이 방법은 배아의 가이드 RNA를 확인하거나 초기 발달 질문을 테스트하거나 편집 된 마우스를 만들 수 있습니다. CRISPR Cas9의 모든 발전은 이 방법과 함께 사용될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 배우기 쉽고 마우스에 접근 할 수있는 실험실에서 사용할 수있는 시약을 사용한다는 것입니다.
앞으로이 기술은 반려 동물이나 농업에 중요한 동물의 자손에서 질병이나 돌연변이를 교정하는 데 유용 할 것입니다. 이 방법은 마우스 모델을 생성하는 데 가장 적합합니다. 우리 연구실에서는 수정 및 조기 착상 전 발달, 특히 배아 효능의 유전자 조절을 둘러싼 사건을 조사하기 위해이 방법의 변형을 사용하고 있습니다.
가장 어려운 부분은 유리 바늘을 사용하여 배아를 접시에서 접시로 옮기는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 연구 전문가 인 Chantal Diallo입니다. 배아 수집 및 처리를 시작하려면 안락사 된 암컷 마우스를 등에 놓고 외과 적으로 열 복부에 70 % 에탄올을 뿌립니다.
복강을 열고 난관을 제거하려면 수술 용 가위로 피부층을 자르고 난소를 찾으십시오. 다음으로, 난소 근위에 위치한 두 난관을 외과 적으로 제거하고 M2와 BSA 배지의 개별 50 마이크로 리터 방울에 넣습니다. 실체 현미경에서 해부 겸자를 사용하여 난관의 팽대부에 흠집을 내어 난모세포가 포함된 적운-난모세포 복합체 또는 COC를 방출한 다음 파편의 이월을 방지하기 위해 각 적운-난자를 20-30마이크로리터로 설정된 처리된 피펫으로 M2와 BSA의 단일 50마이크로리터 방울로 옮기고 결합합니다.
다음으로, 접합체에서 적운 세포를 제거하려면 약간의 추가 배지로 COC를 100마이크로리터 M2와 히알루로니다아제 방울로 옮기고 배아가 훨씬 작은 적운 세포에서 눈에 띄게 분리될 때까지 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 히알루로니다아제를 희석하고 느슨한 적운 세포를 제거하려면 구강 작동식 피펫을 사용하여 접합체를 신선한 50마이크로리터 M2 플러스 BSA 방울로 옮깁니다. 다음으로, 배아의 zona pellucida를 침식하고 시약 전달을위한 추가적인 물리적 장애물을 줄이기 위해 배아를 60mm 플레이트의 예열 된 100 마이크로 리터 산 Tyrode 또는 AT 용액 방울로 옮깁니다.
조나 펠루시다의 30%가 침식될 때까지 실체 현미경으로 접합체를 지속적으로 관찰한 다음 AT를 희석하기 위해 배아를 M2와 BSA의 50마이크로리터 방울 4개를 통과시킵니다. 다음으로, 실체 현미경으로 계산하여 처리 된 배아의 적절한 수를 결정하십시오. 배아를 50 마이크로리터의 환원된 혈청 배지의 두 방울에 통과시켜 BSA를 희석합니다.
다음으로, 25-30개의 배아를 환원된 혈청 배지의 10마이크로리터 방울에 입 피펫팅한 다음 휴대용 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 리보핵단백질 또는 RNP 복합체를 추가합니다. RNP 복합체에서 점성 글리세롤을 희석하고 10회 또는 혼합물이 더 이상 점도를 나타내지 않을 때까지 피펫팅하여 샘플을 균질화합니다. 다음으로, 20 마이크로리터의 배아와 RNP 혼합물을 기포를 피하면서 0.1센티미터 전기천공 큐벳에 넣은 다음, 편집 시약을 접합체로 전달하기 위해, 30볼트의 구형파 프로토콜을 사용하여 배아를 전기천공하고, 3밀리초 펄스 길이의 4 내지 6펄스, 및 100펄스 간격.
다음으로, 큐벳 상단에 50마이크로리터의 M2와 BSA를 추가하여 큐벳에서 배아를 플러시하고 이 혼합물을 플레이트에 부드럽게 피펫팅합니다. 배아 배양을 위해, 20 내지 30개의 접합체를 사전 평형화된 배양 플레이트에서 KSOM 플러스 BSA의 액적 내로 옮기고 배아를 액적으로 이동시킨다. 접시를 섭씨 37도에서 5%이산화탄소, 습도 95%에서 밤새 배양합니다.
다음날, 2 세포 배아 만 KSOM과 BSA 혼합물의 신선한 방울로 옮기고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 죽거나 수정되지 않은 배아는 그대로 두거나 버립니다. 유전형 분석을 하기 전에 상복종 배아를 DPBS 두 방울로 세척하여 PCR 반응을 방해할 수 있는 배지 성분을 희석합니다.
구강 피펫을 사용하여 개별 배아를 8웰 PCR 스트립의 한 웰로 옮기고 10마이크로리터의 용해 완충액을 추가합니다. 다음으로, 배아를 용해시키기 위해 열 순환기를 섭씨 55도까지 4 시간 동안 프로그래밍 한 다음 섭씨 95도에서 10 분 배양하여 단백질 분해 효소 K를 비활성화합니다. 본 연구에서, 비-상동성 말단 접합 및 상동성 지시 복구를 위한 올리고 디자인 및 유전형 분석 전략을 포함하여, 마우스 티로시나제 유전자좌를 양성 대조군으로 표적화하는 전략의 예가 제시된다.
단일 가이드 또는 sgRNA를 전달할 때 RNP의 전달은 C57 검정색 6J 및 C57 검정 6N 마우스 균주에서 최대 100%였으며 삽입 결실 형성은 50 내지 100%에서 발생하고 작은 올리고 기반 대체물은 17%에서 63%까지 이루어졌습니다. 게놈 결실을 엔지니어링할 때 편집 효과는 3%에서 100%까지 다양합니다. 배아는 가능한 한 이상적인 조건에 가깝게 보관해야 하므로 더 빨리 프로토콜이 완료되면 더 좋습니다. 또한 히알루로니다아제와 산성 티로드에 대한 노출을 최소화하십시오. 이 방법은 편집 된 동물을 생성하거나, 이식 또는 임신 생존력을 테스트하거나, 실험을 여러 번 수행하여 농장 전 개발 중에 측정 또는 이미지 및 다양한 메트릭을 수집하는 방법을 설명합니다.
