이 작품은 건강의 국가 학회 (R01 AR061164-01A1)에 의해 지원 되었다.

모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 메인 의료 센터 연구소에 의해 승인 되었다.
1. 컬렉션 튜브 준비
<ol><li>10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린/스의 최소 필수 매체 α (MEM α)을 보완 하 여 BMSC 문화 미디어를 확인 합니다.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브에 BMSC 문화 미디어의 100 µ L를 배치 합니다. 3 뼈 보통 단일 튜브 그래서 그에 따라 준비 하나에 적합할 것 이다.</li>
	<li>그들은 원심 분리기 튜브에 들어가도록 충분히 200 µ L 피 펫 팁의 끝을 잘라. 튜브 내부 팁 넣고 뚜껑 얼음에 튜브를 배치 하기 전에 닫을 수 있도록 합니다. 참고: 또는, 0.75 mL microcentrifuge 튜브 끝 잘라 삽입할 수 있습니다 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에.</li>
</ol>2입니다. 쥐에서 뼈의 수확
<ol><li>CO2 뒤에 자 궁 경부 전위를 사용 하 여 동물을 안락사 하 고 70% 에탄올으로 그들을 살포. 주: 동물 같은 섹스 그리고 가급적 이면 같은 나이에서 사용 하는 확인 하십시오. 우리는 정기적으로 동물 세 7 ~ 8 주를 사용 합니다. 더 나은 대표 및 재현성 세포 인구를 실험 그룹 당 적어도 3 동물에서 세포를 풀링 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>
해 보드에 그것의 뒤에 안락사 마우스를 놓습니다. 집게를 사용 하 여 복 부에 피부의 텐트를 만들. 살 균 해가 위를 사용 하 여 작은 절 개 (약 1cm)을 확인 합니다. 더 낮은 복 부와 다리를 노출 하려면 다시 사지와 컷에서 발 피부 껍질.
	<ol>
<li>잘라 발목 아래 발 제거 공동. hipbone에서 대 퇴 골 머리를 분리 하는 엉덩이에 장 골의 크레스트 따라 자릅니다. 그것의 뒤에 아직도 마우스를 실행 하는 동안 2 개의 장 골 뼈 분리 hipbone 중간 절 개를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>보풀이 물티슈를 사용 하 여 조심 스럽게 화관, tibias, 장 골 뼈에서 근육을 제거. 참고: 절단 힘 줄과 뼈에서 근육의 가능한 게로 보풀 잎사귀 (예, kimwipes)와 함께 쉽고 빠르게 청소. 그들은 쉽게 휴식 하는 경향이 하 고 그들의 취약성 특정 genotypes 증가 될 수 있습니다 뼈를 조작 하는 때 주의 사용 합니다.</li>
	<li>일단 모든 샘플 해 부 되는, 얼음에 PBS에 넣어 고 절연의 나머지 단계에 대 한 살 균 문화 후드로 이동. 참고: aseptically 가능한 작업 문화에 오염에 대 한 가능성을 줄일 것입니다.</li>
	<li>원심 분리기 튜브 내에서 sectioned 팁에 그들을 배치 하기 전에 뼈의 인접 하 고 원심 끝에 작은 상처 (약 1 ~ 2 m m)를 확인 합니다. 주: 골 수; centrifuged 수 있도록 충분 한 금액을 확인 그러나, 주의가 피하기 위해 골 수 공간에 근접에 따라 너무 많은 절단 세포 인구 변화 하는 경향이.</li>
	<li>15에 대 한 10000 x g에서 원심 분리기 실 온에서 s. 확인 한 모든 골 수는 플러시 1.5 mL 튜브의 하단에 삽입 (중 200 µ L 피펫으로 팁 또는 0.75 mL microcentrifuge 튜브) 안에 뼈는 일지도. 일단 모든 골 수 수집 컬렉션 튜브에서 뼈와 함께 삽입을 제거 합니다. 참고: 모든 골 수 플러시 뼈 나타납니다 흰색. 그러나, 골 수는 특정 뼈에 남아, 경우 절단 끝을 다시 시도 하 고 원심.</li>
</ol>3. 세포 현 탁 액
<ol><li>25g 바늘, 풀을 사용 하 여 셀 쥐 똥를 위아래로 천천히 대단히 짧은 시간을 휴식과 단일 15 mL 원뿔 튜브로 모든 샘플을 결합. 샘플의 500 µ L 당 BMSC 문화 미디어의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>70 µ m 필터 50 mL 원뿔 튜브 위에 놓고 가능한 뼈 조각을 제거 세포 현 탁 액이이 필터를 통해 전달 합니다.</li>
</ol>4. 도금의 골 수 세포 (전체 Bmc)의 혼합된 인구와 문화
참고: 셀은 5% CO2배양 기에서 37 ° C에서으로 경작 된
<ol><li>셀의 수를 계산 하 고 x 106 셀/cm2 문화 미디어에서 1.0에서 접시. 연결할 셀에 대 한 혼합 문화의 72 h를 허용 합니다. 참고: 문화 미디어에 세포 현 탁 액 20 배 고 trypan 블루는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하기 전에에서 다시 diluting diluting 것이 좋습니다. 7 주 된 남성 C57Bl6/J 쥐에 대 한 우리 정기적으로6 셀 약 50 x 10의 셀 번호를 생성 하지만 나이, 성별, 및 스트레인 수 영향을 셀 수 크게. 참고: 셀의 혼합 인구 연결 해야 문화의 하단에 잘 합니다.</li>
