우리는 Gerbren 제이콥스와 Jurjen Broeke Prisca 리사 Gasparotto 생성 및 두 개의 제어 iPSC 라인의 특성을 보여주는 우리의 절차에 대 한 기여에 대 한 Leferink를 그들의 전문 기술 지원에 대 한 감사.

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저자는 공개 없다.

복잡성 및 비용 요인이 관련 줄기 세포 연구자 선택 또는 분화 프로토콜을 개발 하는 경우입니다. 그것은 얼마나 많은 외부 컨트롤 원하는 세포 유형, 생성 하는 데 필요한의 미결 문제 이것은 특히 사실 이다 또는-다르게 포즈-얼마나 유능한 hPSCs 생산 하는 그들의 자신의 개발 환경에 두고 자신에 게 충분 한 경우 영양소입니다. 체 외에 외적 요인의 소개 아주 잘 원하는 셀 제품을 생산할 수 있습니다 하지만 그들은 또한 방해 수 내장 발달 용량 세포 vivo에서전시는 것 이다. 그런 고려는 목표는 질병 모델링 환자 파생 Ipsc의 사용 하는 경우에 특히 중요 하다. 패턴화 성장 요인의 광범위 한 사용 질병 고기 마스크 수 있습니다. 이 보고서에 대 한 자세한 프로토콜 복잡성, 비용, 또는 모방 하는 외부 요인8,9의 사용을 줄이기 위해 이전 연구의 추세에 따라.
그것은 이전 연구 다 vivo에서 조건 재현 공동된 노력 없이 소 뇌 운명 향해 차별화를 달성 하는 것은 나타납니다 보고 Muguruma 그 외 여러분, 그리고 우리 자신의 최근 연구 결과 바탕으로, 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. 흥미로운 점은 두 연구 모두 사용 FGF2 어느 설정 필요, 했다 제안 성장 요인의 다른 세트를 사용. 우리 도망 추가 테스트, 어디 FGFs 선택적으로 프로토콜을에서 제외 되었고 셀 외부 FGFs10없이 동일한 제품을 생성할 수 있는 것으로 나타났다. 우리의 연구 간의 차이 사실 우리가 다른 hPSC 라인과 문화 방법을 사용, RA, 신경 감 별 법을 유도 하 고과 립 세포 생존과 성숙 (BDNF GDNF, SAG, KCL)을 지 원하는 구성 요소를 포함 하 여 한정 했다11 -14. 또한, Muguruma 그 외 여러분에 비해 덜 복잡 한 시작 방법 채택 되었다. 그들의 프로토콜 96WPs, 그들에 게 서로 다른 물리적 및 화학적 절연에 균일 한 EBs를 생성 하 여 시작 했다. 여기에 프로토콜 모든 PSCs 상대적으로 EB 형성, 자유롭게 상호 작용 하도록 허용 하는 동안 6WPs에서 함께 혼잡 했다. 어떻게이 수 있습니다. 차동 영향을 EBs와 나중에 organoids (를 포함 하 여 신호 화합물의 본질적인 생산)의 물리적, 화학적 환경 알, 그리고 탐험 될 수 있습니다. 또한, 우리의 식을 표시 하는 동안 유전자 연관-그래서의 암시-형태학 상으로 비슷한 구조 내에 있는 소 뇌 근원 보고 Muguruma 그 외 여러분, 우리 제외할 수 없습니다 같은 신경의 구조는 소 뇌 비 정체성의 있습니다. 미래 연구, Muguruma 그 외 여러분 보고 그 같은 항 체의 대형 패널을 사용 하 여 (즉, ATOH1, CALB, 등) 같은 할당 및 비교 더 결정적인 두 프로토콜의 제품을 만들 것입니다.
3D 프로토콜 내에서 중요 한 시작 이며 셀 문화 분석에 대 한 최종 제품의 충분 한 숫자를 보장 하기에 충분 한 수를 유지 합니다. EBs/잘 문화 (그림 1)에서 첫 3 일 동안 500 이상 부터는 감안할 때 상당한 죽는 일찍 프로토콜, 좋습니다. 이 hPSCs 지류 무료 문화에 대 한 주어진된 식민지 크기를 달성 하기 어려울 수 없습니다 하지만 여전히 급지대 종속 방법을 사용 하 여 그에 대 한 쉽지 않을 수도 있습니다. 셀의 많은 수를 감안할 때, 매체 (pH 변화를 나타내는), 그리고 죽은 세포의 축적에서 색상 변경에 대 한 감시에 중요 하다. 두 문화권의 붕괴를 방지 하기 위해 수정 해야 합니다. 도 있을 수 있습니다 셀 및 집계의 응집으로 대규모 구조. 비록 아직도 분석 될 수 있다 집계 될 수도, 제품 수량 줄어들 것입니다 크게, 그래서 부드러운 분쇄와 작은 집계에 그들을 깨는 유용할 수 있습니다. 그러나, 방해 일반 집계를 피하기는 스스로 성장할 수 있는 큰 크기 (그림 4). 집계 될 경우 너무 스파스, 집계는 완전히 격리 된 있도록 웰 스를 결합 하는 것이 좋습니다. 