여기에 제시된 방법은 산화 스트레스에 의해 유도된 DNA 병변의 정량화를 허용하고, 질병의 예방 및 치료를 위한 표적이 될 수 있는 병리학적 메커니즘의 이해에 기여한다. 선택성과 감도가 주요 장점입니다. 선택성은 복잡한 생물학적 샘플로 작업할 때 필수적인 이점입니다.
HPLC는 질량 분석과 결합하여 생물학적 행렬과 정량화의 이 모형을 위한 금 표준으로 발전했습니다. 산화 스트레스는 다른 병리학 적 과정에 일반적인 이벤트입니다. 에테노 유도관의 증가 수준은 염증성 질병을 가진 환자의 조직 또는 소변에서 검출되었습니다.
DNA 병변은 또한 오염 물질에 노출에 의해 시작 된 내 인 성 이벤트에 대 한 정보를 제공. DNA 병변이 증가하는 경우에, 노출은 암 발달의 리스크를 증가하는 수준에 있을 지도 모릅니다, 예를 들면. 병변은 임의의 세포 시스템에서 DNA에서 정량화될 수 있고 또는 샘플 준비에 적응하는 소변, 혈장, 타액 배양 배지에서 양자화될 수 있다.
먼저 얼음 위에 놓인 배양판을 베이스로 사용하여 메스로 조직을 자른다. 각 50 밀리리터 캡핑 튜브에 1 그램의 조직의 무게를 달아 즉시 사용하십시오. 남은 조직을 마른 얼음 위에 보관한 후 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.
각 튜브에 0.5 밀리머 deferoxamine을 포함하는 상업용 세포 용액의 10 밀리리터를 추가하고 얼음을 유지하십시오. 조직 균질화제를 약 60~90rpm의 저속으로 설정합니다. 용액이 조직 파편이 없을 때까지 얼음에 있는 조직을 몇 분 동안 균질화합니다.
그런 다음 각 균질화 된 샘플에 단백질 AK 용액 150 마이크로 리터를 추가합니다. 반전으로 튜브를 흔들어 하룻밤 동안 실온에서 보관하십시오. 아침에는 40 마이크로리터의 리보누셀리스 A 용액을 추가하고, 반전으로 흔들며, 튜브를 실온에서 2시간 동안 유지합니다.
상업용 단백질 강수액 5밀리리터, 소용돌이, 원심분리기 5밀리리터를 2, 000배, 섭씨 4도에 10분간 추가합니다. 초월체를 차가운 이소프로파놀 10밀리리터를 포함하는 50밀리리터 캡 튜브로 이송합니다. 침전된 DNA의 관측이 될 때까지 튜브를 여러 번 부드럽게 반전시면 됩니다.
끝에 닫힌 파스퇴르 파이펫을 사용하여 침전된 DNA를 수집합니다. 수집된 DNA를 10밀리머 트리스 버퍼의 4밀리리터와 pH 7에서 1밀리머 deferoxamine을 포함하는 튜브로 전송하여 용해한다. DNA가 튜브에 완전히 용해된 후 각 튜브에 4%이소아밀 알코올을 함유한 클로로폼 용액 4밀리리터를 추가합니다.
균질화튜브를 10회 반전시키고, 원심분리기는 2, 000배, 섭씨 4도, 10분 동안, 상면을 새로운 튜브로 옮긴다. 클로로폼 용액으로 상층의 세척을 두 번 더 반복합니다. 그런 다음, DNA를 침전시키기 위하여 절대 에탄올의 8밀리리터 및 5개의 어금니 나트륨 염화나트륨 용액의 0.4 밀리리터를 추가합니다.
다시, 침전 된 DNA를 수집 하 고 70%에탄올의 3 밀리 리터로 전송. 70%에탄올로 한 번 더 씻어내면 됩니다. 에탄올 용액을 조심스럽게 버리고 흡수성 용지에 침전된 DNA를 함유한 튜브를 반전하여 과도한 용액을 제거합니다.
15N5 이소토성 표준1, N6-etheno-deoxyadenosine 및 15N5 이소토성 표준으로 DNA 가수분해 샘플을 준비한 후 원고에 따라 N2-에테노 데옥시구아노신의 1, N2-에테노 데옥시구아노신의 15N5 이소토성 표준, 일반 디옥시 뉴클레오의 정량화를 위해 각 샘플의 10 마이크로리터를 튜브로 전송한다. 잔류 볼륨을 고체 위상 추출에 적용합니다. HPLC를 수행하려면 먼저 C18 SecurityGuard 카트리지에 부착된 C18 컬럼을 0.1%의 포믹산 및 메탄올그라데이션으로 처리합니다.
그라데이션 프로그램을 0~25분0~ 18%의 메탄올로 설정하고, 25분에서 27분에서 27분에서 0%의 메탄올을 분당 1밀리리터와 섭씨 30도의 유량으로 설정합니다. 그 후, 정상 탈옥 핵분열 정량화를 위해 예약된 각 샘플에 대해 2~6개의 마이크로리터 사이의 부피를 주입한다. 데옥시구아노신과 데옥시아데노신 봉우리의 통합을 위해 DAD 검출기를 260 나노미터로 설정합니다.
