이 프로토콜은 인스티투트 드 Biologie Physico - Chimique, 파리, 프랑스의 프란시스 - 엉드헤 Wollman의 실험실에서 배운 기술을 기반으로합니다. 저자는 원래 Chlamydomonas 유전자 기술에 DBS를 도입 재클린 지라 - Bascou에 분께. 저자 실험실에서 Chlamydomonas 연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 상을 MCB - 0646350에서 지원됩니다.

1 부 : gametogenesis에 대한 종자의 준비 참고 : 모든 조작은 실온에서 실시한다. 높거나 낮은 온도는 발아 접합자의 속도에 영향을 미칠 것이며, 부정적인 생존에 영향을 줄 수 있습니다. 중요한 고려 사항 : 성관계를 할 수있는 변종이 견고하게 성장 및 곰팡이 또는 세균 오염 무료입니다하는 필수 좋습니다. 변종은 정기적으로 전송되지 않은 경우, 풍부한 매체에 통로 gametes의 생성을 선행해야합니다. <ol><li> 성관계를하는 종자는 TAP 판 (100 × 15 ㎜), 플레이트 당 1-2 종자로 전송됩니다. 세포는 가로 1cm에 대해 집중적으로 스트립에서 성장한다. </li><li> 견고하게 성장하는 세포의 두꺼운 층이 존재 때까지 탭 접시에 부화는 중간 전송 필요한 경우와 계속해야합니다. 일반 사용 야생 형 변종은 며칠없이 구절에만 걸릴 수 있습니다 반면 최근 passaged되지 않은 변종이 한 구절 1 주일 총 필요할 수 있습니다. 광 구분 돌연변이 추가 시간이 필요할 수 있습니다. </li><li> 질소에 대한 결함되며 gametogenesis를 유도하기 위해 시작합니다 N10 플레이트에 TAP 플레이트의 모든 세포를 전송합니다. 그들은 TAP 판에 존재했다만큼, 두꺼운 슬래브로 세포를 전송합니다. 이것은 세포의 후속 수집을 용이하게합니다. N10 3 일 후에, 세포는 gametogenesis를 받아야 준비가되어 있습니다. 세포 분열이 N10에서 속도가 느린 것입니다, 그러나 전지는 진한 녹색 유지됩니다. 가능한 zygotes를 얻을 수 없습니다와 같은 오염 종자는 폐기해야합니다. </li></ol> 2 부 : 번식 <ol><li> 각 변형이 50 ML erlenmeyer 플라스크에 전송하고 약 2.5 ML 멸균 증류수에 resuspended 있습니다. 이 중 와이어 루프 또는 살균 막대를 사용하여 할 수 있으며, 중요한 것은 세포가 잘 대단히 짧은 시간에 중단이 아니라는 점이다. 물의 정확한 볼륨으로 눈으로 gauged 세포 농도가, 각 변형에 대한에 대한 동일하도록 조정해야합니다. </li><li> 셀 2 시간 동안 강한 조명 (1.260 μ의 E / m 2 / 초) 아래의 동요, 세포가 운동성이있는 gametes 될 것이다 어떤 시간 동안입니다. 운동성은 가벼운 현미경으로 확인하여야한다. gametes이 저조한 수영 경우, 비효율적인 짝짓기가 될 가능성이 높습니다. 그러나, 심지어 제대로 운동성이있는 계통이 감소 주파수를 짝짓기합니다. </li><li> 의 다음 동일한 볼륨 마운트 + 및 MT - gametes는 단일 50 ML 플라스크에 결합됩니다. Gametes는 교반없이 강한 조명 (1.260 μ의 E / m 2 / 초) 아래에 남아 있습니다. </li><li> 짝짓기는 빛을 현미경으로 바로 확인하실 수 있습니다. gametes의 쌍 신속하게 형성하고, 빠르게 움직이는 세포 flagella에 참가으로 표시됩니다. 