제품 다양성 (숫자, 크기 및 형태)은 3 차원 세포 배양, 덜 복잡 한 시작 프로시저 (예: 여기에 설명 된 프로토콜 절연, 균일 한 EB 형성 단계, 제안 하는 시작 하는 이러한 프로토콜에 대 한 포함 한 잘 알려진 문제 ) 더 실용적인8,15수. 이 연구자 명심, 특히 분석, 중 필요가 뭔가 보고 프로토콜 제품 다른 3D 프로토콜8,,915에서 발견 된 일치를 생성. 크기와 형태에 따라, 그들은을 신경 근 엽의 범위 안에 대뇌 organoid Kelava 및 랭 커스터15, 회전 타원 체의 분류를 피팅 하는 가장 최근의 리뷰에 설명 된 대로. 특히 주목할 만한 3D 구조의 존재를 루멘, (하위) 심 실 영역와 마름모꼴-입술 기능 같은 신경 근 엽의 암시는 (그림 5 와 그림 6) 구분으로 다른 그룹8 , 15 , 16 , 17. 모든 실험에서 이상 생산 이후 putative VZ/SVZs와 소 뇌 관련 마커 (ZIC1, KIRREL2), 집계 그는 RL 같은 우리의 프로토콜을 사용 하 여 3D 차별화의 성공 결정을 위한 유용한 기준 추가 지원을 제공 하는 기능. 과거 35 일 문화의 길이 연장 하지 테스트, 하지만, 복잡성, 성장과 성숙이이 기술에 의해 허용의 최대 범위를 결정 하 추진 수 있습니다.
2D 프로토콜 3D 프로토콜로 같은 비 부착 EB 형성 및 신경 유도 과정을 사용 하 고 그래서 위의 코멘트에도 적용. 도금, 일단 고려의 다른 세트는 고려 되어야 한다. EBs는 접시에 바깥쪽에 셀에 대 한 신속 하 게 준수 해야 합니다. 준수, RI (해당 되는 경우 이미 사용)의 추가 문제가 매체의 볼륨 감소 또는 PLO/램 농도 실험 변경 적용 될 수 있습니다 경우. 세포 성장에서 너무 조밀한 또는 스파스 (20-80 %confluency 사이 성장 선호)로 유지 하는 것이 중요 하다 우물; 일일 모니터링 및 적시 뿌리고 오버-confluency 또는 부동 셀을 피하기 위해 중요 하다. 3D 프로토콜 달리 거기 해서는 안됩니다 상당한 죽는 문화 중의 가난한 성장, 지역 또는 확산 속도 둔화 될 수 있습니다. 뿌리고 (예: 셀 프로세스와 셀 사이의 개발된 네트워크 제거) 세포의 성숙 상태에 영향을 하 고 포인트 셀을 수집 것 이다 또는 어떤 방식으로 분석 접근 하는 때 염두에 보관 해야 합니다. 예를 들어 칼슘에 대 한 그것을 이미징 분석 2-6 일전 사이 통로 세포에 매우 중요 하다. 너무 가까이 뿌리고 분석 셀에 연결 하는 시간이 없 또는 성숙, 그리고 너무 멀리 셀과 밀, 이미징 어렵게 될 수 있습니다 의미할 수 있습니다. 실험 사이 변이 있을 수 있지만 결과 그 초기 2D 소 뇌 프로토콜1,2보고와 일치. ICC 얼룩 및 유전자 표정 분석 또한 식별 하는 표식 (그림 7 , 그림 8) 다른 신경 및 소 뇌 id와 관련 된과 립 세포 마커 ZIC1에 대 한 긍정적인 세포의 존재를 확증. 칼슘 이미징, 세포 fluor5 염료와 incubated의 전기 자극을 포함, 기능 신경 활동 (그림 9, 보충 그림 1, 그림 2 보충), 표시는 확인 되지 않고 있지만 이러한 과 립 세포를 했다. 그것은 arguable 함으로써 세포 더 많은 시간 과거 35 일 문화의 길이 확장 하 여 성숙, 기능 신경 활동의 양을 증가 한다. 이 잠재적인 나중에 탐험 수 있습니다.
위에 제안 하는 연구의 라인 이외 것 제품 id (수량 및 품질) 차이 결정 하는 관심의 2D 및 3D 프로토콜 사이. 외부 FGFs의 중요성은 2D 프로토콜에서 테스트 하지 및 알고 도움이 될 것 이라고 후 도금, 3 차원 구조의 부족 그리고 그래서 관련된 신호 경로 만들 것 이다 2D 문화 다소 일찍 화합물을 패턴화에 의존. 축소 된 기본 프로토콜 (예, RA, BDNF SAG)은 동등 하 게 그럴듯한 추가 조사에 대 한 됩니다. 마지막으로, 미래의 연구는 새로운 연구 및 도구를 더 나은 특성 (발전 효율의 평가)에서 유익할 수 있습니다 특정 인간 소 뇌 신경 하위.
마음에 주어진된 주의 둘 다 보고 프로토콜 소 뇌 차별점, 다른 목적에 적합 한 제품으로 사용 될 수 있습니다. 그들은 셀 라인 같은 차별점 또는 타겟된 신경 감 별 법의 다른 유형에 대 한 기본 모델의 생존 능력을 테스트, 파일럿 연구를 수행 연구원에 대 한 실질적인 출발점으로 봉사 할지도 모른다.

