당사의 프로토콜은 CRISPR 편집의 정확한 통합과 간단한 시각적 감지를 위한 파이프라인과 편집 후 표현형의 예를 제공합니다. 이 접근법의 주요 장점은 CRISPR 편집 감지가 용이하여 성공적인 편집을 효율적이고 간단하게 식별 할 수 있다는 것입니다. 이 접근법은 제브라 피쉬에서 질병 관련 변이체의 간단한 생성 및 특성화를 허용합니다.
여기에서는 긴 QT 증후군을 검사하고 있습니다. 그런 다음 제약 요법에 대한 후속 연구를 탐색할 수 있습니다. 관심 유전자에 대한 제브라피쉬 오르토로그를 식별하여 녹인 표적 부위 서열을 절제하기 위해 두 개의 sgRNA 가이드를 설계하는 것으로 시작합니다.
Ensembl을 사용하여 주형을 만드는 데 사용되는 2킬로베이스 측면 서열을 포함하여 관심 유전자 서열 내에서 표적 부위를 찾습니다. CRISPOR와 같은 설계 소프트웨어 도구를 사용하여 Danio rerio 종과 Cas 효소를 선택하십시오. 두 가지 sgRNA 접근법의 경우 표적 엑손 앞에 하나의 sgRNA를 선택하고 바로 다운스트림 인트론 내에서 두 번째 sgRNA를 선택합니다.
선택된 sgRNA가 높은 특이성과 낮은 예측된 오프-타겟 결합을 갖도록 한다. CRISPOR 순위를 사용하여 최소한의 오프 타겟 바인딩으로 가이드를 식별합니다. 이제 PCR 기반 Sanger 시퀀싱 유전형 분석에 대해 가장 가능성이 높은 잠재적 오프 타겟 부위를 식별합니다.
2개의 sgRNA를 선택한 후, 각각에 대한 역방향 보체를 얻고, 돌연변이 앞에 있는 2개의 상보성 올리고 및 돌연변이의 하류에 있는 2개의 상보적 올리고를 얻는다. 각 올리고에 호환 가능한 제한 부위를 추가하여 선택한 플라스미드에 가이드를 통합합니다. 선택된 가이드 서열을 DR274 플라스미드에 통합하기 위해 5개의 프라임 BSA1 제한 부위를 사용하여 오버행을 생성하고 가이드의 5개 프라임 말단에서 BSA1 인식 부위를 엔지니어링합니다.
다음으로, PKHR5 플라스미드에 수용된 M 정맥 YFP 리포터 유전자를 측면화할 2개의 서열 단편을 선택하여 제브라피쉬에서 HDR에 대한 외인성 주형을 설계한다. 주형을 두 개의 세그먼트로 나누어 M 정맥 YFP 리포터 유전자의 양쪽에 삽입합니다. 코딩 시퀀스가 절단되지 않도록 분할 사이트가 인트론에 있는지 확인합니다.
PKHR5 플라스미드로의 클로닝을 용이하게 하기 위해 원고에 언급된 모든 필수 수정 사항을 통합합니다. 수정 후 약 40 분에 한 세포 단계에 배아를 주입합니다. 3 일간의 수정 후, 제브라 피쉬 유충을 0.3 % MS222가 들어있는 25mm 페트리 접시에 옮겨 자기 교정 반사를 잃을 때까지 마취시킵니다.
일단 마취되면 유충을 24 웰 플레이트의 우물로 옮깁니다. GFP 또는 YFP를 검출할 수 있는 현미경을 사용하여 유충의 눈에서 리포터 유전자 형광을 스크리닝합니다. 유충의 이미지를 캡처한 후, 리포터 유전자 발현의 존재 또는 부재를 문서화한다.
정확하고 정밀한 HDR 유전자 편집을 확인하려면 앞서 시연한 대로 수정 3일 후 유충을 먼저 마취시키고 핫샷 방법을 사용하여 꼬리 클립에서 게놈 DNA를 분리하여 유전형 분석을 수행합니다. 절제된 테일 클립을 15마이크로리터의 25밀리몰 수산화나트륨에 넣고 섭씨 95도에서 20분 동안 배양한 다음 1.5마이크로리터의 트리스 염산으로 중화합니다. 13, 800번 G에서 30초 동안 원심분리하고, 추출된 게놈 DNA가 포함된 상층액을 보유한다.
E3 미디어에서 유충을 복구하고 추가 연구가 필요한 경우 하우징 시스템으로 되돌립니다. 추출된 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 표적 및 잠재적 표적 외 부위의 PCR 기반 Sanger 시퀀싱을 수행합니다. 표적 프라이머 설계가 돌연변이 부위와 가장 가까운 sgRNA 결합 부위를 포착하는지 확인합니다.
관심있는 유전자로의 통합을 확인하기 위해 삽입된 상동성 암과 표적 유전자로부터의 전이를 검출하기 위해 별도의 시퀀싱 프라이머를 설계한다. 프라이머를 설계하여 상위 3개의 잠재적인 오프 타겟 사이트를 시퀀싱합니다. 각 제브라피쉬에 대해 식별 가능한 온/오프 타겟 유전형 분석, 심박수, 심낭 치수, ECG 표현형 및 리포터 유전자 데이터를 컴파일합니다.
YFP M 정맥 리포터 유전자 발현이 섬에서 관찰되어 성공적인 주형 통합의 긍정적 인 리포터 역할을했습니다. 리포터 유전자 양성 물고기는 Zkcnh2A에 R56Q 변이체를 도입하는 정확한 편집 G6A를 갖는 것으로 밝혀졌습니다. 눈 영역의 비율로 심낭 치수를 측정하는 것이 여기에 나와 있습니다.
제브라 피쉬에서 심장 재분극 장애와 관련된 심낭 부종이 증가하는 서맥의 추세가 R56Q 유전자 편집 유충에서 관찰되었다. 수정 후 3 일 동안 제브라 피쉬 유충 심장에서 ECG 기록이 여기에 표시됩니다. 이 접근법의 가장 중요한 측면은 CRISPR 절차에서 흔히 그렇듯이 가이드 설계입니다.
효과적인 가이드는 성공적인 CRISPR 편집에 필수적입니다. 더 많은 정밀도 또는 기타 기능을 허용하는 대체 CRISPR 방법을 따를 수 있습니다. 부가적으로, 생체내 유도성 편집 시스템을 제공하는 프라임 편집 복합체와 같은 큰 유전자가 삽입될 수 있다.