짝짓기가 매우 빠른 것으로 나타나는 경우, 샘플은 zygotes의 생성을 위해 30 분 -1 시간 이내에 촬영한한다. 그렇지 않다면이 옵션이지만, 짝짓기는 각 시간을 확인하실 수 있습니다. zygotes의 최적 밀도를주는 시간이 십자가 사이에 크게 달라질 수 있기 때문에 1 시간, 2 시간, 3 시간 및 4 시간 후에 gametes 예를 결합 후 다른 시간에 짝짓기 혼합물의 aliquots을하는 것이 좋습니다. 접시마다 3-4 곳, 이것은 300 μL 시료에 TAP - 3% Difco 한천 60 × 15mm 플레이트를 전송하여 수행됩니다. 이 짝짓기 쌍을 방해 수 있으므로 짝짓기 혼합물을 선동하지 않도록주의하십시오. 그것이 낮은 가격에 아거스 미만의 오염 물질을 가지고 있으며, 그것은 현미경으로 zygotes을 볼 쉽게되므로 Difco 한천이 사용됩니다. 사용하지 않는 짝짓기 혼합물은 하룻밤 사이에 술병에 남아있을 수 있으며, 짝짓기 반응의 품질은 다음날 분명한 것입니다. 짝짓기가 효율적인 경우 zygotes은 술병의 벽이나 바닥을 준수하고, 매체는 명확 나타납니다. 플라스크의도 동요가 zygotes을 이동시키다되지 않습니다. 혼합물이 합리적인 활기와 흥분되는 유리에 아무것도 스틱은 다음 교미 비효율적 않았거나 자리를 대신하지 않은 경우. </li><li> 어떤 표면 액체가 흡수되기 전에 짝짓기 혼합물을 포함하는 TAP - Difco 접시는 열려 뚜껑과 살균 모자 건조됩니다. 접합 포자 성숙은 어둠 속에서 자리를 취할 것입니다 때문에 접시는 일반적으로 다음 호일에 싸서 18 시간 동안 조명 (700 NE / m 2 / 초)에 남아 있습니다. 변종은 시간과 날짜를 짝짓기 것은 접시와 호일 모두에 기록됩니다, 교차. 접합자 발아 효율이 점차 감소하지만 접시는 5~7일 저장되며 더 이상 보관하실 수 있습니다. </li></ol> 파트 3 : Tetrad 해부 <ol><li> 식물 세포는 같은 메스로 무딘 칼날을 사용하여 짝짓기 혼합물의 건조 명소를 긁어 냈해야합니다. 블레이드는 3 % 한천을 밀접하게 버티자 zygotes의 영역을 노출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 단계는 일반적으로 zygotes가 다음날 아침으로 germinated있다 있도록, 오후에 이루어집니다,하지만 두 번째, 식물 부문 공사를하지 않은8 자손을 얻을 수 있습니다. Chlamydomonas의 생물학 자들이 신속하게 그들은 식물 세포보다 큰, 그리고 검은 윤곽을 제공하는 두꺼운 접합 포자 벽 기능이 있기 때문에, 현미경 zygotes를 인식할 수 배웁니다. Zygospores는 종종 노란색 표시뿐만 아니라, 다소 녹색 수 있습니다. 식물 세포가 쉽게 옆으로 이동하는 동안 가장 중요한 캐릭터들이 한천에 충실한다는 것입니다. 그러나, 접시면하는 것은 지나치게이 경우되지 않습니다 건조됩니다. 또한, 짝짓기 혼합물이 너무 밀도 있었다면, zygotes 개인 zygotes의 전송이 어렵거나 불가능한 것입니다 매트를 형성 수 있습니다. 적절한 밀도는 2.1 단계에 설립하고, 신속하게 경험을 배울 것입니다. </li><li> 유리 바늘은 zygotes를 수집하고 tetrad 자손 분리를위한 준비가되어 있습니다. 이들은 부러 수있는 긴 얇은 스레드를 생성하는 작은 불꽃에 3mm 유리 막대를 당겨 준비가되어 있습니다. 이러한 테이퍼 엔드 팁이 낮은 화염 (예 : 알코올이나 불타는 일치)에서 간단한 가열하여 고리에 smoothed 또는 구부 수 있습니다. 