이 작품은 일본 제약 대학 (2016)과 문 부 과학성 KAKENHI 보조금 번호 JP17854179에서 일본 제약 대학 연구 보조금에 의해 부분에서 지원 되었다.

동물 실험 프로토콜 일본 제약 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었고 관심과 일본 제약 대학의 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 수행. 프로토콜 조직 추출 물의 ICR 생쥐에서 파생 된에 대 한 조정 되었습니다. ICR 생쥐 일본 SLC 회사 (일본 시즈오카)에서 구입 했다
1. Iminobiotin 표시 된 기판의 준비
기판 겪 습 9-fluorenylmethyloxycarbonyl 그룹 (Fmoc)를 사용 하 여 고체 상 합성-11아래 설명 된 대로 아미노산을 보호. 표 2 를 사용 하 여 원하는 아미노산 및 합성의 단계에 따라 사용 Fmoc 화합물 결정.
<ol><li>N, N-dimethylformamide (DMF) 합성 열에서의 10 mL와 Fmoc-NH-샐 수 지의 0.2 g 맛있게</li>
	<li>DMF에 30 %piperidine 5 mL를 추가 합니다. Fmoc 그룹을 쪼개 10 분 솔루션 바위.</li>
	<li>
체크 trinitrobenzenesulfonic 산 (TNBS) Fmoc 분열 테스트12: 1%의 추가 10 µ L DMF에 diisopropylethylamine (DIPEA) 10 x 75 m m2 유리 튜브, 다음 전송 작은 양의 수 지는 유리의 10 µ L TNBS 튜브. Fmoc 죽 습 수 지는 오렌지 색상을 개발 해야 합니다.
	<ol>
<li>이 결과 부정적인 경우 1.2-1.3 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>워시 DMF의 5 mL로 3 회 수 지.</li>
	<li>
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), 1-0.3 m m o l의 0.3 m m o l (단계 1에서에서 사용 하는 화합물으로 시작), 표 2에 나열 된 Fmoc 화합물의 0.3 m m o l을 포함 하는 DMF의 5 mL을 추가 Hydroxy 1 H benzotriazole, 토스 (HOBt), 그리고 diisopropylethylamine (DIPEA)의 0.6 m m o l. 30 분 수 지와 함께 몇 가지 솔루션을 바위.
	<ol>
<li>TNBS 테스트와 함께이 단계를 확인 합니다. 결과가 긍정적인 경우에, 즉, 반응이 충분히 진행 되지 하 고이 단계를 반복 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>워시 DMF의 5 mL로 3 회 수 지.</li>
	<li>1.2-1.6, 표 2에 따라 1.5 단계에서 사용한 Fmoc 복합 변경 단계를 반복 하 여 신장 반응을 반복 합니다.</li>
	<li>2.5% 물의 1 mL을 추가 1 %triisopropylsilane (TIS), 그리고 2.5 %ethanedithiol (EDT)에 trifluoroacetic 산 수 지와 보호 그룹에서 펩 티 드를 쪼개 다. 60 분에 대 한 솔루션을 바위.</li>
	<li>필터, 및 50 mL 튜브에는 filtrate 수집.</li>
	<li>-20 ° c.에 하룻밤 찬 diethyl 에탄올과 저장소의 40 mL를 추가</li>
	<li>30 분 동안-20 ° C에서 원심 분리기 4000 x g 펠 릿을 수집 합니다.</li>
	<li>3 h desiccator를 사용 하 여 diethyl 에테르를 제거.</li>
	<li>물 50% 이기의 1 mL을 추가 하 고 원유 펩 티 드를 분해. Trifluoroacetic 산을 제거 하는 솔루션 lyophilize 이 단계를 여러 번 반복 합니다.</li>
	<li>
C18 카트리지 열을 사용 하 여 펩 티 드를 정화.
	<ol>
<li>C18 카트리지 열 이기 (ACN)의 3 mL를 사용 하 여에 수 지를 활성화 합니다.</li>
		<li>5 %ACN, H2o. 0.1 %TFA 5 mL와 함께 equilibrate</li>
		<li>C18 카트리지 열에 원유 합성 펩 티 드를 로드 합니다.</li>
		<li>5 %ACN, H2o. 0.1 %TFA 10 mL로 씻어</li>
		<li>60%의 3 mL과 샘플을 elute ACN, 0.1% TFA H2o.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 그들의 분자량을 측정 하는 펩 티 드를 확인 합니다.
	<ol>
<li>Eluent 대상 접시에의 1 µ L 플라스틱 0.1 %trifluoroacetic 산에서 50% 이기에 포화 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 솔루션을 즉시 추가</li>
		<li>공기에서 혼합물을 구체화.</li>
		<li>악기 제조 업체의 프로토콜에 따라 시료의 질량 스펙트럼을 취득 합니다.<ol>
<li>수동으로 설정 긍정적인에 MALDI TOF 질량 분석기 모드를 반영 합니다.</li>
			<li>CHCA를 사용 하 여 질량 분석기 보정, bradykinin 조각 1-7 (monoisotopic 분자량 = 756.3997 Da), 그리고 angiotensin II (monoisotopic 분자 무게 1,045.5423 다 =).</li>
			<li>합성 펩 티 드의 질량 스펙트럼을 취득 하 고 이론적인 분자 무게와 비교 하 여 평가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 조직 추출의 준비
<ol><li>Anesthetize 남성 ICR 마우스 isoflurane 흡입 챔버에 고 발가락 핀치를 통해 마 취 깊이 확인 합니다. 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여, 칼 과정까지 확장 하는 피부를 통해 복 부 절 개를 중간 확인 합니다.</li>