	<li>72 h 후 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어와 함께 그것을 대체 합니다. 계속 변화 하는 미디어 모든 다른 하루 confluency 확인 합니다. 셀 confluency 80-100%에 도달, 그들은 차별화에 대 한 준비가 되었습니다. 참고:이 문화 BMSCs와 HSCs, 혼합 때문에 그것은 사용할 수 있습니다 직접 osteoblastogenesis, 지질으로 osteoclastogenesis.</li>
</ol>5. 도금의 BMSCs (부착 BMSCs)의 분할 인구와 문화
참고: 셀은 5% CO2배양 기에서 37 ° C에서으로 경작 된
<ol><li>10 cm 문화 요리 (55 c m2 의 문화 영역)으로 화관, tibias, 그리고 한 마우스의 장 골 뼈에서 수집 하는 모든 셀 접시 참고: 2-3 C57BL/6J 마우스를 풀링할 때 우리가 일반적으로 접시 150 c m2 플라스 크에서이 '총' 골 인구.</li>
	<li>혼합 문화 48 h 후 (비-부착 HSCs 포함) 문화 미디어를 제거 합니다. Osteoclastogenesis 실험을 수행할 수 있다면, 비 부착 한 세포 제쳐두고 (섹션 7 참조), 하지 않을 경우, aspirate이이 인구를 설정 하 고 이러한 셀을 삭제.</li>
	<li>연결 된 셀을 방해 하지로 신중 하 게 PBS 가진 접시/플라스 크를 씻으십시오.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 추가 0.25 %trypsin 및 세포 현 탁 액을 셀 미디어를 추가 하 여 1-3 분 끄다는 트립 신에 대 한 37 ° C에서 배양 하 여 세포를 리프트. 이 시점에서, BMSCs, 지금 해제, 될 수 있는 (로 이전에 완료 단계 4.1) 미래 실험을 위한 도금.</li>
	<li>도금에 필요한 셀의 수를 계산 합니다. 필요한 양의 세포 현 탁 액 상 온에서 5 분 동안 1000 x g에서 원심 참고: 셀은 일반적으로 도금 끝점 실험에 따라. 예를 들어 단백질/RNA 격리 되어야 하는 경우 우리가 일반적으로 격판덮개 높은 밀도 (~1.0-2.0 x 106 셀/잘 6 잘 플레이트).</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 도금에 필요한 문화 미디어의 볼륨에서 셀 펠 릿 resuspend. 실험에 따르면 문화 미디어에 셀 접시 하 고 몇 일 동안 연결할 수 있도록. BMSCs confluency에 도달, 수행 차별화를 진행 합니다.</li>
</ol>6입니다. BMSCs의 차별화
<ol><li>
Osteoblasts
	<ol>
<li>게 osteoblast 차별화 미디어 1 M β-글리세롤의 800 µ L을 추가 하 여 인산 염 PBS에 PBS에 의약품 0.5 M의 200 µ L BMSC 문화 미디어의 99 mL (BMSC 문화 미디어의 구성에 대 한 단계 1.1 참조).<ol>
<li>BMSCs 문화 (총 Bmc 단계 4.3에서에서) 또는 BMSCs 단계 5.6에서에서 점착 confluent 일단 osteoblast 차별화 미디어 문화 미디어를 전환 하 여 그들을 osteoblasts로 차별화.</li>
		</ol>
</li>
		<li>매일 차별화 미디어를 교체 합니다. 셀 강화 작용의 백색 혹 생산 시작. 우물의 바닥에 맨 눈으로 그들을 시각화합니다 이 과정은 3 주 몇 일 이내에 발생할 수 있습니다.<ol>
<li>Osteoblastogenesis 평가, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 또는 폰 Kossa 섹션 8에에서 설명 된 대로 우물에 얼룩을 수행 합니다. 참고: 셀 단층의 파괴를 피하기 위해 약간의 각도에 접시를 기울이기에 의해 신중 하 게 미디어를 변경 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) 높은 포도 당, 소 태아 혈 청, 페니실린/스의 1 mL, 100 µ L 20 mM Rosiglitazone 2mm 인슐린의 100 µ L의 10ml의 90 mL을 함께 혼합 하 여 체형 기본 미디어를 확인 합니다. 필요한 경우 차별화 실험 기간 동안 주 4 ° C에이 미디어를 저장 합니다.</li>
		<li>62.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)의 200 µ L을 추가 하 여 체형 유도 미디어 만들기와 체형 베이스 미디어의 25 ml 1 m m Dexamethasone의 25 µ L.</li>
		<li>BMSCs 문화 (총 Bmc 단계 4.3에서에서) 또는 BMSCs 단계 5.6에서에서 점착 confluent 일단 체형 유도 미디어를 미디어를 변경 합니다. 차별화의이 오늘을 0를 고려 하십시오.</li>
