이 작품은 지원 연구비에 의해 과학적 연구에 대 한 (15 K 07147, 17 K 07419) JSP에서 (히로시 종합, 히로코 사노), (하이), 이나 모리 재단 연구 그랜트와 공동 사용/연구 센터의 프로그램 발달 의학에 분자 발생 학, 유전학, (HS)에 쿠마 모토 대학 연구소. 우리 이미징 시스템을 사용 하 여 그들의 도움에 대 한 박사 아즈사 삿포로 야마다 다 이치 씨 감사 합니다.

1입니다. 애벌레 뇌 Explants의 준비
<ol><li>이미징 챔버를 확인 합니다. 참고: 안정적인 녹음 두뇌 explants 곁 수 있어야 합니다. 여기, 낮은-비용, 손으로 만든 이미징 챔버는 Ca2 + 이미징 시스템에 사용 됩니다.<ol>
<li>집게를 사용 하 여 쉽게 장착 (1.3, 그림 1단계)를 만드는 애벌레 두뇌의 복 부 신경 절에 대 한 덴트를 만드는 플라스틱 문화 접시 (35 m m x 10 m m)의 하단 중앙 스크래치.</li>
		<li>이쑤시개와 덴트의 양쪽에 superglue의 작은 방울을 놓고 접착제를 텅스텐 막대 (0.125 m m, 6 ~ 7 m m 길이)를 연결 합니다.</li>
		<li>퍼 티 같이 재사용할 수 있는 접착제의 작은 조각을 사용 하 여, 확인 (10 m m 직경에서 및 높이 3 m m) 원형 벽 주변 덴트 (그림 1). 참고: 벽 내부의 공간 나중으로 채워질 것 이다 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 0.14 M NaCl, KCl, 0.0027 M 0.01 M 포43-, 25 ℃에서 pH 7.4 ± 0.05).</li>
	</ol>
</li>
	<li>동물 준비 참고: 칼슘 이미징, 칼슘 표시기, GCaMP6s, 표현 된다 세포 유형의 관심, 일반적으로 조직의 특정 GAL4 UAS-GCaMP6s의 조합을 사용 하 여 이루어집니다. 신호 후보 수용 체를 통해 중재 된다 되도록 GCaMP6s 수용 체에 결함이 있는 돌연변이 또한 표현 된다.<ol>
<li>다른 genotypes 야생 타입 등 돌연변이 대 한 실험 비교 필요한 경우 GCaMP6 식 수준 변화와 발달 단계에 따른 생리 적 차이 피하기 위해 일치 시험 애벌레 나이.</li>
		<li>포함 하는 음식의 표면에 계란-누워 있도록 8 h에 대 한 표준 비행 거리 음식 문화 유리병에 부모의 파리 (30 파리 각 섹스에 대 한)을 유지. 25 ° C와 60-70% 상대 습도에서 12 h 빛 어두운 주기에서 질량에는 문화 애벌레</li>
	</ol>
</li>
	<li>애벌레는 두뇌의 해 부<ol>
<li>(AEL) 누워 계란 후 90-120 h, 애벌레를 수집 하 고 그들에 게 부착 식품 이물질 제거를 증류수와 적어도 3 번을 씻어.</li>
		<li>장소는 1.5 인치 사각 시계 유리에 유 충은 얼음 차가운 PBS 가득합니다. 참고: 다음 두 단계 해 현미경이 시계 유리에 수행 됩니다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 부드럽게 유 충의 중간 부분을 잡아. 다른 집게를 사용 하 여 입 후크를 유 충을 포함 하는 시체의 나머지 부분에서 뇌의 앞쪽 부분을 부드럽게 입 고리를 당겨. 참고: 또는, 수술가 위 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>겸 자에 의해 앞쪽 끝을 누른 유 충을 안으로 밖으로 설정 합니다. 외부 조직 imaginal 디스크, 지방 기관, 링 선 등 뇌에 연결을 제거 합니다. 부드럽게는 mouthparts에서 뇌를 분리 합니다.</li>
		<li>PBS의 200 µ L 이미징 챔버에 퍼 티 같은 재사용 접착제의 링의 안쪽에 적용 됩니다. 부드럽게 파스퇴르 피 펫에 PBS 가진 해 부 뇌를 빨 아 하 고 이미징 챔버로 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두뇌 이미징 챔버로 설정<ol>
<li>집게를 사용 하 여 복 부 신경에서 연장 하는 근육 섬유를 잡아. 텅스텐 와이어 아래 덴트에 두뇌를 부드럽게 삽입 합니다.</li>
		<li>다른 집게를 사용 하 여, 풀 텅스텐 와이어를 약간 장소 두뇌 이미징 (그림 1)에 대 한 올바른 위치에.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ca2 + 형광 이미지 수집
참고: PBS에 몰입 하는 뇌 explants는 몇 군데 물 침수 렌즈 X 20을 갖춘 형광 현미경을 사용 하 여 (없음 = 0.5). PBS는 뇌에서 세포를 활성화 하지 않습니다. Z 축 이미지, 필요한 경우 활성화 압 전 렌즈 발동기로 대물 렌즈 마운트입니다. 회전 디스크 confocal 머리는 시간 분해능을 향상 하는 데 사용 됩니다. 낮은 조명 촬영에 대 한 전 하 결합 소자 카메라 멀티 전자 현미경에 장착 됩니다. GCaMP6s 형광 이미징 (여기/방출: 488/509 nm) 여기 dichroic 빔 스플리터와 방출 필터 488 nm 레이저를 요구 한다 (예., 528 ± 38 nm 대역 대역 통과 필터).
