CRISPR 기반 게놈 편집 도구는 유전자 조작 rep 모델의 생산을 크게 촉진했습니다. CRISPR 시스템은 Cas9 뉴클레아제에 대한 단일 가이드 RNA 복합체로 구성되며 게놈 내에서 관심 염기서열을 표적으로 삼아 이중 가닥 DNA 절단을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. DNA 복구 템플릿의 공동 전달을 통해 이 DNA 절단은 상동성 유도 복구(Homology Directed Repair)라는 프로세스를 통해 원하는 조작된 DNA 염기서열의 추가와 함께 정밀하게 복원될 수 있습니다.
이 과정을 통해 표적 DNA 삽입 또는 치환으로 knock-in rat 모델을 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 아데노 관련 바이러스를 사용하여 쥐 배아에 DNA 복구 템플릿을 전달하고 2세포 배아 전기천공법을 통해 CRISPR Cas9 복합체를 후속 전달하는 수정된 접근 방식을 제시합니다. AAV 혈청형 1 또는 6은 CRISPR 매개 상동성 유도 복구 프로세스를 통해 쥐 게놈에 통합되도록 설계된 조작된 DNA 복구 템플릿과 함께 패키징됩니다.
AAV는 3 X 10의 최종 농도에서 마이크로리터당 7번째 게놈 카피의 쥐 KSOM 배지 30마이크로리터 방울에 첨가됩니다. 다음으로, 눈에 보이는 전핵이 있는 갓 채취한 1개 세포 단계 배아를 AAV가 포함된 배지로 옮겨 바이러스 형질도입이 발생할 수 있도록 합니다. 당사의 프로토콜을 사용하면 AAV 혈청형 1 및 6이 효율적인 DNA 복구 템플릿 전달을 위해 쉽게 통과할 수 있으므로 zona pellucida를 얇게 할 필요가 없습니다.
배아는 섭씨 37도에서 밤새 AAV로 배양되며 이산화탄소는 5%이고 습도는 최대 습도입니다. 다음 날, 단일 가이드 RNA의 마이크로리터당 100나노그램과 OptiMIM 배지에 희석된 Cas9 단백질의 마이크로리터당 100나노그램을 포함하는 전기천공법 혼합물을 만듭니다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양하여 CRISPR RNP 복합체를 형성합니다.
배양 시간 동안 electroporator가 켜지고 리드가 유리 슬라이드 전극에 부착됩니다. RNP 형성이 완료된 후, 5 마이크로 리터의 electroporation 혼합물이 용액에 기포가 유입되지 않도록주의하면서 전극 사이에 피펫팅됩니다. 이제 2개의 세포 단계에 있는 배아를 AAV를 함유하는 배지에서 제거하고 전극 사이의 전기천공법 혼합물로 조심스럽게 이동합니다.
배아가 정렬되어 전기 천공법 중에 용해를 일으킬 수 있으므로 전극에 닿지 않도록 합니다. 다음은 현미경을 통해 본 이 절차의 모습입니다. 전극 사이의 부피가 증가함에 따라 임피던스가 감소한다는 점에 유의하는 것도 중요합니다.
이러한 이유로, 전기천공법 혼합물을 희석하지 않기 위해, 최소한의 배지가 배아와 함께 옮겨져야 한다. 다음으로 임피던스는 옴 기호가 있는 버튼을 눌러 측정됩니다. 임피던스는 0.18에서 0.3옴 범위 내에 있어야 합니다.
범위 내에 있으면 시작 버튼을 눌러 전기 천공법이 시작됩니다. 이 과정은 몇 초 밖에 걸리지 않으며 이것이 현미경을 통해 보이는 모습입니다. 각 전극에 기포가 빠르게 형성되는 것을 알 수 있습니다.
전기천공법 직후, 배아를 유리 슬라이드에서 채취하여 신선한 쥐 KSOM 배지에서 3회 세척합니다. 그런 다음 배아는 체외 연구를 위해 배양되거나 대리모 여성에게 이식되어 살아있는 자손을 생산할 수 있습니다. 배아 팽창은 전기천공법 후에 흔히 발생한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
이 붓기는 배양에 몇 시간 후에 가라앉아야 합니다. 또한 전기천공법 후 두 세포 배아의 최대 20%에서 세포 융합 현상을 볼 수 있습니다. 세포 융합은 전형적으로 전극 사이의 배아의 신중한 수평축 정렬에 의해 피할 수 있다.
쥐 배아에서 프로토콜을 테스트하고 두 개의 loxP 부위를 포함하는 엔지니어링된 짧은 인공 인트론 서열의 삽입을 위해 배양된 모세포를 스크리닝합니다. 우리는 배반포의 60% 이상이 차세대 염기서열 분석을 기반으로 정확하게 표적화된 knock-in 대립유전자를 포함하고 있음을 확인했습니다. 다음으로, 살아있는 knock-in 쥐를 생산하기 위한 프로토콜을 추가로 테스트하여 쥐 DRD2 유전자의 ATG 시작 부위를 표적으로 하는 Cre 재조합효소 코팅 서열을 엔지니어링하는 프로젝트를 설계합니다.
태어난 11마리의 자손 중 10마리는 5개의 프라임 상동성 군, 3개의 프라임 상동성 군, Cre 재조합효소를 검출하기 위한 내부 PCR 분석에서 양성이었습니다. 7개의 서로 다른 프로젝트를 요약하자면, 상동성 암 접합 및 DNA 염기서열 검증에 대한 PCR 분석을 통해 결정된 설립자 동물에서 평균 76%의 knock-in 성공률을 달성했습니다. 이 AAV 매개 DNA 전달 및 2세포 배아 전기천공법 파이프라인을 사용하여 최대 3KB 길이의 DNA 삽입에 대한 기존 접근 방식보다 훨씬 더 높은 knock-in 효율성을 경험했습니다.
또한 쥐 배아에서 이 절차의 사용을 입증했지만 표적 DNA 삽입을 생성하기 위해 다른 종에도 효과적으로 적용될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