		<li>48 h 후 미디어를 제거 하 고 체형 유도 미디어 문화를 새로 고칩니다.</li>
		<li>4 일에 체형 기본 미디어로 전환. 참고: 지질 방울 주 2 또는 4 일 일찍 나타나는 것을 시작할 수 있습니다.</li>
		<li>7 일 셀 최대 지질 방울 축적 및 성숙한 체형과 유사한 표현 형을 표시를 준수 합니다. 그것은 세포 죽음/분리를 발생할 수 있습니다이 시점 과거 문화 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7입니다. Osteoclasts에 HSCs의 차별화
<ol><li>Osteoclast 차별화 미디어 25 ml BMSC 문화 미디어의 25 µ g/mL의 수용 체 활성의 NFKB Ligand (RANKL)와 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (mCSF)의 25 µ g/mL의 15 µ L의 50 µ L을 추가 하 여 확인 합니다.</li>
	<li>일단 총 Bmc (4.3 단계)에서 나는 비 부착 한 세포 (5.2 단계)에서 우물에 연결 된, 문화 미디어 Osteoclast 차별화 미디어를 전환할 수 있습니다. 차별화 미디어 매일 보충.</li>
	<li>Osteoclast 문화에서 10 배 확대 현미경 매일 관찰 합니다. Osteoclasts 퓨즈와 차별화의 5-7 일의 주위에 일반적으로 multinucleated 세포 형성을 관찰 합니다.</li>
</ol>8. 얼룩
<ol><li>
Osteoblasts 참고: 사용 하는 우리는 종종 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 얼룩 얼룩 하는 AP 키트 ( 재료의 표참조) 지침에 따라.<ol>
<li>AP 얼룩 키트 제조 업체의 지침에 따라 수행 합니다.<ol>
<li>미디어를 발음 하 고 PBS로 세포를 씻어. 4% 셀 수정 Paraformaldehyde (PFA) 실 온에서 12 분에 대 한 PBS에.</li>
			<li>한편, AP 500 µ L을 추가 하 여 키트를 얼룩이 지기에서 시 약을 사용 하 여 AP 솔루션을 만들어 500 µ L FRV 알카라인 솔루션을 부드럽게; 혼합 나트륨 아 질산염 하자 2 분 추가 22.5 mL dH2O와 500 µ L Naphthol AS BI 알칼리 성. 부드럽게 혼합. 주의: PFA 독성 이며 관리와 처리 해야 합니다.</li>
			<li>일단 셀 고정, PBS로 씻어 고 각 잘 (우물 당 1 ~ 2 mL)을 AP 솔루션을 추가 합니다. 커버 알루미늄 호 일 및 빛에서 보호 하는 실 온에서 30 분 동안 하자 얼룩. 솔루션을 발음 하 고, 증류수로 씻어 접시 건조를 허용.</li>
		</ol>
</li>
		<li>알칼리 성 인산 가수분해 효소 긍정적인 세포를 관찰 하기 위해 카메라를 사용 하 여 스테인드 식민지의 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 대신 폰 Kossa 수행 합니다. 이 위해, 모든 나머지 PBS로 증류수로 깨끗이 세척 웰 스 실버 질산염. 와 침전 것입니다.
		<ol>
<li>4% 셀 수정 PFA 실 온에서 12 분에 대 한 PBS에. 그런 다음 충분 한 5% 실버 질산염 솔루션 잘 커버 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 강한 빛에 노출에 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>실버 질산염 솔루션을 제거 하 고 증류수로 각 잘 린스. 셀에 5% 나트륨 thiosulfate 솔루션을 추가 하 고 3 분 서 보자.</li>
		<li>나트륨 thiosulfate 발음 하 고 증류수로 씻어. 접시 건조 미네랄 예금에서 맨 눈으로 어두운 갈색/검은색 얼룩이 관찰 하자.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocytes
	<ol>
<li>기름 빨간 O (오로) 얼룩이 지기에 대 한 10%를 사용 하 여 셀 수정 중립 버퍼링 말린 실 온에서 1 h.</li>
		<li>한편, 0.035 g 소 프로 파 놀의 10 mL에 용 해 하 여 오로 재고 솔루션을 확인 합니다. 이것은 6 잘 플레이트에 대 한 충분 한입니다. 혼합 하 고 하나의 필터 종이 (기 공 크기 11 µ m)를 사용 하 여 솔루션을 전달 합니다.</li>
		<li>6 mL 증류수의과 오로 재고 솔루션의 9 mL를 diluting 하 여 오로 작업 솔루션을 확인 합니다. 사용할 준비까지 로커에 솔루션을 둡니다.</li>
		<li>증류수에 60% 소 프로 파 놀 준비 (각을 커버 하기에 충분 하 게 잘).</li>
		<li>셀 고정, 증류수와 통 및 세척 한 번 제거. 1 분 60% 소 프로 파 놀 솔루션에 물을 바꿉니다. 참고: 추가 팁 접시; 하는 동안 액체도 천천히 adipocytes 매우 쉽게 분리 하십시오.</li>
