우리는 그의 microrespirometer의 사용을 위한 닥터 폴 리와 니콜 바그너와 기술 지원에 대 한 알렉스 벨에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 투자는 NSERC 그랜트 B.J.S.에 의해

1. 옥수수 옥수수 속 감염
<ol><li>지 시 메이 스 (cv. 골든 자그마한) 성장까지 cobs 형성 되 고 실크 (약 60 일)를 시작 했습니다.</li>
	<li>호환 단일 미국 maydis 문화 긴장 이전 표준 프로토콜을 사용 하 여 설명7.</li>
	<li>앞에서 설명한7표준 프로토콜을 사용 하 여 옥수수 cobs 감염.</li>
</ol>2. teliospore 수확
<ol><li>고압 장비 (Büchner 퍼 널, Büchner 플라스 크, blenders, 250 mL 원심 분리기, 편평한 주걱, 병과 물) 표준 건조를 사용 하 여 적어도 30 분 살 균 121 ° C (물에 대 한 표준 액체 주기)에 주기.</li>
	<li>감염 된 속 식물 (약 28 ~ 35 일 게시 감염)에서 면도칼을 사용 하 여 제거 하 고 벤치 보호자에 덮여 쟁반에는 속 설정.</li>
	<li>면도날으로 속에서 있는 종양을 제거 하 고 비 커에서 수집.</li>
	<li>250 mL 실험실 믹서 기 컵 종양으로 약 1/3 전체 때까지 믹서 컵은 약 3/4까지 압력가 dH2O 추가 전체. 무 균 때까지 낮은, 믹서 기를 펄스는 종양을 방해.</li>
	<li>물 함정 그리고 1 L Büchner 플라스 크 진공 펌프를 연결 합니다.</li>
	<li>플라스 크에 큰 Büchner 퍼 널을 삽입 하 고 투박한 무명의 4 개의 층을 가진 Büchner 퍼 널의 바닥을 일렬로 세우십시오.</li>
	<li>진공 펌프를 켭니다.</li>
	<li>주걱으로 투박한 부스러기를 통해 무 균된 종양의 일부를 부 어.</li>
	<li>일부 dH2O을 통해 teliospores를 플러시 순서는 투박한 무명에 붓으십시오.</li>
	<li>DH2까지 반복 O는 투박한 무명을 통해 분명 하다.</li>
	<li>최대 teliospore 복구 되도록 필터에 무 균된 종양 물자를 포함 하는 투박한 아웃 찰 짜 십시오.</li>
	<li>1 L Büchner 플라스 크에 가까운 지 고 완전 한, 큰 삼각 플라스 크에 빈 고 따로 설정.</li>
	<li>투박한 무명의 새로운 조각을 필터에 넣고를 반복 (2.7-2.12) 단계는 종양의 모든 중단 하 고 필터링.</li>
	<li>압력가 250 mL 원심 병 및 5 분, 1000 x g에서 원심 분리기로 필터링 된 teliospores를 부 어 하 고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>모든 필터링 된 teliospores는 수송과 원심 분리에 의해 때까지 2.14 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>적은 양의 물과 전송 50 mL 원심 분리기 튜브에 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>5 분, 1000 x g에서 튜브 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>DH2O의 약 50 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고, 5 분, 1000 x g에서 튜브 원심는 상쾌한 가만히 따르다. 부드럽게 주걱와 그것의 dispose 회색 상위 레이어를 다쳤어요. 위에 회색 레이어는 더 이상 때까지 반복 합니다.</li>
	<li>건조는 샘플 진공 desiccator에서 하룻밤.</li>
	<li>사용 될 때까지 4 ° C에서 건조 teliospores를 저장 합니다.</li>
	<li>
원하는 경우, 발 아를 유도 하기 전에 구리 황산 염8 teliospores을 취급 합니다. 치료 하지 않으면 다음 샘플 순수 teliospores 나타내고 박테리아 또는 다른 오염 없는 것인지 teliospores의 철저 한 현미경 분석을 수행 합니다.
	<ol>
<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 teliospores의 대략 50 밀리 그램을 무게.</li>
		<li>포함 하는 teliospores 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 0.75% CuSO4 의 약 1.0 mL를 추가 합니다. 위쪽 및 아래쪽 3 h에 대 한 샘플 교 반 이어서 CuSO4 솔루션에는 teliospores를 일시 중단 하는 플라스틱.</li>