<ol><li>포함 하는 현미경 뇌 explant 이미징 챔버를 놓습니다.</li>
	<li>그것은 PBS를 건드리면 때까지 대물 렌즈를 낮춥니다. 필드 밝은 조명 아래 뇌 놓고 초점으로 그것을. 형광 빛을 전환 하 고 GCaMP6s 라는 세포에 초점을 조정 합니다. 참고:는 GCaMP6s의 기저 녹색 형광 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>250 ms에서 수집을 시작/냉각 모드 적절 한 수집 소프트웨어를 사용 하 여 512 × 512 픽셀의 해상도에서 프레임 (예., µManager). 16 비트 이미지 (동적 범위 0-65535) CCD 카메라의 동적 범위에서 형광 값을 1000 (임의의 단위) 보다 낮게 하지 노출 시간을 조정 합니다. 참고: 낮은 노출 시간에 GCaMP6s의 사진-표백을 최소화 하기 위해 사용 해야 합니다. 그것은 GCaMP6의 식 수준 및 탐지 시스템의 감도에 따라 노출 시간 각 실험에 최적화 되어야 합니다. 그것은 사용 하 여 우리의 실험에서 100 ms dilp2 > GCaMP6s. Z-섹션 주어진된 이미징 깊이 대 한 필요한 경우, 여러 z 섹션 이미지 노출 시간과 프레임 간격에 따라 취득 수 있습니다. 카메라 공간 해상도 충분 한 경우, 노출 시간을 줄이기 위해 범주화 크기 (하나의 디지털 픽셀으로 범주화 하는 칩에 레지스터의 수)를 증가 한다.</li>
	<li>이미지 매개 변수를 확인 하는 펩 티 드 관리 기준 신호 강도 (F0)를 검색 하기 전에 1 분 동안 이미지 걸릴.</li>
	<li>적용 테스트 펩 티 드. 이 위해, PBS에서 펩 티 드 솔루션의 100 µ L를 녹이 고 직접 최적 농도를 애벌레 욕조에 플라스틱. 참고: 펩 티 드 솔루션 천천히 주입 되어야 한다 (예를 들어, 흐름 속도 20 µ L/s)는 피 펫을 사용 하 여 목욕 솔루션으로. 없는 합성 펩 티 드 PBS에 녹아 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	<li>몇 분 동안 GCaMP6s 방출을 기록 합니다.</li>
</ol>3. 데이터 분석
참고: 영상 데이터는 오프 라인으로 ImageJ로 분석 된다. 시간 경과 화상 진 찰 동안 pipetting 이동 애벌레 뇌를 발생 합니다. 따라서, 직렬 이미지의 위치 착오 분석 하기 전에 수정 해야 합니다. 수정 된 ImageJ 플러그인, TurboReg를 사용 하 여 다음과 같이 수행할 수 있습니다.
<ol><li>분석 소프트웨어를 열고 (펩 티 드 응용 프로그램) 전에 첫 번째 프레임 참조 이미지를 사용 합니다.</li>
	<li>플러그인을 선택 | 등록 | TurboReg.</li>
	<li>원본 으로 직렬 이미지 파일 및 대상으로 참조 이미지를 선택 합니다.</li>
	<li>체크 리 짓 바디 (병렬 변위 및 이미지의 회전)와 정확한 ("빠른"는 빠른 분석 하지만 거친 대신) 처리 방법 및 품질, 각각.</li>
	<li>일괄 이미지 처리 시작을 클릭 합니다.</li>
	<li>분석을 사용 하 여 관심사 (ROIs)의 여러 영역을 선택 | 도구 | 투자 수익 관리자 ImageJ에.</li>
	<li>더 많은 를 클릭 하 여 픽셀 강도 측정 | 다중 측정 | 확인 ROI 관리자 창에서.</li>
	<li>Δ/F0 를 계산 = (F-F0) /F0, 어디 F 투자 수익 강도, 자극의 시간에서 이며 F0 특정 실험 이벤트 직전 시간대에 강도 (예를 들어, 30 프레임 앞에 자극 증상)입니다.</li>
	<li>반복 실험 여러 뇌 샘플을 사용 하 여, 평균 및 각 시간 지점에서 평균 (SEM)의 표준 오차를 통계 처리를 수행 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

캘리포니아2 + 이미징 방법을 여기에 설명 된 뇌에서 호르몬의 기능을 테스트 하기 위한 유용한 시스템입니다. Vivo에서 두뇌 다양 일 분 비 장기에서 호르몬을 받습니다. 더하여, 두뇌는 끊임없이 자연 신경 활성화를 일으키는 원인이 되는 감각 정보를 오름차순 인식. 이 비보 전 시스템 같은 노이즈를 제거 하 고 vivo에서 영상 보다 더 나은 신호/잡음 비율을 생성 합니?...