		<li>소 프로 파 놀을 제거 하 고 모든 세포를 충당 하기 위해 충분 한 오로 작업 솔루션을 추가 합니다. 실 온에서 저속 로커에 15 분 동안 품 어. 오로 제거 하 고 증류수로 두 번 세척. 참고:이 시점에서 오로 얼룩진 지질 방울 수 구상 될 현미경.</li>
		<li>오로 계량, 각 음을 100% 소 프로 파 놀의 1 mL을 추가 하 고 10 분 동안 천천히 흔들어는 오로 destain.</li>
		<li>한편, 오로 작업 솔루션을 사용 하 여 다음 8 표준에 따라 표준 곡선을 만드는 희석 시리즈를 준비 (2100 µ g/mL)와 소 프로 파 놀은 희석제로: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75, 및 0 µ g/mL.</li>
		<li>표준과 접시에 triplicates에서 destained 샘플의 200 µ L을 로드 하 고 490에서 흡 광도 읽고 nm.<ol>
<li>표준 곡선에 따라 각 샘플에 대 한 오로의 농도 결정 합니다. 참고: 셀 수 오로 농도 정상화 것이 좋습니다. 휴대폰 번호 크리스탈 바이올렛 얼룩 또는 DNA 양을 측정할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoclasts 참고: 경우 준비, 좋습니다 osteoclasts 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정) 트랩 얼룩을 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조)에 대 한 얼룩.<ol>
<li>트랩 얼룩, PBS에 2.5%도 함께 실 온에서 30 분에 대 한 셀을 수정. 한편, 함께 빠른 가닛 기반 솔루션의 50 µ L, 나트륨 아 질산염, 증류수의 4.55 mL, Napthol AS Biphosphate 아세테이트 솔루션의 200 µ L, 100 µ L 주석산 솔루션의 50 µ L의 50 µ L를 혼합 하 여 트랩 솔루션을 확인 합니다.</li>
		<li>정착 액에서 aspirate 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 트랩 솔루션을 추가 하기 전에 두 번 PBS 가진 세포를 씻어</li>
		<li>Osteoclasts 현미경 (10 배 확대) 아래를 계산 하기 전에 증류수로 세척. 트랩+ 셀 3 개 이상의 핵을 보라색 나타납니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges.">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li><li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment.">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li><li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b.">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li><li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation.">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).</li><li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells.">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).</li><li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss.">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li><li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner.">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li><li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells.">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li><li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension.">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).</li><li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells?.">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?.</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li></ol>