	<li>횡 경 막 통해 잘라내어 수집 모든 폐 조직. 조직의 작은 조각으로 잘라.</li>
	<li>씻어 얼음 50 mM Tris 버퍼 식 염 수 (pH 7.4)와 세 번 조직.</li>
	<li>조직 및 12 x 75 m m2 유리 튜브에 전송 조직의 약 100 밀리 그램 무게.</li>
	<li>추출 버퍼 (50 mM Tris 버퍼, pH 7.4, 0.1% 폴 리 (oxyethylene) octylphenyl 에테르를 포함)의 0.3 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>
폐 조직 샘플 혼합 균질 화기를 사용 하 여 균질
	<ol>
<li>차가운 얼음에 샘플.</li>
		<li>30에 대 한 20000 rpm에서 샘플을 균질 믹서 기에 s. 샘플은 완전히 동 질 때까지이 단계를 반복 합니다. 참고: 온도 증가 피하기 위해 1 분 이상 계속 하지 균질 할.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL 튜브 4 ° c.에 10000 x g에 5 분 동안 원심 분리기에는 homogenate의 1000 µ L를 전송</li>
	<li>새로운 1.5 mL 플라스틱 튜브에는 상쾌한의 500 µ L를 전송.</li>
	<li>단백질 농도, bicinchoninic 산 (BCA) 같은 메서드 또는 Coomassie 화려한 블루 (CBB) 메서드를 사용 하 여 결정 하는 샘플의 10 µ L을 사용 합니다.</li>
	<li>동결을 방지 하기 위해 50% 글리세롤의 최종 농도 대 한 샘플을 80% 글리세롤을 추가 합니다.</li>
	<li>추가 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>3. 기판 모델 효소와 조직 추출에서의 소화
<ol><li>
N-토실기-L-페닐알라닌 chloromethyl 케 톤 (TPCK)의 0.1 µ g / µ L의 10 µ L 추가-트립 신, 황색 포도 상 구 균 V8 protease의 µ 0.1 µ g/L 또는 소화 버퍼의 890 µ L에 조직 추출의 µ 10 µ g/L.
	<ol>
<li>PH에 따라 효소 특이성에 차이 명확 하 게, 3, 5, 7, 및 9의 pH를 조정 하는 버퍼를 사용 합니다. 소화 버퍼의 구성 표 3에 표시 됩니다.</li>
		<li>조직 추출 물, 10 분 동안 끓는 물 (또는 100 ° C에서 난방) 외피에 의해 준비에 비활성 효소를 사용 하 여 부정적인 제어를 실시 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iminobiotin 표시 된 기판의 10 µ L 추가 (디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 최종 농도에 녹아 = 100 pmol/10 µ L).</li>
	<li>Iminobiotin 표시 된 기판 소화 37 ° C에서 3 시간 동안 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 10 분 동안 끓는 물 (또는 100 ° C에서 난방) 기판의 소화를 중지 합니다.</li>
	<li>10000 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 소화 기판 원심</li>
	<li>새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 합니다.</li>
</ol>4. Iminobiotin 표시 된 기판의 정화
<ol><li>
1 M Tris 버퍼 (pH 9) 포함 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl 에테르에 50% streptavidin sepharose 구슬의 50 µ L를 추가 합니다.
	<ol>
<li>PH 테스트 종이 사용 하 여 pH 9 주위에 솔루션을. 솔루션의 산도 낮은 경우에, 1 M Tris 버퍼 (pH 9) 포함 0.1% poly(oxyethylene) octylphenyl 에테르를 추가 하 여 약 pH 9 조정 합니다. 이 단계는 streptavidin는 iminobiotin 표시 된 기판의 바인딩을 포함 하기 때문에 중요 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>streptavidin iminobiotin 표시 된 기판 바인딩할 회전 바퀴에 지속적인 부드러운 혼합으로 4 ° C에서 밤새 품 어. 비즈는 부 화에 걸쳐 일시 중단 된 유지 됩니다.</li>
	<li>4 ° c.에 10000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기 제거는 상쾌한.</li>
	<li>
다음과 같이 구슬 5 번 세척.
	<ol>
<li>구슬에 워시 버퍼 (50 mM Tris 버퍼, pH 9)의 1000 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>회전 바퀴에 지속적인 부드러운 혼합으로 4 ° C에서 10 분 동안 세척. 비즈는 부 화에 걸쳐 일시 중단 된 유지 됩니다.</li>
		<li>4 ° C에서 10000 x g에서 1 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
구슬에 0.2 %trifluoroacetic 산의 100 µ L를 추가 합니다.
	<ol>
<li>PH 테스트 종이 사용 하 여 pH 2 아래 솔루션을. 솔루션의 산도 높은 경우에, 1 %trifluoroacetic 산을 추가 하 여 2 아래에 pH를 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>회전 바퀴에 지속적인 부드러운 혼합으로 실 온에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>4 ° C에서 10000 x g에서 1 분 동안 centrifuge 다음 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 합니다.</li>