처음 소 뇌 혈통으로 hPSCs를 차별화 하는 데 체 외에서 프로토콜 vivo에서 소 뇌 개발1,2,,34를 흉내 낸의 원리에 운영 한다. 이와 같이, 그들은 프로-소 뇌 패턴 및 성숙에 특정 시간에 도입 요인의 승계 요구. 이러한 가운데 최고 morphogenetic 단백질 (BMPs), 그리고 섬유 아 세포 성장 인자 (FGFs) 중간 hindbrain 개발 및 isthmic 주최자5,,67의 형성에서 알려진된 역할 뼈 WNT, 했다. 물론, 각 추가 단계 및 요소는 연구원에 대 한 노동 집약적인 조작 및 큰 비용의 증가 의미 하 고 그래서 동등한 결과 달성 가능한 간단한 프로토콜 개발 관심입니다. 그들의 개발 시험관같은, 외부 제어를 필요로 하는 셀 든이 실제적인 문제 가상 질문으로 멋지게 dovetails.
소 뇌 차별화, 2015 년에 출판 하는 프로토콜 목적8패턴화 FGF2, FGF19, 및 stromal 세포 파생 요소 1 (SDF1)만 사용 하 여 성장 요인의 광범위 한 번호를 사용 하 여의 필요성을 해결. 이 연구는 또한 자유 롭 뜨 3D 문화 시스템을 사용 하 여 이전 소 뇌 프로토콜에서 달랐다. 소 뇌 표식에 대 한 긍정적인 세포를 생산, 이외에 두뇌 "organoids" 그들의 기술에 의해 생성 된 관련 형태학, 마름모꼴 입술 모양의 구조와 같은 전통적인 2D 단층 문화에서 사용할 수 없는 전시를 표시 했다. 비록 덜 복잡 하 고 비용이 많이 드는 성장 요인, 유니폼 embryoid 몸 (EBs)와 96 잘 접시 (96WPs), 문화 형성 등의 기능에 관하여 했다 절차 복잡 한 초기 단계. 또 다른 3D 프로토콜 같은 해 출판, 일반적이 고 저렴 한 셀 문화 기술9를 사용 하 여 신경 계보에 성공적인 차별화를 보고. 비록이 그룹 소 뇌 차별화 보다 대뇌 피 질의 조사, 소 뇌 차별화에 대 한 그들의 개념의 응용 프로그램 할인 하지 수 없습니다.
우리는 최근 보고 패턴화 요인의 감소 된 수를 사용 하 여 3D 소 뇌 분화 프로토콜 (즉, FGF2, 4, 및 8), 중간 요구 사항10을 최소화 하기 위해 전체 6 잘 플레이트 (6WPs)에서 세포를 유지 하 여 간소화 된 설치 뿐만 아니라. 과 립 세포의 생산을 돕기 위해, 흐려져 주 작동 근 (SAG) 최종 성숙 단계 동안 사용 되었다. SAG 소닉 고슴도치 (쉬), 이전 소 뇌 프로토콜과 립 세포 선구자 (GCPs) vivo에서1,2, 의 성장을 촉진 하는 역할 때문에 사용 했다 보다 적게 비싼 화학 대안입니다 11,,1213. 차별화 제품 형태학 상으로 관련 구조8,9소 뇌 관련 마커의 존재를 포함 하 여 다른 3D 프로토콜에서 그와 일치 했다. 이러한 결과 강화 흉내 상세한 이전 메시지는 vivo에서 의 환경 복잡 한 3 차원 체 외에서 분화 프로토콜에 필요한 않을 수 있습니다.
3D 프로토콜 외에도이 보고서에 설명 합니다 같은 빠른 설치, 기본 재료, 설계 2D 프로토콜 및 성장 요인의 수를 감소. 표식에 대 한 긍정적인 조기와 관련 된, 그것은 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 셀 수 또는 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 소 뇌, 신경 및과 립 세포 id. 또한, 칼슘 이미징 기능 인간의 뉴런의 존재를 나타냅니다. 프로토콜 중에서 선택할 수 중 하나에 관심이 연구원에 대 한 유연성의 수준을 추가: (1) 생성 특정 세포 유형, 모델링 (2) 인간의 두뇌 개발 및 구조, (3) 분석 단층에서 최적화 된 관련 설정 (예를 들어, 패치 클램프 기록), 또는 혼합 신경 문화에서 (4) 세포 세포 상호 작용. 그들의 간단 하 고 저가 자연 적합 그들 액세스할 수 연구자의 hPSC 필드에 새로 또는 기본 hPSC 절차에서 더 차별화 옵션 필요 합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12+Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td>glutamine fortified DMEM/F12</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>neural basic medium</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Imgen</td><td>PT468-B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Poly (2-hydroxyethyl methacrylate)</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>aka Poly-Hema</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>E8 medium and supplement</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>hPSC medium and supplement</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>y-27632 (ROCK inhibitor)</td><td>SelleckChem</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)</td></tr><tr><td>0,5M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>0.2 um filter</td><td>VWR</td><td>28145-77</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tube</td><td>VWR</td><td>525-0130</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>83804360</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM996</td><td>wrap for culture plates</td></tr><tr><td>cryotubes</td><td>ThermoFisher</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td>trypsin-based dissociation agent</td></tr><tr><td>Defined Trypsin Inhibitor (DTI)</td><td>Gibco</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>FGF-4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>FGF-8B</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic Acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Brain Derived Neurotrophic Factor</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Glial Derived Neurotrophic Factor</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrophic Factor 3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Smoothened Agonist (SAG)</td><td>Cayman</td><td>11914</td><td>CAS 912545-86-9</td></tr><tr><td>Axiovert 40C microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Brightfield imaging microscope</td></tr><tr><td>Axiocam</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Brightfield imaging - image aquisition</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>521-0996</td><td>centrifuge for cell culture</td></tr><tr><td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td><td>Braun Medical</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serological pipets</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serological pipets</td><td>VWR</td><td>612-4951</td><td></td></tr><tr><td>6-wells culture plates</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>12-wells culture plates</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>hESCs</td><td>WiCELL</td><td></td><td>line H01</td></tr></tbody></table>

streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification

복잡성과 분화 프로토콜의 비용을 감소 하는 것이 연구자에 대 한 중요 합니다. 이 관심이 모방 하는 외부 요인 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로 두뇌 개발 또는 이상, 질병 표현 형을 마스킹 등의 모델 소개 수 있습니다 가능한 의도 하지 않은 효과 대 한 우려와 맞는. 여기, 우리 hPSCs, 소재 요구 사항 이전 프로토콜 보다 덜 간단한 시작 방법, 적은 패턴 요소와 설계에 대 한 두 개의 소 뇌 분화 프로토콜을 제시. 최근, 우리 문화 절차, 형태학 등 하위/심 실 영역-두뇌 개발 모델링 관련 및 마름모꼴을 포함 한 다른 뇌 "organoid" 프로토콜 일치 부동성 3 차원 (3D) 제품을 생성 하는 개발 입술 모양의 구조입니다. 두 번째 제품 소 뇌 관련 된 표식에 대 한 긍정적인 고 신경 같은 칼슘 유입 전시 기능 소 뇌 신경 세포를 생성할 수 표시 되는 완전 한 차별화를 부착, 2 차원 단층 프로시저를 사용 합니다. 함께, 이러한 프로토콜 테스트 유선형된 신경 차별점의 기본 모델 뿐 아니라 다른 연구 목적에 적합 한 옵션 선택 과학자를 제공 합니다.