저자 들은 관심사의 재정적인 충돌 공개.

이 문서에서는, BMSCs의 문화의 두 가지 방법은 자신의 장점과 한계 표시 됩니다. 세포는 골 수에서 오는 격리 상대적으로 어려움 없이 과정 이다. 그러나, 중간 엽 줄기 세포 또는 osteoclastic 창시자의 대표적인 세포 인구를 얻기 때문에 골 수 구멍의 다양 한 세포 환경 전하실 수 있습니다.
골 수 내용의 전체를 경작 vivo에서 microenvironment의 가까운 표현을 제공 합니다. 그러...

기본 murine BMSCs1초기 1980 년대 있는 그들의 발견부터 중간 엽 줄기 세포의 생체 외에서 모델으로 일반적으로 사용 됩니다. 긴 뼈의 골 수 구멍에서 플러시 플라스틱 부착 한 세포의 문화 osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes, 또는 많은 연구2,3, adipocytes에 분화 될 수 있는 능력을 유지 하는 사실, 4 , 그러나 5., 골 수는 독특한 조직 HSCs, 내 피, 그리고 면역 세포 포함 하 되이 국한 되지 않음, BMSCs, 하지만 많은 다른 세포 인구의 구성. 따라서, 고립과 문화 기술을 다른 동질성과 세포 인구를 얻을 수 있습니다. 이러한 기술을 사용 하 여 셀에서 잠재적인 차별화 테스트 전하실 수 있습니다. 예를 들어 다른 genotypes와 쥐에서 셀을 비교할 때 데이터의 해석을 제한 혼합된 세포 인구로 시작 합니다. 반대로, BMSCs 및 HSCs의 균질 성 인구 기술적으로 어려울 수 있습니다 고로 대표 되지 않을 수 있습니다 ex vivo 모델의.
우리의 실험실에서 우리는 주로 BMSCs osteoblasts, osteoclasts, adipocytes에 분화 될 그들의 잠재력 활용에 관심이. 여기, 우리가 osteoclasts에 차별화를 HSCs의 문화 뿐만 아니라 BMSCs와 HSCs 격리와 문화 osteoblastogenesis 또는 지질에서 생체 외에서평가 하는 데 사용의 기법 제시. 한 가지 방법은 BMSCs 및 HSCs 지질, osteoblastogenesis, 및 osteoclastogenesis (총 Bmc 라고 함)에 대 한 직접 적합 한 골 수 세포 (Bmc)의 혼합된 인구를 사용 합니다. 이 방법은 골 microenvironment의 세포 사이 발견이 성분의 가까이 비보 전 표현입니다. 또 다른 방법은 BMSCs (점착 BMSCs 라는) HSCs의 문화 "순수한" 인구 하려고 비 부착 한 세포에서 점착을 구분 합니다. 이후 방법은 세포 배양 실험의 BMSCs 또는 HSCs의 더 정확한 숫자와 함께 시작 하 고 문화에 남아 있는 다른 세포 인구의 복잡 한 간접 효과의 가능성을 줄일 수 있습니다. 두 방법 모두는 이전 출판 되었고 다른 연구 질문6,7,,89를 해결 하는 데 사용.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="636">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200&#956;L pipet tips&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">17014401</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL conical tube</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Science</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70&#956;m filters</td>
			<td style="width:135px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% trypsin</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:135px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alkaline Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silver Nitrate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Thiosulfate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman filter Grade 1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z274852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:135px;">Electron</td>
			<td style="width:119px;">16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM&#945;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rosiglitazone</td>
			<td style="width:135px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:119px;">717410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IBMX</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RANKL</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">310-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mCSF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axio Observer inverter microscope</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