</ol>5. 샘플 준비와 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 질량 분석 (TOF MALDI 질량 분석)
참고: 다음 단계에서 모든 솔루션은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)으로 준비 되어야 한다-학년 또는 아미노산 시퀀싱 급 물.
<ol><li>그것을 활성화 C18 수 지에 이기의 500 µ L 플라스틱 사용된 이기를 제거 합니다. 이 단계를 세 번 반복 합니다.</li>
	<li>0.1 %trifluoroacetic 산의 100 µ L와 C18 수 지 equilibrate Eluent는 제거 합니다. 이 단계를 세 번 반복 합니다.</li>
	<li>샘플을 로드 하는 피 펫을 사용 하 여 수 지에 샘플을 바인딩하십시오.</li>
	<li>0.1 %trifluoroacetic 산의 20 µ L로 수 지를 세척. 5 번이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>샘플의 0.1 %trifluoroacetic 산에서 60% 이기 3 µ L elute TOF MALDI 질량 분석에 대 한 대상 접시에 eluent 플라스틱 즉시 0.1 %trifluoroacetic 산에서 50% 이기에 포화 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 솔루션을 추가 합니다.</li>
	<li>공기에서 혼합물을 구체화.</li>
	<li>
악기 제조 업체의 프로토콜에 따라 시료의 질량 스펙트럼을 취득 합니다.
	<ol>
<li>수동으로 설정 긍정적인에 MALDI TOF 질량 분석기 모드를 반영 합니다.</li>
		<li>CHCA를 사용 하 여 질량 분석기 보정, bradykinin 조각 1-7 (monoisotopic 분자량 = 756.3997 Da), 그리고 angiotensin II (monoisotopic 분자 무게 1,045.5423 다 =).</li>
		<li>샘플, biotin 표시 된 기판의 쪼개진된 형태에 대 한 900 다 700에서 질량 스펙트럼에 세심 한 관심 지불의 질량 스펙트럼을 취득 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표 1을 사용 하 여 검색 된 봉우리를 식별 합니다. 적절 한 분자량의 검출 관련 아미노산의 C-말단에 분열을 나타냅니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+(a+review).">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li><li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein.">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li><li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases.">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li><li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin.">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li><li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li><li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer.">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li><li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo.">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li><li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics.">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li><li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates.">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li><li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin.">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li><li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+Phase+Peptide+Synthesis.+I.+The+synthesis+of+a+tetrapeptide.">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li><li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2,4,6-trinitrobenzenesulphonic+acid.">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li><li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+NeutraLite+avidin:+A+non-glycosylated,+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties.">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li><li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography.">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li></ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

