus uniquely suited for noninvasive intravital imaging of fundamental processes, such as wound healing and immune cell migration. Microfluidic devices are used for entrapment to support long-term imaging of multicellular organisms, including zebrafish. However, the fabrication of these devices using soft lithography requires specialized facilities and competency in 3D printing, which may not be accessible to every lab. Our adaptation of a previously developed low-cost polyethylene terephthalate lamination method for constructing microfluidic devices increases accessibility by enabling design fabrication and iteration for a fraction of the technical investment of conventional techniques. We use a device made with this method, the Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing (RADISH), to accommodate drug treatment, manual wounding, and long-term imaging of up to four embryos in the same field of view. With this new design, we successfully capture gross morphological characteristics of the calcium&#160;signal around laser ablation and manual transection wounds for multiple embryos in the 2 h immediately following injury, as well as neutrophil recruitment to the wound edge for 24 h.

An innovative method for fabricating microfluidic devices using polyethylene terephthalate (PET) lamination significantly reduces the cost and complexity of entrapping and imaging multiple live zebrafish embryos.

저비용 폴리에틸렌 테레프탈레이트 라미네이션 미세유체역학(Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics) 설계로 멀티플렉스 제브라피시 이미징

Zebrafish embryos are transparent and thus uniquely suited for noninvasive intravital imaging of fundamental processes, such as wound healing and immune ...