감소 된 성장에 대 한 시각적 개요는 2D 및 3D 소 뇌 분화 프로토콜 요소 그림 1 에서는 2D 및 3D 소 뇌 분화 프로토콜에 대 한 전체 일정 외적 요소와 도금의 시간. HPSCs 3D 소 뇌 차별화 진행에 대 한 일반적인 진행 그림 2에 표시: hESC 라인 h01-식민지로 시작 하는 피더 무료 문화에 0에서 (그림의 왼쪽 위); 하루 2 (위 가운데); EB 형성을 겪고 다음 주 14 (오른쪽 위);에서 RA와 FGF8 신경 유도 명백한 루멘과 더 큰 셀 집계로 성장 다양 한 크기와 모양 하루 28 (왼쪽 아래);의 집계를 형성 하루 28 (아래 가운데);에 표시 단일 집계의 다른 구조와 복잡성에 개발 고와 (오른쪽 아래) 하루 35에서 동일한 구조를 형태학 상 변화를 계속 했다. 2D 소 뇌 차별화를 진행 하는 hPSCs에 대 한 일반적인 진행은 그림 3에서 묘사: hESC와 피더 무료 문화 날 0 (hESC 식민지 가운데 차별화 된 셀의 영역을 나타내는 동그라미 그림의 왼쪽 위)에 식민지로 h01-라인 ; 하루 2 (위 가운데); EB 형성을 겪고 다음 날 13 (오른쪽 위);에서 RA와 FGF8 신경 유도 명백한 루멘과 더 큰 셀 집계로 성장 (왼쪽 아래); 주 14에서 도금 후 부착 세포로 확산 그리고 하루 35 낮은 (더 낮은 중간) 및 고배율 (오른쪽 아래)에 더 많은 복잡 한/성숙한 형태를 가진 세포의 단층으로 다음.
3D 제품 전시 마커 및 초기 Neuroepithelium의 구조 그림 2 (아래 왼쪽된 이미지) 그림 4 확률적 병합 뿐 아니라 성장 및 성숙 속도, 변화 또는 집계의 떨어져 깨고 경작을 통해 본 3D 집계 형태가 고. 이에 불구 하 고 각 차별화 immunocytochemistry (ICC) 그림 5에 얼룩으로 소 뇌과 립 마커 ZIC1을 포함 한 초기 신경 및 신경 마커를 전시 하는 집계를 생성 합니다. 더 중요 한 것은, 그림 5 와 그림 6 간단한 3D 문화, 감소 성장 요인, 초기 neuroepithelium 마름모꼴 입술 등 두뇌 개발에 관련 된 복잡 한 구조와 집계를 생성할 수는 건의 한다.
2D 제품 전시 소 뇌 마커 및 기능 신경 활동 2D 문화는 복잡 한 3 차원 구조를 재현할 수 없는, 그들은 ICC 얼룩 그림7에서에 표시 된 대로 소 뇌과 립 세포 마커 ZIC1을 포함 한 초기 신경 및 신경 마커를 전시 하는 세포를 생성할 수 있습니다. RT-PCR을 통해 유전자 표정 분석 그림 8에서 보듯이 비록 초기과 립 세포 마커 ATOH1 의 존재는 변수를 실험과 라인 사이의 ICC 얼룩 결과 지원 합니다. 칼슘 이미징 2D 문화에 더 쉽게 처리 됩니다. 그림 9, 보충 비디오 1및 추가 비디오 2에서 보듯이 전기적 자극된을 세포 신경 발사 패턴, 기능적 뉴런의 생성 제안의 전형적인 칼슘 유입 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> 그림 1: 차별화 프로토콜 (차별화의 하루 0에서 시작)의 타임 라인. 실선 상자는 특정 요소 문화 매체에 추가 하 고 점선 상자 표시 판-코팅 옵션 2D 수정에 대 한 나타냅니다. FGF2, 아래쪽 화살표는 낮은 농도 (4 ng/mL), 참조 및 위쪽 화살표는 높은 농도 (20 ng/mL)를 말합니다. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> 그림 2: 3D 프로토콜의 대표 명시 이미지. d0, d2에서 EBs에서 hESC 식민지 유도 d14, 다양 한 크기와 형태 (번호 1-5) d28, d28에 독특한, 식별 기능 (문자는 는-c로 표시)와 단일 집계의 집계에 따라 집계 및 d35에 동일한 기능에서 볼 수 변경 됩니다. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> 그림 3: 2D 프로토콜의 대표 명시 이미지. hESC 식민지 d0, d2에서 EBs 20 x 확대 및 확대, x 5에서 보듯이 d35에서 성숙 후 d14에서 집계를 도금 후 d13에서 유도 후 집계 합니다. 상단 왼쪽된 패널에서 백색 원형 hESC 식민지 가운데 차별화 된 셀의 영역을 표시합니다. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> 그림 4: 3 차원 문화에 다양 한 크기와 복잡성을 보여주는 명시 이미지. (A) 주 8에서 집계 (hESCs), 및 (B) d35 (hiPSCs). 후자의 이미지 전체 집계 표시 하려면 세 가지 별도 이미지 구성 됩니다. 두 집계 작은 집계 또는 (속보) 구조의 손실의 병합에 의해 영향을 받은 수 있습니다. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 재 공포. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> 그림 5: 3D 제품의 ICC 이미지 표시 관련 마커 및 구조. 