이 프로토콜 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성을 식별 하 고 쉽게 여러 샘플 처리에 대 한 조정 될 수 있습니다. 특히, 우리는 기질 특이성에 변화를 일으킬 pH를 조작.
avidin 비타민 b 복합체 복잡 한 (ABC) 메서드, 생화학의 바인딩 특이성 때문에 널리 이용 되는, 우리의 프로토콜에 이용 되었다. ABC의 강한 선호도, 인해 avidin 비?...

프로 테아 제, 단백질 절단형에 의해 생리 적 프로세스 조절 그리고 특정 시간과 장소에서 효소 활동의 개시는 규제1. 그러므로 식 및 로컬 규제, 조직의 활동을 식별 하 고 프로 테아 제를 감지 하는 새로운 방법을 개발 하는 것이 중요 하다. 에 제안 된 방법은이 연구 프로 테아 제를 감지 하는 동시에 효소 특이성을 식별 하는 것을 목표로.
효소 특이성을 탐지 하기 위한 몇 가지 방법이 있습니다. Azocasein 메서드는 프로 테아 제2 의 검출에 사용을 위해 유명 하다 그러나 추가 정보를 얻을 하는 능력에 제한 된다. Zymography 프로 테아 제3의 분자량을 결정 하는 데 사용할 수 있는 또 다른 종합 효소 검출 방식 이지만 기질 특이성을 검사 하는 데 사용할 수 없습니다. 효소 특이성 spectrometric 분석, 기판 p-nitroanilide4, 등을 사용 하 여 및 fluorometric 분석 실험, coumarin 기판5 또는 형광 공명 에너지 전송 (무서 워) 분석 실험6을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 이 메서드는 단일 잘에서 포함 하는 기판의 단일 특이성 탐지를 사용. 현재 연구에서 이러한 추출 물 포함 여러 프로 테아 제 효소 특이성 조직 추출의 다양 한 조건에서 검사 합니다. 효소 활동은 pH, 코엔자임, prosthetic 그룹, 이온 강도 등 여러 가지 요인에 의해 통제 된다. 최근, proteomics 기반 방법 효소 특이성;을 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 예를 들어, Biniossek 외에서 보고 하는 방법. 7 조 추출 물에도 기질 특이성을 결정 하는 프로테옴을 사용 하 고 여러 아미노산 시퀀스8을 인식 하는 프로 테아의 분열 활동의 정확한 결심을 허용 한다. 그러나,이 메서드는 수많은 샘플의 분석에 적합 하지. 우리의 메서드 여러 샘플의 동시 처리 및 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화의 사용을 사용 하는 반면, 시간의 비행 (TOF MALDI)는 쪼개진의 신속 하 고 쉽게 감지 샘플 분석을 위한 질량 분석에 용이 하 게 기판입니다.
이 종이 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 독특한 기판의 분자량을 측정 하 여 효소 특이성을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 그들의 이론적 분자 무게, 함께 쪼개진된 기판의 분자 형태는 그림 1 과 표 1에 표시 됩니다. 이전 연구 polyglycine 스페이서 및 biotin9;를 포함 하는 기판 사용 그러나, 이러한 기판 polyglycine 시퀀스 글리신 시퀀스를 인식 하는 효소에 의해 죽 습 있을 수 있습니다 때문에 결함이 있습니다. 또한, avidin 비타민 b 복합체 사이 높은 선호도 낮은 회복 율을 이어질 수 있습니다. 하 우리는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG), iminobiotin, 및 분열 사이트 (그림 1)을 식별할 수 있는 아미노산의 구성 되었다 독특한 기질 합성이 연구에서는 이러한 단점에 향상. 유사한 분자 무게의 아미노산 사이 차별, D-떠들고 못 스페이서 사이 쪼개진된 사이트에서 아미노산 추가 되었습니다.
기판의 N 맨끝 원유 샘플에서 친 화력 정화를 가능 하 게 iminobiotin로 분류 됐다. Biotin 대신 iminobiotin의 사용은 매우 중요; biotin은 avidin, avidin에 대 한 iminobiotin의 선호도 pH에 의해 변경 될 수 있습니다 동안 avidin 수 지에서 biotin 표시 된 기판의 낮은 회수율 결과와 강한 선호도 하고있다. Iminobiotin 표시 된 기판 avidin pH 4 아래 조건에서 기판 iminobiotin 표시를 해제 하는 동안 pH 9, 위의 조건에서 avidin에 바인딩합니다. 따라서, iminobiotin는 친 화력 정화10사용 되었다. 요약, 우리는 독특한 기질을 사용 하 여 효소 특이성을 탐지 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)&lt;br/&gt;aminomethyl]phenoxy resin)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00102</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide (DMF)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00185</td><td></td></tr><tr><td>piperidine</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00176</td><td></td></tr><tr><td>trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)</td><td>WAKO Chemical</td><td>209-1483</td><td></td></tr><tr><td>O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00067</td><td></td></tr><tr><td>1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00014</td><td></td></tr><tr><td>diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00030</td><td></td></tr><tr><td>triisopropylsilane (TIS)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00170</td><td></td></tr><tr><td>ethanedithiol (EDT)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00057</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Millipore</td><td>S6612278 403</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2153025</td><td></td></tr><tr><td>C18 cartridge column</td><td>Waters</td><td>WAT051910</td><td></td></tr><tr><td>poly(oxyethylene) octylphenyl ether</td><td>WAKO Chemical</td><td>168-11805</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>mixing homogenizer</td><td>Kinematica</td><td>PT3100</td><td>polytron homogenizer</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td><td>Nakarai Chemical</td><td>094-09</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Nakarai Chemical</td><td>170-18</td><td></td></tr><tr><td>N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>WAKO Chemical</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td>17-511-01</td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2020</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF mass spectrometry</td><td>Bruker Daltonics, Germany</td><td>autoflex</td><td></td></tr><tr><td>2-iminobiotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4632</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-amino acids</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the determination of protease specificity in mouse tissue extracts by maldi-tof mass spectrometry: manipulating ph to cause specificity changes