중간 엽 줄기 세포의 표현으로 일상적으로 사용 되는 세포 인구를 구성 하는 골 수 기질 세포 (BMSCs) 생체 외에서. 그들은 캐비티 내에 골 수 조 혈 줄기 세포 (HSCs), 적혈구, 면역 창시자, 및 osteoclasts 증가 줄 수 있는 함께 상주 합니다. 따라서, 다양 한 세포 인구, 실험 설계 과제를 제시 하 고 데이터 해석을 혼동 수 있는 매우 다른 유형의 혼합에 골 결과에서 세포 인구의 기사. 여러 격리 및 문화 기술 BMSCs 및 HSCs invitro의 더 많거나 적은 균질 인구를 얻기 위하여 실험실에서 개발 되었습니다. 여기, 우리가 마우스 긴 뼈에서 BMSCs 및 HSCs의 격리에 대 한 두 가지 방법을 제시: 부착을 기반으로 BMSCs 및 HSCs의 혼합된 인구를 생성 한 방법 및 두 세포 인구를 분리 하는 한 방법. 두 방법 모두 제공 세포 적합 osteogenic 및 adipogenic 분화 실험 뿐만 아니라 기능적 분석 실험.

세포 배양의 개요 두 문화 기술 BMSCs 및 HSCs (총 Bmc, 그림 1A)로 구성 된 Bmc의 혼합된 인구 또는 BMSCs의 인구에 차별화의 평가 HSCs (부착 BMSCs, 그림 1B)에서 분리 수 있습니다. 48 시간 후에 골 수에서 세포 격리 및 도금 (그림 1C), 그들은 신속 하 게 플라스틱 문화 접시의 바닥에 연결 고는 단층을 ?...

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Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 마우스 긴 뼈에서 골 수 기질 세포와 조 혈 줄기 세포 분화 방법 제시. 두 개의 서로 다른 프로토콜에는 저조한 다른 세포 인구 확장 및 차별화 osteoblasts, adipocytes, osteoclasts에 적합 되 게 됩니다.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

30.8K 조회수.  Maine Medical Center Research Institute. 이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 마우스 긴 뼈에서 골 수 기질 세포와 조 혈 줄기 세포 분화 방법 제시. 두 개의 서로 다른 프로토콜에는 저조한 다른 세포 인구 확장 및 차별화 osteoblasts, adipocytes, osteoclasts에 적합 되 게 됩니다.

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Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

연구

발생학

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

효소 방법은 응고 골수 샘플에서 중간 엽 줄기 세포를 구출

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

사람 골수에서 분리 Mesangiogenic 전구 세포 (MPC와)

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

마우스 자궁 내막 상피와 기질 세포의 분리에 대한<em&gt; 체외</em&gt; 탈락

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...