		<li>5 분 동안 2500 x g에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. Resuspend 살 균 물 teliospore 펠 릿, 원심 분리, 반복 하 고는 상쾌한 제거.</li>
		<li>단계 2.21.3 두 번 더 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. teliospore 생존 능력 및 발 아 시험
<ol><li>그들의 생존 능력을 평가 하는 1.5 mL microcentrifuge 관에서 미국 maydis teliospores의 약 10 mg을 발 아의 타이밍 무게.</li>
	<li>Biosafety 내각에 스 황산 (160 µ g/mL)와 보충 감자 포도 당 국물 (PDB, 24 g/L)를 준비 합니다.</li>
	<li>PDB의 500 µ L에는 teliospores를 일시 중단 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 teliospores의 모든 덩어리 헤어 플라스틱.</li>
	<li>Teliospore 정지 압력가 250 mL 삼각 플라스 크는 PDB의 10 mL를 포함 전송.</li>
	<li>28 ° c 12-16 h 90 rpm 동요 플라스 크를 품 어.</li>
	<li>Biosafety 내각에서 발 아 하 고 현미경 슬라이드를 준비 하도록 유도 하는 teliospores의 20 µ L 샘플을 제거 합니다.</li>
	<li>
존재 하는 발 아의 단계 및 세균 오염 물질의 존재를 평가 시각적으로 현미경을 사용 하 여.
	<ol>
<li>teliospores의 수를 계산 하는 hemocytometer를 사용 하 여 V를 통해 나의 단계와 출 아 했다가지고 % 결정.</li>
		<li>경우에 단계 I teliospores는, teliospore 발 아를 평가 하기 전에 24 시간 총 플라스 크를 품 어 계속. 샘플을 실행 가능한 비 deeming 전에 최대 48 h에 대 한 보육을 계속 합니다.</li>
		<li>세균성 오염 있으면 스 황산 (160 µ g/mL) 뿐만 아니라 대 황산 (50 µ g/mL)와 PDB를 보충 하 고 단계 3.1 3.7 반복. 세균 오염 계속 되 면 황산 구리와 teliospores를 치료 하 고 단계 3.1 3.7를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 호흡 모니터링에 대 한 발 아의 유도
<ol><li>동일한 금액을 무게 (예., 50 mg) 각 호흡 실험에 대 한 teliospores의.</li>
	<li>Biosafety 내각에 압력가 호흡 약 실에 teliospores을 추가 합니다.</li>
	<li>채우기 PDB (24 g/L)와 챔버 스 황산 (160 µ g/mL)과 대 (50 µ g/mL)와 보충.</li>
	<li>아래로 teliospore 정지를 만드는 플라스틱.</li>
	<li>공기가 꽉 인감을 만들려고 챔버 챔버 뚜껑을 놓습니다.</li>
</ol>5. 산소 소비 속도 (OCR) 측정을 얻기
<ol><li>물 목욕 (28 ° C에 미리 데워) 내부 챔버 선반에 챔버를 놓습니다.</li>
	<li>O2 프로브는 챔버의 개통 안에 놓습니다.</li>
	<li>"SensorTrace 속도" 프로그램에 실시간으로에서 표시 하는 데이터 요소를 모니터링 하 고 프로브 (~ 3 분 후 프로브는 챔버에 배치 됩니다)을 안정화 하자.</li>
	<li>O2 수준을 지속적으로 6 h 2 s 간격 기록 측정 측정을 "측정"을 클릭 합니다.</li>
	<li>측정을 중지 하 고 각 샘플 분석을 위해 단계 4.1-5.4 반복 합니다.</li>
	<li>클릭 하 여 Microsoft Excel로 데이터를 내보내기 "파일 | 수출 | .Xls로 저장 "합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>
OCR을 계산
	<ol>
<li>"Within_Rates" 탭에서 내보낸된 Excel 파일에서 각 챔버 측정 (nmol/h)에 대 한 "속도"를 기록 합니다.</li>
		<li>각 실험 샘플에 대 한 수정 된 OCR 값을 얻기 위해 실험 시료 챔버의 "속도"에서 빈 챔버의 "속도"를 빼기 고이 숫자의 절대 값.</li>