프로 테아 제 단백질 활성화/비활성화 및 음식 소화를 포함 하 여 여러 생물 학적 기능을가지고. 효소 특이성을 식별 하는 것이 효소 기능을 공개에 대 한 중요 합니다. 이 연구에서 제안 된 메서드는 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화를 사용 하 여 독특한 기판의 분자량을 측정 하 여 효소 특이성을 결정 합니다 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석. 기판 포함 iminobiotin, 쪼개진된 사이트 구성 아미노산, 그리고는 스페이서 이루어져 있다 폴 리 에틸렌 글리콜. 쪼개진된 기판 독특한 분자량 쪼개진된 아미노산을 사용 하 여 생성 됩니다. 이 방법의 장점 중 하나입니다 그것은 원유 샘플을 사용 하 여 한 냄비에 실행 될 수 있습니다 그리고 그것은 또한 여러 샘플을 평가 적합. 이 문서에서는, 우리는 마우스 폐 조직, 조직 추출, 소화 기판의에 배치 샘플, 다른 pH 조건 하에서 소화 기판의 정화 등에서 추출 하는 샘플으로 최적화 하는 간단한 실험 방법 설명 및 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 기판의 분자량의 측정. 요약 하자면,이 기술은 여러 샘플 처리에 대 한 쉽게 확장 될 수 있습니다 하는 TOF MALDI 질량 분석을 사용 하 여 조직 추출에서 파생 하는 원유 샘플에서 효소 특이성의 식별에 대 한 수 있습니다.