문화 d35에 3D 제품 전시: PAX6 (녹색) 및 신경 장미 같은 대형의 루멘으로 (빨강) TBR2 (첫 번째 행); DCX (녹색) 및 외부 가장자리 심 실 영역 (VZ)에서 확산 NeuN (레드)-같은 구조 (두 번째 행); KIRREL2, neuroepithelium 소 뇌와 관련 된 마커 (3 행, 왼쪽); 그리고 ZIC1는 마커 관련 된 소 뇌과 립 세포 (오른쪽 세 번째 행). 여러 번 사용 하 여 4 개의 다른 hPSC 라인 실험 실시: hESC 라인 h01-(n = 5), 및 iPSC 라인 hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), 및 hvs51 (n = 1). 화살표 마름모꼴 입술 (RL)을 가리킨-구조와 같은. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 재 공포. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> 그림 6: 3D 제품에서 대규모 심 실 영역 같은 구조. 문화 d35에서 hESC 파생 집계 PAX6 (녹색) 및 TBR2 (적색) 일반적으로 관련 된 심 실 영역 (VZs) 및 subventricular 영역 (SVZs) 에서 vivo에서 발견 하는 초기 뉴런에 대 한 긍정적 이다. (맨 위) 별표 (*) 표시 VZ 같은 지역 괄호 VZ의 깊이/부서를 나타내는 집계의 가장자리를 따라 실행의 꼭대기 쪽 / SVZs. (중간) 결합 된 신호 표시 PAX6 흩어져 섹션 + TBR2-셀 상단 오른쪽 끝으로 크기에서 증가 하 고 VZ. (아래) 중간 패널에 사각형으로 표시 된 섹션의 높은 확대 이미지. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림은 홈즈와 하이 네10에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> 그림 7: 2D 제품의 ICC 이미지 표시 관련 마커. 문화 d35에서 2D 제품 전시, hESCs (위쪽 행)와 hiPSCs (아래쪽 행), 셀에 대 한 긍정적인:과 립 세포 마커 ZIC1 및 철새 소 뇌 신경 마커 TAG1 (왼쪽 열); 그리고 신경 마커 neurofilament (NF)와 TAG1 (오른쪽 열). 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> 그림 8: 2D 제품의 RT-PCR. h01-hESC 선의 mRNA 표정 분석 (위쪽 행)와 hiPSC 라인 hvs60 (아래쪽 행)는 2D의 끝에 프로토콜 제품에 젤 전기 이동 법을 보여줍니다:과 립 세포 마커 ZIC1과 립 세포 마커 ATOH1, 철새 소 뇌 신경 마커 TAG1, Purkinje 셀 표식 Calbindin (CALB), 전압 종속 칼슘 채널 CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), 감마-aminobutyric 산 (GABA) B 수용 체 1 (G-Br1), 및 내부 관리 유전자 EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> 그림 9: 칼슘 이미징/2D 제품의 분석. 문화 d35에 hPSC 차별화 제품 fluor5 염료를 가진 외피 후 현미경, 2 분 동안 기록 되었다. 30 s, 셀 10 전기 자극 했다 s에서 10 Hz. (A) 스틸 이미지 보기 hESCs 0에서 s (왼쪽)와 30에서 전기 자극의 시작 후 s (오른쪽). 화살표 (ROI) 칼슘 유입의 분석에 대 한 관심의 영역을 나타냅니다. 투자 수익에 대 한 시간 대 상대 형광에 (B) 그래픽 분석 표시 변경 (형광 변화 = (F F0) /F0, 어디 F0 = (∑F1-n) / n), 신경 같은 급격 한 발생 하기 전에, 도중, 그리고 후 자극입니다. 검정색 막대는 전기 자극의 길이 나타냅니다. (화이트) 바 규모 50 µ m. 전체 기록에 대 한 hESC (로 여기에 본) 하 고 (표시 되지 않음)는 hiPSC 라인 보충 비디오 1 , 비디오 2 보충, 각각 =. 녹음 4 배속에서 AVI 형식으로 되어있습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 비디오 1: 칼슘 hESC 선에서 h01-2D 제품의 비디오 이미징. 문화 d35에 h01-현미경, 아래 2 분 fluor5 가진 외피 후 기록 하는 hESC 선에서 차별화 제품 염료. 30 s, 셀 10 전기 자극 했다 10 Hz. 녹음에 s 2 프레임/s에서 되었고 ~ 7 프레임/s, ~ 30 지속 비디오에서 AVI 비디오로 처리 ~ 4 배속에서 s. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 비디오 2: 칼슘 hiPSC 라인 hvs51에서 2D 제품의 비디오 이미징. 문화 d35에 hiPSC 라인 hvs51에서 차별화 제품 fluor5 염료를 가진 외피 후 현미경, 2 분 동안 기록 되었다. 30 s, 셀 10 전기 자극 했다 10 Hz. 녹음에 s 2 프레임/s에서 되었고 ~ 7 프레임/s, ~ 30 지속 비디오에서 AVI 비디오로 처리 ~ 4 배속에서 s. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

