이 프로토콜은 골수에서 유래하고 조직 인자나 사이토카인에 노출된 적이 없는 자극되지 않은 대식세포를 다량 얻는 것을 목표로 합니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 동물에서 획득한 세포의 수입니다. 올바른 절차를 통해 약 2 배 10에서 7 대 대식 세포의 거듭 제곱을 얻을 수 있습니다.
이 방법은 세포 생물학, 병리학, 면역학 및 기생충학과 같은 대식세포를 연구하는 다양한 분야의 연구원들에게 도움이 될 수 있습니다., 세포는 항상 오염에 취약하기 때문에 모든 멸균 단계에 주의를 기울이고 세포 생존력을 유지하기 위해 층류 생물 안전 캐비닛을 사용해야 합니다. 절차를 시연하는 것은 Izabela Aparecida de Souza입니다. 우리 연구실의 석사 학위 학생입니다.
적절하게 안락사 된 8 주 된 C57BL / 6 야생형 수컷 마우스에 대한 절차를 시작하려면 마우스를 70 % 에탄올 용액에 담그십시오. 멸균 가위를 사용하여 복부를 따라 1cm를 절개하고 뒷다리 근육이 완전히 노출될 때까지 피부를 제거합니다. 그런 다음 대퇴골과 경골을 부러뜨리지 않고 엉덩이 높이에서 뒷다리를 조심스럽게 제거합니다.
손상되지 않은 뒷다리를 70% 에탄올 용액이 들어 있는 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다. 층류 생물 안전 캐비닛 내부에서 분리된 다리를 70% 에탄올에서 멸균 PBS로 옮깁니다. 집게와 소독용 물티슈를 사용하여 붙어있는 모든 근육과 근막을 제거하여 뼈를 청소합니다.
그런 다음 멸균 수술용 메스 칼날을 사용하여 양쪽 끝의 골단을 절단하여 골수를 노출시킵니다. 20밀리리터 주사기에 2% 페니실린 스트렙토마이신 용액이 보충된 10밀리리터의 멸균 PBS를 채우고 26게이지 바늘을 연결합니다. 한 손으로 해부학적 해부 겸자를 사용하여 뼈를 잡습니다.
다른 손을 사용하여 뼈를 부수지 않고 조심스럽게 바늘을 골강에 삽입하십시오. 그런 다음 PBS로 뼈 내부를 씻어내고 멸균 원추형 원심분리기 튜브에 골수를 채취합니다. 세척이 끝나면 골강이 하얗게 보여야 합니다.
수집된 세포를 300G, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1밀리리터의 DMEM/F1210 배지에 재현탁시킵니다. 현탁액을 균질화하고 9밀리리터의 매체를 더 추가하여 총 부피를 10밀리리터까지 만듭니다.
100 밀리리터 x 20 밀리미터 크기의 10개의 원형 플라스틱 페트리 접시 각각에 전구 세포 현탁액 1밀리리터를 추가합니다. 균일한 분포를 얻기 위해 피펫으로 플레이트 전체에 세포를 펼칩니다. 그런 다음 각 접시에 L929 세포 상층액 20%가 보충된 DMEM/F1210 9밀리리터를 추가합니다.
섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 접시를 배양합니다. 셋째 날에는 각 접시에 L929 세포 상층액 20%가 보충된 DMEM/F1210 배지 10mL를 추가합니다. 각 접시에 함유된 20mL의 배양 배지는 성숙할 때까지 세포 성장에 충분합니다.
모든 배양 접시에서 상청액을 버리십시오. 각 배양 접시에 10mL의 멸균 마그네슘 및 무칼슘 PBS를 세척하고 섭씨 37도로 예열하고 세척 후 용액을 버립니다. 각 접시에 섭씨 37도로 예열된 3ml의 비효소 세포 해리 용액을 추가합니다.
섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 도립 현미경을 사용하여 대식세포가 세포 배양 접시에서 분리되는지 여부를 시각화합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 비효소 세포 해리 용액으로 접시를 세척하고 원형 운동을 반복적으로 수행하여 완전한 대식세포 해리를 보장합니다.
모든 배양 접시의 용액을 수집하여 50밀리리터 원뿔형 원심분리기 튜브에 결합합니다. 한 번 더 10ml의 멸균되고 미리 데워진 PBS를 빈 배양 접시에 추가합니다. 결합된 수집된 용액이 포함된 원추형 튜브를 300G, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.
상층액을 버리고 DMEM/F1210 1밀리리터로 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포를 손상시키지 않고 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 현탁액을 천천히 조심스럽게 균질화합니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세기 위해 10 마이크로리터의 트리판 블루를 첨가하여 대식세포 용액의 10마이크로리터 부분 표본을 희석합니다.
일곱째 날에는 각 접시에 약 200만 개의 대식세포가 생성됩니다. L929 상층액의 대식세포 집락 자극 인자에 노출되면 골수 전구세포가 점차적으로 성숙한 대식세포로 변형되어 세포질 확장으로 인한 전형적인 퍼진 형태를 보였습니다. 셋째 날에는 몇 개의 미성숙한 대식세포가 나타났으며, 막 돌기가 거의 없는 전형적인 둥근 형태를 가지고 있습니다.
비록 그들이 전체 과정에 걸쳐 변화하긴 했지만, 적절한 수와 성숙도를 달성하는 데 7일이 필요했다. 얻어진 대식세포는 유세포 분석 분석에서 크기와 입도면에서 균일한 개체군을 보여주었습니다. 또한, 집단의 100%가 특징적인 F480 및 CD11B 표면 분자를 발현하여 잘 정의된 단일 세포 집단을 형성했습니다.
성숙하고 잘 분화된 대식세포의 식세포작용 능력은 대식세포 내부의 식세포제 Leishmania 주요 기생충을 보여주는 형광 현미경 이미지에 의해 확인되었습니다. 다리는 멸균되지 않은 환경에서 수행되며 가장 중요한 오염원이기 때문에 동물로부터 조심스럽게 제거해야 합니다. 다리는 층류 생물 안전 작업대 외부에서 부러지지 않아야 합니다.
이 프로토콜로부터 수득된 골수 유래 대식세포는 대식세포 생리학을 이해하기 위해 연속적으로 시험관 내 대식세포 분극을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