모델 프로 테아 제에 의해 효소 특이성의 식별에 대 한 방법의 평가
이 시스템의 효율성은 TPCK-트립 신 및 V8 효소의 기질 특이성 가져온 사용 하 여 평가 되었습니다. TPCK-트립 신 및 V8 효소 아미노산 시퀀스 리 신과 아르기닌 잔류물의 C-터미널 및 aspartic 산 및 글루탐산 잔류물의 카 쪽에서 각각 쪼개 위하여 견적 되었다. 표...

Watch this Scientific Journal Video about The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes at JoVE.com

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

여기, 선물이 원유 마우스 조직에서 효소 특이성을 결정 하는 프로토콜 MALDI TOF 분석을 사용 하 여 추출.

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

the-determination-protease-specificity-mouse-tissue-extracts-maldi

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.8K 조회수.  Nihon Pharmaceutical University. 여기, 선물이 원유 마우스 조직에서 효소 특이성을 결정 하는 프로토콜 MALDI TOF 분석을 사용 하 여 추출.

비디오: The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass determination allows one to evaluate the correctness of protein primary sequences, the presence of mutations and/or post-translational modifications, the possible protein degradation, the sample homogeneity, and the degree of isotope incorporation in case of labelling (e.g. 13C labelling).
Electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) is widely used for mass determination of denatured proteins, but its efficiency is affected by the composition of the sample buffer. In particular, the presence of salts, detergents, and contaminants severely undermines the effectiveness of protein analysis by ESI-MS. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is an attractive alternative, due to its salt tolerance and the simplicity of data acquisition and interpretation. Moreover, the mass determination of large heterogeneous proteins (bigger than 100 kDa) is easier by MALDI-MS due to the absence of overlapping high charge state distributions which are present in ESI spectra.
Here we present an accessible approach for analyzing proteins larger than 100 kDa by MALDI-time of flight (TOF). We illustrate the advantages of using a mixture of two matrices (i.e. 2,5-dihydroxybenzoic acid and &#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid) and the utility of the thin layer method as approach for sample deposition. We also discuss the critical role of the matrix and solvent purity, of the standards used for calibration, of the laser energy, and of the acquisition time. Overall, we provide information necessary to a novice for analyzing intact proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Accurate mass measurement represents an important step during the investigation of proteins. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) can be used for such determination and its key advantage is the tolerance to salts, detergents and contaminants. Here we illustrate an accessible approach for the analysis of proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

비행의 레이저 탈착 / 이온화 시간 본래대로 단백질의 (MALDI-TOF) 질량 분광 분석 매트릭스를 이용한 큰 100 kDa의

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

연구

화학

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may be classified as either clinically functional or nonfunctional PA (FPA and NFPA). NFPA is difficult for early stage diagnosis and therapy due to barely elevating hormones in the blood compared to FPA. Our long-term goal is to use proteomics methods to discover reliable biomarkers for clarification of PA molecular mechanisms and recognition of effective diagnostic, prognostic markers and therapeutic targets. Effective two-dimensional gel electrophoresis (2DE) coupled with mass spectrometry (MS) methods were presented here to analyze human PA proteomes, including preparation of samples, 2D gel electrophoresis, protein visualization, image analysis, in-gel trypsin digestion, peptide mass fingerprint (PMF), and tandem mass spectrometry (MS/MS). 2-Dimensional gel electrophoresis matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS, and 2DE-liquid chromatography (LC) MS/MS procedures have been successfully applied in an analysis of NFPA proteome. With the use of a high-sensitivity mass spectrometer, many proteins were identified with the 2DE-LC-MS/MS method in each 2D gel spot in an analysis of complex PA tissue to maximize the coverage of human PA proteome.

Here, we present a two-dimensional gel electrophoresis (2DE) coupled with mass spectrometry (MS) to separate and identify human pituitary adenoma tissue proteome, which presents a good and reproducible 2DE pattern. Many proteins are observed in each 2DE spot when analyzing complex cancer proteome with the use of high-sensitivity MS.