우리 간단한 3D 차별화를 사용 하 여 hPSCs에 대 한 프로토콜 정의 매체를 설명 하 고 초기 neuroepithelial 구조와 셀 집계를 생성할 수와 소 뇌 관련 표식으로 옵션에 대 한 긍정적인 성장 요인 감소 기능적 뉴런을 생성 하는 단층으로 셀을 차별화 하는 데 2D 수정.

효율적인된 3D 소 뇌 분화 프로토콜 옵션 2D 수정

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K 조회수.  VU University Medical Center. 우리 간단한 3D 차별화를 사용 하 여 hPSCs에 대 한 프로토콜 정의 매체를 설명 하 고 초기 neuroepithelial 구조와 셀 집계를 생성할 수와 소 뇌 관련 표식으로 옵션에 대 한 긍정적인 성장 요인 감소 기능적 뉴런을 생성 하는 단층으로 셀을 차별화 하는 데 2D 수정.

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Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

연구

신경과학

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

이외에 Microdissection에 의해 개발 소뇌 차별화 된 세포 집단의 분리

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

발생학

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can trigger cerebellar dysfunction. Most of the current knowledge about disease-related neuronal phenotypes is based on postmortem tissues, which makes understanding of disease progression and development difficult. Animal models and immortalized cell lines have also been used as models for neurodegenerative disorders. However, they do not fully recapitulate human disease. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have great potential for disease modeling and provide a valuable source for regenerative approaches. In recent years, the generation of cerebral organoids from patient-derived iPSCs improved the prospects for neurodegenerative disease modeling. However, protocols that produce large numbers of organoids and a high yield of mature neurons in 3D culture systems are lacking. The protocol presented is a new approach for reproducible and scalable generation of human iPSC-derived organoids under chemically-defined conditions using scalable single-use bioreactors, in which organoids acquire cerebellar identity. The generated organoids are characterized by the expression of specific markers at both mRNA and protein level. The analysis of specific groups of proteins allows the detection of different cerebellar cell populations, whose localization is important for the evaluation of organoid structure. Organoid cryosectioning and further immunostaining of organoid slices are used to evaluate the presence of specific cerebellar cell populations and their spatial organization.

This protocol describes a dynamic culture system to produce controlled size aggregates of human pluripotent stem cells and further stimulate differentiation in cerebellar organoids under chemically-defined and feeder-free conditions using a single-use bioreactor.