		<li>Teliospores의 밀리 그램 당 총 OCR 대량 사용 하는 휴대 하 여 수정 된 절대 OCR 값을 나누어 계산 합니다.</li>
		<li>평균 각 변형에 대 한 "teliospores의 밀리 그램 당 OCR" 값을 복제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절 한 통계적 방법을 사용 하 여 데이터를 분석 (예., 스튜던트 t-검정, 분산 분석) 다른 통계 소프트웨어의 Microsoft Excel을 사용 하 여.</li>
	<li>원시 데이터를 그래프, 그래프 하고자 하는 각 시간 점에 대 한 남아 있는 산소의 비율을 계산. 자체에 나누어 첫 번째 읽기 (100% 산소 남은) 100을 곱하면, 다음 첫 번째 독서에 나누어 각 후속 읽기 그리고 산소 챔버에 남아 %를 100을 곱하십시오.</li>
</ol>7. Teliospore 발 아 발 아의 다른 단계에서 Teliospores을 유도
<ol><li>PDB (24 g/L) biosafety 캐비닛에 스 황산 (160 µ g/mL)와 보완을 준비 합니다.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge 관으로 미국 maydis teliospores의 약 10 mg을 놓습니다.</li>
	<li>PDB의 500 µ L에는 teliospores를 일시 중단 합니다. 부드럽게 혼합 매체에 teliospores의 아무 덩어리까지 피 펫.</li>
	<li>Teliospore 서 스 펜 션 스 황산으로 보충 하는 PDB를 포함 하는 압력가 250 mL 삼각 플라스 크에 전송.</li>
	<li>90 rpm에서 떨고 28 ° C에서 하룻밤 플라스 크를 품 어.</li>
</ol>8입니다. 페 트리 접시 및 Micromanipulator 준비
<ol><li>
Microcapillary 준비 및 샘플 컬렉션에 대 한 방울의 pipetting 행 페 트리 접시 (57 c m2)를 준비 합니다.
	<ol>
<li>페 트리 접시의 위쪽에 5 µ L (x 4) dH2O 방울 플라스틱.</li>
		<li>샘플 컬렉션에 사용할 페 트리 접시에 RNA 안정화 솔루션의 2 µ L (x3) 플라스틱</li>
		<li>페 트리 접시에 teliospores 출의 5 µ L (x 30) 물방울 플라스틱</li>
	</ol>
</li>
	<li>페 트리 접시에 미네랄 오일 15 mL를 추가 합니다. 모든 방울 진행 하기 전에 기름에 의해 보호 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>15 µ m 내부 직경, 1 mm 플랜지, 55 m m 길이와 각도 20 ° 팁 microcapillary microcapillary 홀더에 그것을 배치 하 고 미네랄 오일에 모 세관 작용 광 유는 microcapillary를 입력 하면 그것을 물속으로 준비 합니다. 물 방울을 가져오기 전에 microcapillary에서 압력을 릴리스 합니다. 준비 물으로 microcapillary 발음.</li>
</ol>9. 단계-특정 출 Teliospores의 격리
<ol><li>micromanipulator의 컨트롤을 사용 하 여 이동 준비 microcapillary 발 아 방울 중 하나. 작은 물방울을 관통 하 고 microcapillary, 낮은 관심의 발 아 단계에서 germinating teliospore까지 microcapillary의 입을 가져다.</li>
	<li>천천히 발음 germinating teliospore 캡처. 발음은 teliospore에서 microcapillary를 입력 했습니다 일단 중지 합니다. 약 5 teliospores는 microcapillary에 도착할 때까지 반복 합니다.</li>
	<li>micromanipulator와 microcapillary를 RNA 안정화 솔루션의 컬렉션 방울을가지고. 드롭릿에 관통 하 고는 작은 물방울에는 teliospores를 주입.</li>
	<li>8.1 8.3 단계를 반복 하 여 약 1000 teliospores 체포 되었습니다.</li>
</ol>10입니다. 컬렉션 물방울의 복구
<ol><li>컬렉션 물방울을 pipette 고는 RNase/DNase 무료 2.0 mL microcentrifuge 튜브의 뚜껑을 전송. 조심 스럽게 컬렉션 물방울을 방해 하지 않고 한 피 펫과 미네랄 오일 제거.</li>
	<li>teliospores를 사용 하 여 RNA 격리 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한.</li>
</ol>