그들은 상당히 쉽게 휴식 이후 특히 경험이 사용자를 위해, 3 개 이상의 유리 바늘을 준비합니다. </li><li> Zygotes는 작은 말뚝에 유리 바늘을 사용하여 3% TAP - Difco 플레이트에 모여 있습니다. zygotes을 포함 한천의 광장 (최대 0.5 cm 2) 형성과 무딘 메스를 사용하여 excised 수 있습니다. 그런 다음, 한천 블록은 15mm 1.5 % TAP - Difco 플레이트에 얼굴을 아래로 배치하고, zygotes를 배포, 접시 상단에서 1.5 cm에 대한 수평선을 따라 미끄러졌습니다. 최고 수평선, 그리고 약 1.5 cm 가로 0.5 cm 수직 간격 격자는 접시의 뒷면에 새겨져 있습니다. 그리드는 tetrad 자손 (격자 또한 절개의 하루 에칭 수있는)을 분리를위한 가이드로 다음날 사용됩니다. 마지막으로, 개별 zygotes는 판 당 20-30에 대한 zygotes와 함께, 각 수직선과 상단 수평 라인의 교차로로 이동합니다. 겨우 12 정도가를 해부한다, 모든 접합자는 germinates 아니라, 일부가 파열되기 전에 두 번 분할되지만, 이렇게 여분 zygotes이 필요합니다. </li><li> 배포 후 실수로 3 % 한천 플레이트에서 전송되었습니다 zygotes, 그리고 식물 세포는 클로로포름의 얇은 (1~2밀리미터) 레이어를 포함하는 유리 접시 이상 30 초 동안 거꾸로 번호판을 노출에 의해 살해됩니다. 접시와 클로로포름 사이의 거리는 약 5cm해야합니다. 너무 클로로포름을 사용하는 경우 거리가 너무 작거나 큰 경우, 또는 한 위험이 중 zygotes를 죽이고, 또는 식물 세포를 죽일 수 없습니다. zygospores가 선택성을 보장하기 위해, 발아 판을 배포했습니다 후 클로로포름 치료가 즉시 이루어져야합니다. </li><li> 발아는 대부분의 종자에 대한 16-20시간이 걸리지만 유전자형과 zygotes의 나이가 달라집니다. 발아 들어, 접시는 낮은 조명 (239 NE / m 2 / 초) 아래에 배치, 또는 매체에 비추어 휴지로 접시를 덮고으로 흐리게. </li><li> Germinated zygotes는 그들 내부의 딸 세포로 부어하거나 때로는 파열 세포로 현미경으로 확인할 수 있습니다. 접합 포자가 파열되지 않은 경우 발아가 발생한다면, 부드럽게 유리 바늘로 감동하면 벽을 깰 것이다. 딸 세포가 부드럽게 접합자 아래의 격자 점에 끌려 있습니다. 유리 바늘의 압력에 의해 한천에서 발표 액체 매체의 소량의 세포를 캡처하고, 바늘 뒤에이 &quot;웅덩이&quot;를 드래그하여이 작업을 수행하는 가장 쉬운 그것을 것입니다. 하나는 접합자가 아닌 두 번 나누어 가지고 식물 세포를 해부했다는 &quot;보험&quot;의 한 형태로 그 간격 네 개의 딸 세포에서이며, 접합 포자 벽의 &quot;스킨&quot;은 유지됩니다. </li><li> 보이는 clonies가 후속 분석을 위해 선택한 수있을 때까지 해부 자손은 적절한 조건 하에서 재배하고 있습니다. 플레이트는 오염에 대해 매일 모니터링해야합니다. </li></ol> 참고 : 식물 diploids의 생성이 여기에 적용하지만, 기본적으로 두 부모 변형의 성장을 지원하지 않습니다 매체에 짝짓기 혼합 도금 포함하지만, diploid의 성장 (예 : 두 개의 서로 다른 auxotropic 마커)을 지원하지 않습니다이다. 접시는 zygotes의 형성을 피하기 위해 빛을에 보관됩니다.