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

생체공학

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, disruption in cerebellar development has been implicated in many neurodevelopmental disorders, including autism, attention deficit-hyperactivity disorder (ADHD), and schizophrenia. Investigations of cerebellar development in humans have previously only been possible through post-mortem studies or neuroimaging, yet these methods are not sufficient for understanding the molecular and cellular changes occurring in vivo during early development, which is when many neurodevelopmental disorders originate. The emergence of techniques to generate human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells and the ability to further re-differentiate iPSCs into neurons have paved the way for in vitro modeling of early brain development. The present study provides simplified steps toward generating cerebellar cells for applications that require a 2-dimensional (2D) monolayer structure. Cerebellar cells representing early developmental stages are derived from human iPSCs via the following steps: first, embryoid bodies are made in 3-dimensional (3D) culture, then they are treated with FGF2 and insulin to promote cerebellar fate specification, and finally, they are terminally differentiated as a monolayer on poly-l-ornithine (PLO)/laminin-coated substrates. At 35 days of differentiation, iPSC-derived cerebellar cell cultures express cerebellar markers including ATOH1, PTF1&#945;, PAX6, and KIRREL2, suggesting that this protocol generates glutamatergic and GABAergic cerebellar neuronal precursors, as well as Purkinje cell progenitors. Moreover, the differentiated cells show distinct neuronal morphology and are positive for immunofluorescence markers of neuronal identity such as TUBB3. These cells express axonal guidance molecules, including semaphorin-4C, plexin-B2, and neuropilin-1, and could serve as a model for investigating the molecular mechanisms of neurite outgrowth and synaptic connectivity. This method generates human cerebellar neurons useful for downstream applications, including gene expression, physiological, and morphological studies requiring 2D monolayer formats.

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

The present protocol explains the generation of a 2D monolayer of cerebellar cells from induced pluripotent stem cells for investigating the early stages of cerebellar development.

2D 구조에서 체 외에서 인간 소뇌 발달 모델링

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

생물학

Cranial Neural Crest Cells Three-Dimensional In Vitro Differentiation Protocol for Multiplexed Assay

With their remarkable capacity to generate both ectodermal and mesenchymal derivatives, cranial neural crest cells (CNCC) have attracted a lot of interest in studying the mechanisms regulating cell fate decisions and plasticity. Originating in the dorsal neuroepithelium, this cell population is transient and relatively rare in the developing embryo - making functional tests, genomic screens, and biochemistry assays challenging to perform in vivo. To overcome these limitations, several methods have been developed to model CNCC development in vitro. Neurosphere (NS) based culturing methods provide a complex microenvironment that recapitulates the developing anterior neuroepithelium in 3D. These systems allow the growth of many NS in the same plate to generate a large amount of CNCC, but the produced NS present a high variability in shape, size, and number of CNCC formed - making quantitative assays difficult to perform. This protocol outlines a reproducible method for generating NS from mouse embryonic stem cells (mESC) in a 96-well format. NS generated in 96-well plates produce cranial neural crest cells (CNCC), which can be further cultured. By controlling the number of starting cells, this approach reduces variability in the size and shape between NS and increases reproducibility across experiments. Finally, this culture system is adaptable to several applications and offers a higher degree of flexibility, making it highly customizable and suitable for multiplexing experimental conditions.

We present a three-dimensional (3D) in vitro differentiation protocol generating neurospheres of reproducible size to produce cranial neural crest cells from mouse embryonic stem cells. We show that this methodology reduces variability compared to previous protocols and how it can be used for multiplexed assay to study cranial neural crest cell development.

Cranial Neural Crest Cells Multiplexed Assay를 위한 3차원 In Vitro Differentiation Protocol

With their remarkable capacity to generate both ectodermal and mesenchymal derivatives, cranial neural crest cells (CNCC) have attracted a lot of interest ...

Cerebellum Dissection and Slice Preparation: A Method to Generate Tissue Slices from Mouse Cerebellum

Source: Thetiot, M. et al. <a href="https://www.jove.com/video/59163" target="_blank">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video describes a method to generate tissue slices from the mouse cerebellum. The cerebellar slices can be used for organotypic culturing that provides insights into neurodevelopmental mechanisms, including myelination dynamics.

소뇌 절제 및 절편 준비: 마우스 소뇌에서 조직 절편을 생성하는 방법

Source: Thetiot, M. et al. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. J. Vis. Exp. (2019)
This video describes a ...