2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 방법으로 인간의 뇌 Adenoma 조직 프로테옴의 분석에 대 한 결합

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

암 연구학

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

생체공학

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

형광 성 펩 티 드 Zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

동적 Proteomic 그리고 미르 Langendorff 관류 후 절연 마우스 마음에서에서 Polysomes의 분석

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

생화학

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain using antibiotic induction, and identified by MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. The immunity protein of colicin E3 (Im3) and the immunity protein of bacteriocin (Im-Bac) were identified from prominent b- and/or y-type fragment ions generated by the polypeptide backbone cleavage (PBC) on the C-terminal side of aspartic acid, glutamic acid, and asparagine residues by the aspartic acid effect fragmentation mechanism. The software rapidly scans in silico protein sequences derived from the whole genome sequencing of the bacterial strain. The software also iteratively removes amino acid residues of a protein sequence in the event that the mature protein sequence is truncated. A single protein sequence possessed mass and fragment ions consistent with those detected for each immunity protein. The candidate sequence was then manually inspected to confirm that all detected fragment ions could be assigned. The N-terminal methionine of Im3 was post-translationally removed, whereas Im-Bac had the complete sequence. In addition, we found that only two or three non-complementary fragment ions formed by PBC are necessary to identify the correct protein sequence. Finally, a promoter (SOS box) was identified upstream of the antibacterial and immunity genes in a plasmid genome of the bacterial strain.

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Here we present a protocol for the rapid identification of proteins produced by genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. Metastable protein ions fragment because of the aspartic acid effect and this specificity is exploited for protein identification.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic mechanisms of proteolytic enzymes1-3. With the advent of mass spectrometry-based proteomics, the enzymatically-catalyzed incorporation of 18O-atoms from stable isotopically enriched water has become a popular method to quantitatively compare protein expression levels (reviewed by Fenselau and Yao4, Miyagi and Rao5 and Ye et al.6). 18O-labeling constitutes a simple and low-cost alternative to chemical (e.g. iTRAQ, ICAT) and metabolic (e.g. SILAC) labeling techniques7. Depending on the protease utilized, 18O-labeling can result in the incorporation of up to two 18O-atoms in the C-terminal carboxyl group of the cleavage product3. The labeling reaction can be subdivided into two independent processes, the peptide bond cleavage and the carboxyl oxygen exchange reaction8. In our PALeO (protease-assisted labeling employing 18O-enriched water) adaptation of enzymatic 18O-labeling, we utilized 50% 18O-enriched water to yield distinctive isotope signatures. In combination with high-resolution matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight tandem mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF MS/MS), the characteristic isotope envelopes can be used to identify cleavage products with a high level of specificity. We previously have used the PALeO-methodology to detect and characterize endogenous proteases9 and monitor proteolytic reactions10-11. Since PALeO encodes the very essence of the proteolytic cleavage reaction, the experimental setup is simple and biochemical enrichment steps of cleavage products can be circumvented. The PALeO-method can easily be extended to (i) time course experiments that monitor the dynamics of proteolytic cleavage reactions and (ii) the analysis of proteolysis in complex biological samples that represent physiological conditions. PALeO-TimeCourse experiments help identifying rate-limiting processing steps and reaction intermediates in complex proteolytic pathway reactions. Furthermore, the PALeO-reaction allows us to identify proteolytic enzymes such as the serine protease trypsin that is capable to rebind its cleavage products and catalyze the incorporation of a second 18O-atom. Such "double-labeling" enzymes can be used for postdigestion 18O-labeling, in which peptides are exclusively labeled by the carboxyl oxygen exchange reaction. Our third strategy extends labeling employing 18O-enriched water beyond enzymes and uses acidic pH conditions to introduce 18O-stable isotope signatures into peptides.

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Stable isotope labeling workflows employing 18O-enriched water (LeO-workflows) are versatile tools for quantitative and qualitative proteomics studies. In protease-assisted (PALeO) workflows, 18O-atoms are introduced by proteolytic cleavage and carboxyl oxygen exchange reactions mediated by proteases. In the acid-catalyzed (ALeO) workflow, 18O-atoms are introduced by carboxyl oxygen exchange at low pH.

도입 단백 분해 효소와 산 촉매 라벨링 워크 플로<sup&gt; 18</sup&gt; O 강화 물

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...