<ol>
	<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydomonas+Sourcebook:+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use.">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 119-273 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

유전자 분석 Chlamydomonas에서 간단하지만, 그것은 특정 기술이 gametes와 별도 tetrad의 자손을 생성해야합니다. 건강 변종과 함께, 기술은 쉽게 찾았습니다. 일부 돌연변이 변종으로, 그것은 예술의 더되고, 독자들은 역사 노트와 실용적인 힌트에 대한 최근 출판 Chlamydomonas의 Sourcebook의 볼륨 1을 참조해야합니다. 또한, 그것은 기본적인 테마에 많은 변화 접합자 유통 및 해부의 패턴, 유도 ...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CC-125</td>
<td>Mating type plus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC-124</td>
<td>Mating type minus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-Acetate-Phosphate (TAP) </td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N10</td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Stainless-Steel Blades</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-916-5B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Surgical Blade Handles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-914-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Metal Scalpels</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-920A</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mating and tetrad separation of chlamydomonas reinhardtii for genetic analysis

단세포 녹색 알가<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt; (<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;) 때문에 간단한 생활주기의 세포 생물학과 유전학의 다양한 분야에서 연구 인기 유기체되어, 유전자 분석, 게놈 자원, 그리고 핵의 transformability 두 organelles을위한 성장과 조작의 용이성. 유전자 접근 방법을 사용하는 경우 짝짓기 변종은 일반적인 관행입니다<em&gt; Chlamydomonass</em&gt; 지배력 분석을위한 식물 diploids를 만들거나 확인할 핵 대 organellar 상속에 tetrad 절개를 따라 allelism를 테스트, epistasy을 분석하거나,지도를 기반 복제의 목적을 위해 인구를 생성합니다. 또한, 유전자 십자가는 정기적으로 특정 핵 genotypes와 organellar genotypes을 결합하는 데 사용됩니다. 여기 gametogenesis, 짝짓기, 접합자 발아 및 tetrad 분리에 대한 표준 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 덜 익숙한 과학자 유전 방식을받을 수있는 것입 단계의 쉬운 따라 시리즈로 구​​성되어 있습니다<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;. 주요 매개 변수와 문제가 장소가 설명되어 있습니다. 마지막으로, 자세한 내용 및 다른 방법에 대한 자료를 제공합니다.

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Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

교미 및 tetrad 분리는 유전자 분석을 위해 필요합니다<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt;. 여기 gametogenesis, 짝짓기, 접합자 발아 및 tetrad의 해부에 대한 표준 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 덜 익숙한 과학자 유전 방식을받을 수있는 것입 단계의 쉬운 따라 시리즈로 구​​성되어 있습니다<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;.

번식과 Tetrad 분리 Chlamydomonas reinhardtii 유전자 분석을위한

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

mating-tetrad-separation-chlamydomonas-reinhardtii-for-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

19.8K 조회수.  Cornell University. 교미 및 tetrad 분리는 유전자 분석을 위해 필요합니다 Chlamydomonas reinhardtii. 여기 gametogenesis, 짝짓기, 접합자 발아 및 tetrad의 해부에 대한 표준 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 덜 익숙한 과학자 유전 방식을받을 수있는 것입 단계의 쉬운 따라 시리즈로 구​​성되어 있습니다 Chlamydomonas.

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Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

마우스에 대한 진한 / 라이트 전환 테스트

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

연구

생물학

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

성인 마우스 Hippocampal 이가있는 이랑의 해부

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...