<ol>
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저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 공개할 수 있다.

담 biotrophic 식물 병원 균을 일으킬 작물 손실에 수십억 달러의 매년. 이러한 병원 균의 대부분 곰 팡이 분산 및 유성 생식에 통합 되는 teliospores 생산. 개발의 지식과 teliospores의 발 아를 확보 하는 것이 이러한 곰 팡이로 인 한 치명적인 질병의 확산을 이해 중요 합니다. 주요 제어 지점에서 분자 변화를 파악 하기 위해 우리 생리 적 변화와 발 아의 다른 단계에서 teliospores을 다른의 타이밍을 식별 ?...

Smut 버섯 (Ustilaginales) 잔디, 옥수수, 보 리, 밀의 중요 한 곡물을 포함 한 작물 손실에 수십억 달러를 일으키는 감염 1600 이상의 종 이루어져 매년1. 이 균 류는 세포 벽을 착 음울는 분산 에이전트는 teliospores의 생산 특징입니다. Teliospores는 호스트 식물 사이의 분산의 스트레스 중 유전 물질을 방패로 작동 하 고 년2에 대 한 휴면 상태에 유지할 수 있습니다. 따라서, teliospores는 질병 확산의 필수적인 구성 요소.
Teliospore 생물학을 공부 하기 위하여 우리의 실험실 모델 smut 균을 Ustilago maydis (미국 maydis)은 '옥수수의 일반적인 검 댕' 질병의 인과 대리인을 이용 한다. 성숙한 미국 maydis teliospores 성장 검거, 감소 된 세포 물질 대사, 세포 호흡3의 낮은 수준에 의해 특징입니다. 유리한 환경 조건에서 (예., 특정 설탕의 존재), 미국 maydis teliospores 발 아 하 고 감염의 새로운 라운드를 시작할 수 있는 감수 분열, 생산 basidiospores 완료. 발은 증가 한 호흡, 대사를 반환 활동 및 발 아4의 현저한 형태학 단계를 통해 진행이 특징 이다.
그러나 증가 한 호흡 및 대사 기능을 포함 하는 발 아 초기 단계,, 변화의 형태학 표시가 없습니다. 원래 미국 maydis 에 호흡 변화 측정 50 년 전, 바르 부르 크 플라스 크 장치5와 manometrically 산소 소비량 측정 실행 되었다. 클라크-유형 microrespirometer을 사용 하 여 발 아의 시간 과정을 통해 산소 소비량을 측정 하 여 호흡 teliospore 발 아 동안에 정확한 변화를 공부 하 고 새로운, 간단한 방법을 개발 했습니다. 우리는 이전 야생-타입 사이의 호흡 속도에 변화를 공부 하이 메서드를 사용 미국 maydis 단일 세포 및 결함이 있는 미토 콘 드리 아6, 돌연변이가지고 여기에 프로토콜 teliospore 호흡 동안에 변화를 공부 하 발 아입니다. 이 우리가 발 아 초기 분자 이벤트 조사 개시 후 적절 한 시기에 teliospores을 타겟팅 할 수 있도록 호흡의 타이밍을 정확 하 게 식별 하는 수단을 제공 합니다. 일단은 promycelia, teliospore에서 나온다 하지만 비동기 자연 조사에 대 한 특정된 단계에서 충분 한 teliospores의 절연을 저해 발 아의 진행을 현미경으로 다음 수 있습니다. 우리는 비슷한 물리적으로 발 아의 고유한 형태소 단계에서 teliospores 수집을 체 외에서 수정에 사용 되는 기정 기법 개발.

