단세포 RNA 시퀀싱은 특히 중추 신경계와 같은 이질조직에서 세포의 전사 프로파일을 연구하기 위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 단일 핵 RNA 염기서열분석용 핵을 격리하는 방법을 제공한다. 세포 대신 핵을 사용하여, 이 방법은 동결된 조직뿐만 아니라, 하기 어려운 조직에 적용될 수 있습니다.
더욱이, 이 방법은 질병 또는 상해 다음 세포에 있는 세포 모형 특이적 변경을 연구하기 위하여 적용될 수 있다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스 안락사로 이 절차를 시작합니다. 다음으로, 내부 장기를 노출하기 위해 신체의 길이를 따라 절개를합니다.
집게를 사용하여 신체 구멍에서 내부 장기를 당겨 마우스를 eviscerate. 이 오염 물질을 도입 할 수 있기 때문에, 지역을 청소하거나 장기를 제거하기 위해 종이 타월을 사용하지 마십시오. 가위를 사용하여 L2와 L3 척추 척추 사이의 척추 컬럼을 잘라냅니다.
척수를 배출하려면 25 게이지 1/4 인치 바늘로 얼음 차가운 PBS가 들어있는 3 밀리리터 주사기를 착용하십시오. 바늘 끝을 척추 기둥의 성추끝에 놓습니다. 두 손가락을 사용하여 척추를 꼬집어 바늘 끝 주위에 단단한 씰을 만들고 플런저를 눌러 척수를 roste없이 배출합니다.
추한 PBS를 곁들인 페트리 접시에 척수를 놓습니다. 코드의 요추 부분만 필요한 경우 척수의 성추와 흉부 부분을 다듬습니다. 이 시점에서, 조직을 동결하고 영하 80도에서 저장하거나, 여기에 설명된 바와 같이 세제 기계식 세포 용해 또는 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 저혈압 기계적 용해에 즉시 사용한다.
세제 기계식 세포 용액을 결정하기 위해 요추 척수를 미리 냉각된 둔균질제에 넣고 500마이크로리터의 미리 냉장 된 세제 용액 버퍼를 추가하십시오. 느슨한 유봉의 5 스트로크로 두드리고, A, 그리고 5 ~ 10 스트로크의 단단한 유봉, B.피하기 뇌졸중 사이에 용액의 외부 균질화제를 들어 올리고, 거품을 도입하지 마십시오. 이제 40미크론 스트레이너를 미리 냉각된 50밀리리터 원뿔 튜브 위에 놓고 저당 버퍼 1밀리리터로 미리 젖습니다.
리시스 버퍼에 원유 핵을 함유한 Dounce 균질화제에 저자산완충제 1밀리리터를 넣고 2~3회 배로 하여 부드럽게 섞는다. 40 미크로른 여과기를 통해 조핵 준비를 미리 냉각된 50 밀리리터 원추형 튜브에 전달합니다. 40 미크론 스트레이너 위에 1밀리리터 저자당 버퍼를 추가로 전달하여 최종 부피를 저자산 완충제의 3밀리리터와 500 마이크로리터의 용액 버퍼에 전달합니다.
여러 코드를 결합하고 동일한 원전 튜브에서 냉각하는 경우 이러한 단계를 반복합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 3200회 G로 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 상체를 감소시다.
우리는 낮은 자당 버퍼의 세 밀리리터를 사용하여 팔레트를 일시 중단합니다. 부드럽게 소용돌이하여 벽에서 펠릿을 제거하여 재서스펜션을 용이하게 합니다. 샘플을 2분 동안 얼음 위에 앉은 후 서스펜션을 오크 리지 튜브로 옮기습니다.
균질화제를 사용하여 15~30초 동안 저당버퍼에서 핵을 균질화하여 얼음 위에 샘플을 유지합니다. 그런 다음, 밀도 자당 버퍼의 12.5 밀리리터를 층으로 서학적 파이펫을 사용, 낮은 자당 버퍼 homogenate 아래, 밀도 층을 방해 거품을 만들지 않도록주의. 3200회 G의 튜브를 원심분리하여 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다.
원심분리가 완료되면 즉시 상체를 깜박이는 동작으로 디게팅합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 즉시 원심분리기에서 오크 리지 튜브를 제거하고 신속하게 상퍼를 데칭하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 100 마이크로리터를 1밀리리터에 사용하여 정지용 용액을 사용하여 벽에 남아 있는 핵을 중단합니다.
세제 기반 준비로 남아있는 myelin 찡그린 얼굴을 피하십시오. 이러한 단계를 신속하게 수행하지 못하면 다운스트림 단일 핵 RNA 시퀀싱을 방해할 수 있는 과도한 세포 이물질 또는 myelin을 사용하여 핵 을 준비할 수 있습니다. 30 내지 35 미크론 모공 크기의 여과기를 통해 핵을 걸러내고 미리 차가운 튜브에서 수집합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 단일 핵 RNA 시퀀싱을 진행하기 전에 혈류계를 사용하여 10 x 목표하에서 핵을 계산하는 핵 수율을 결정한다. 세제 기계적 용해 프로토콜을 사용하여 분리된 핵의 밝은 필드 및 상피성 이미지는 10 x로 도시된다. 이러한 핵은 편견없는 방식으로 분리되어 단일 세포의 수준에서 내인성 유전자 발현 프로파일의 연구를 허용합니다.
여기에 도시된, 마우스 요추 척수로부터, 대규모 병렬 액적 캡슐화 플랫폼을 사용하여 단일 핵 RNA 시퀀싱의 대표적인 tSNE 플롯이다. 신선하거나 냉동 된 조직에서 분리 된 핵은 상업 및 학술 플랫폼 모두에서 시퀀싱에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 연구원이 척수와 같은 어려운 조직을 사용하여 단세포 수준에서 전사 프로파일을 탐구할 수 있게 합니다, 또는 biobank 물질과 같은 동결된 조직조차.
이 절차를 시도하는 동안, 안락사와 세포 리시스 사이의 시간을 줄이는 것이 중요합니다. 또한 세포 리시스에서 재발에 이르는 솔루션에 도입된 거품을 최소화하고 조심스럽게 애완 동물 핵을 구입하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 핵은 특정 세포 유형을 격리하기 위해 팩 선별과 같은 대체 응용 분야에 사용될 수 있다.