1, N6-etheno-deoxyadenosine 및 1, N2-etheno-deoxyguanosine의 분석을 위한 고체 상 추출을 수행하기 위해, 먼저 1 밀리리터의 부피로 일련의 솔루션으로 카트리지를 로드합니다. 100% 메탄올, 탈이온수, 가수분해DNA 샘플, 탈량화된 물, 10%메탄올, 15%메탄올, 마지막으로 100% 메탄올을 첨가하여 수집합니다. 그런 다음 원고에 따라 진행합니다.
DNA 가수분해 시료 15N5 이소토성 8-옥소-데옥시구아노신을 준비한 후, HPLC-ESI-MS/MS 시스템에서 분석을 위해 각 시료의 80마이크로리터를 바이알로 전송한다. HPLC-UV에 데옥시구아노신의 정량화를 위해 나머지 20 마이크로리터를 예약하십시오. HPLC-ESI-MS/MS에서 8-oxo-deoxyguanosine의 분석을 위해, 분당 150 마이크로리터와 섭씨 25도의 유량으로 용매 A와 B의 그라데이션을 가진 C18 시큐리티 가드 카트리지에 결합된 C18 컬럼 A를 엘테.
처음 25분 동안 용매 B의 0~15%, 용매 B의 15~80%, 용매 B의 80% ~28분~ 31분, 용매 B의 80~0%, 31~33분, 용매 B의 0%를 33~46분으로 실행한다. 처음 16분간 의 칼럼 A 용액을 낭비하도록 지시합니다. 조건 열 B분당 150 마이크로 리터의 유량에서 0.1 %의 포름산을 함유 한 물에 15 %의 메탄올의 용액을 가진 등각 펌프에 의한.
6분 후 크로마토그램을 확인하여 기둥 A.16~32분 간격동안 밸브를 기둥 A와 기둥 B.클로즈를 32분 만에 분리하여 두 번째 열에서 8-oxo-deoxyguanosine를 포진하여 날카로운 색토메토그래피를 얻을 수 있도록 하는 위치로 밸브를 전환합니다. 1, N6-etheno-deoxyadenosine 및 1, N2-etheno-deoxyguanosine의 분석을 위해, 분당 130 마이크로리터와 섭씨 25도의 유량으로 용매 A와 B의 그라데이션을 가진 C18 SecurityGuard 카트리지에 결합된 C18 컬럼을 엘테.. 처음 10분 동안 용매 B의 0%, 용매 B의 0~20% 0%, 용매 B의 0~20%, 용매 B의 20~75%가 39분에서 41분, 용매 B의 75%가 41분에서 46분, 용매 B의 75~0%, 46분에서 47분까지 용매 B의 75% 및 0%를 40분 간 실행한다.
스위칭 밸브를 사용하여 처음 35분 동안 용종의 폐기물을 지시하고 35분에서 42분 분분의 분수를 ESI 소스로 안내합니다. 광고 표준이 설정된 간격의 열에서 엘로트되어 있는지 확인합니다. 8-oxo-deoxyguanosine 의 봉우리 통합 15N5 8-oxo-deoxyguanosine의 동위 원가 표준, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 15N5 이소성 표준 1, N6-에테노 데옥시아데노신, 1, N2-에테노 데옥시구아노신, 15N5 이소토성 표준 1, N2-에테노 데옥시오시오신 1, N2-에테노 데옥시오시오신
교정 곡선 및 샘플의 면적 비율을 계산합니다. 교정 곡선을 설정하고 각 주입된 샘플에서 병변의 양을 계산합니다. HPLC-UV 분석에서 데옥시구아노신과 데옥사데노신의 피크를 통합합니다.
이 영역을 사용하여 교정 곡선을 설정하고 각 주입된 샘플에서 동물에서 데옥시구아노신 과 데옥사데노신의 양을 계산합니다. 데옥시구아노신을 통해 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine 위에 데옥시아데노신, 그리고 1, N2-에테노 데옥시구아노신 을 통해 데옥시구아노신을 계산하여 100만 원당 병변수를 산출합니다. HPLC-UV에 의해 얻어진 정제된 DNA의 대표적인 크로마토그램은 DNA 순도를 보여주는 RNA 리보뉴클레오시드로부터 자유로운 4개의 정상 탈옥핵의 존재를 나타낸다.
8-oxo-deoxyguanosine의 HPLC-ESI-MS/MS의 대표적인 크로마토그램, 1, N6-에테노 데옥시아데노신, 및 1, N2-에테노-데옥시구아노신 마우스 조직 DNA 샘플에서 의 대표적인 크로마토그램이 나타났다. UV 검출으로 얻은 크로마토그램은 첫 번째 컬럼에서 약 10분까지 4개의 정상 탈옥핵을 보례하며, 8-oxo-deoxyguanosine로부터 좋은 분리를 하여 원치 않는 간섭을 제거합니다. 정확한 정량화를 기억해야 할 중요한 것은 교정 곡선 및 샘플의 주입 볼륨에서 항상 동일한 양의 내부 표준을 갖는 것입니다.
여기에 제시된 방법은 다른 변형된 탈옥핵세포의 정량화를 위해 적응될 수 있다. 수정 된 탈옥 핵체의 밴드를 확장하면 기본 병리학 적 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 우리는 xenobiotics, 당뇨병 및 세포 악성 변환에 노출과 같은 다른 상황에서 산화 손상의 역할을 조사할 수 있습니다, 따라서 예방 및 치료 전략의 발달을 원조.