<table><tbody><tr><td>Streptomycin Sulfate</td><td>BioShop</td><td>STP101</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>BioShop</td><td>KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Potato Dextrose Broth</td><td>BD Difco</td><td>254920</td><td></td></tr><tr><td>1 L Waring Laboratory blender</td><td>Waring</td><td>7011S</td><td></td></tr><tr><td>Cheesecloth</td><td>VWR</td><td>470150-438</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5310-0250</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Unisense MicroRespiration system&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroRespiration Sensor (O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Unisense</td><td>OX10</td><td></td></tr><tr><td>MicroOptode Meter Amplifier</td><td>Unisense</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MR-Ch Small</td><td>Unisense</td><td>MR-Ch</td><td></td></tr><tr><td>SensorTrace Rate Software</td><td>Unisense</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MicroRespiration Rack</td><td>Unisense</td><td>MR2-Rack</td><td></td></tr><tr><td>MicroRespiration Stirrer</td><td>Unisense</td><td>MR2-Co</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Microdissection system&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coarse Manipulator</td><td>Narishige</td><td>MMN-1</td><td></td></tr><tr><td>Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic Microinjector</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>TransferTip (ES)</td><td>Eppendorf</td><td>5175107004</td><td></td></tr></tbody></table>

investigating teliospore germination using microrespiration analysis and microdissection

흑 수병 균은 여러 가지 파괴적인 농업 질병의 etiological 대리인. 그들은 두꺼운 분산 에이전트는 teliospores의 생산에 의해 특징은. Teliospores는 수십 년 동안 휴면 유지 수 있습니다. 휴면 낮은 신진 대사 속도 의해 특징 이다, 생 합성 고분자를 일시 중지 하 고 호흡의 레벨을 크게 감소. 필요한 환경 신호를 받으면 teliospores 감염의 새로운 라운드를 시작할 수 있는 단일 셀을 생산 하는 출 아 할. Teliospore 발 아 생 합성 고분자, 증가 한 호흡 및 극적인 형태 변화의 재개에 의해 특징입니다. 발 아의 초기 단계에서 세포 호흡에 변화를 정확 하 게 측정 하기 위해 간단한 프로토콜 클라크-유형 respirometer 고용 개발 했습니다. 발 아의 나중 단계 특정 형태학 상 변화에 의해 구별 된다 하지만 발은 비동기. 우리는 뚜렷한 발 아 단계에서 teliospores를 수집 수 서 기술 개발.

우리는 휴면 teliospores 전시 호흡 (~ 1075 µ / h/mg) 출에 비해 낮은 수준 확인 teliospore 휴면 및 발 아 동안 호흡에 변화를 측정의 클라크-유형 microrespirometer 기반 방법을 사용 하 여, teliospores (~ 2,614 µ / h/mg; 그림 1A)입니다. 이 휴면 teliospores와 teliospores 발 아를 유도 하는 호흡의 평균 속도 ~2.4-fold 변화를 나타냅니다. 또한, 우리는 발 아를 유도 하는 teliospores...

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Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut 버섯 많은 파괴적인 농업 질병을 일으킬. 그들은 환경 큐에 응답에 발 아 휴 teliospores로 분산 됩니다. 우리는 발 아 동안에 분자 변화를 조사 하기 위해 두 방법 개요: 호흡 증가 대사 활성화를 감지 측정 하 고 평가 고유한 형태소 단계에서 teliospores를 분리 하 여 분자 이벤트를 변경.

Microrespiration 분석 및 기정을 사용 하 여 Teliospore 발 아 조사

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.2K 조회수.  Trent University. Smut 버섯 많은 파괴적인 농업 질병을 일으킬. 그들은 환경 큐에 응답에 발 아 휴 teliospores로 분산 됩니다. 우리는 발 아 동안에 분자 변화를 조사 하기 위해 두 방법 개요: 호흡 증가 대사 활성화를 감지 측정 하 고 평가 고유한 형태소 단계에서 teliospores를 분리 하 여 분자 이벤트를 변경.

비디오: Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

연구

생물학

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

세균 포자 발아 동안 코어 텍스 조각 검출

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

면역학 및 감염병학

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

매우 작은 공간에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능 연구를 미세 장치 개발

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

생체공학

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Germinosomes과 새 균의 subtilis 포자에 내부 막의 시각화

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Streptomyces 발달 돌연변이의 영상 및 현미경 평가

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

라이브 현미경 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 아스퍼길러스 니둘란스 성장률의 정량적 분석

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...