기관 대 기관 통신 환경 변화에 대처 하기 위해 항상성 유지 하기 위한 진화론 보존된 전략 이다. 인간, 순환으로 내 분 비 동맥에서 호르몬 arereleased의 다양 한. 이러한 호르몬의 많은 신진 대사 과정 및1,2먹이 등 기본적인 동작을 조절 하는 두뇌의 시상 하 부 대상. 많은 호르몬 포유류 모델을 사용 하 여 발견 되었습니다. 그러나, 그들의 행동, 특히 있는 그들이 참여, interorgan 네트워크의 메커니즘 크게 불분명 남아 있습니다.
초파리 melanogaster 기관 대 기관 통신 공부에 대 한 유용한 모델로 떠오르고 있다. 곤충, 많은 생리 적인 과정은 호르몬에 의해 제어 됩니다. 초기 연구 성장과 변형에 초점을 맞추고 큰 곤충을 사용. 이 연구에서 제거 또는 특정 장기의 이식 예측 간 장기 신호 분자;의 존재 나중에, 젊은 호르몬 (JH), Prothoracicotropic 호르몬 (PTTH), 및 Ecdysone 화학적 정화3,,45했다. 세포 신호 펩 티 드의 큰 가족 곤충 라이프 사이클6,7동안 다양 한 생리 적 행사에 참여 하 생각 된다. 이러한 펩 티이 드의 대부분 비록 특정 GPCRs 처음 전통적인 방법을 사용 하 여 식별 하기 어려운 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)에서 작동 합니다. 초파리 전체 게놈 순서8 의 간행물이 이었다 초파리 생리 활성 펩 티 드는 다른 곤충에서 발견 된에 그들의 상 동에 따라 식별을 사용 하는 획기적인. 또한, 여러 가지 펩 티 드에 대 한 수용 체는 GPCRs GPCR 리간드 바인딩 분석 셀-문화-기반을 사용 하 여 게놈에 예측에서 확인 되었다. 다음, 식 분석 예측 기관 대 기관 경로 이러한 펩 티 드와 수용 체에 의해 elicited. 특히, 상 상속 펩 티 드 수용 체의 많은 두뇌, 두뇌 펩 티 드 호르몬9의 주요 목표는 제안 표현 됩니다. 또한, 초파리 에서 유전자 고급 도구 펩 티 드 GPCR 조합의 생리 적 역할의 id에 공헌 했다. 예를 들어, GAL4 및 LexA 기반 이진 transcriptional 시스템 활성화 유전자 최저 또는 overexpression 공간 및 일시적으로 제어 방식. GAL4, 효 모에서 확인 된 녹음 방송 요인 특정 cis 규제 시퀀스 라는 상류 활성화 순서 (UAS)에 바인딩합니다. GAL4/UAS 시스템에서 드라이버 라인 제공 조직 관련 또는 단계 특정 GAL4 표현과 응답자 선 관심 또는 드라이브 shRNA 식 구조 유전자의 상류 UAS 운반. LexA/LexAop 시스템 비슷한 메커니즘을 기반으로 합니다. 조직의 특정 펩 티 드-최저와 조직 특정 GPCR 최저 동물의 phenotypic 분석 펩 티 드 GPCR 신호 모드와 행동의 사이트에 대 한 정보를 알아낼 수 있습니다. 그러나, 유전자 데이터에 의해서만 도달 될 수 있는 결론 제한 됩니다. 다른 한편으로, 특정 펩 티 드 호르몬의 상 상속 대상 조직 또는 세포 유형으로 좁혀입니다, 일단 비보 전 칼슘 기관 explants 이미징 펩 티 드 GPCR 신호에 의해 중재 기관 대 기관 통신 명료 하 사용할 수 있습니다. Gq 결합 GPCR의 활성화, 세포내 캘리포니아2 + 농도10응급실 캘리포니아2 + 의 출시로 인해 증가 된다. 뇌, 신경 활성화는 또한 세포내 캘리포니아2 + 레벨을 올린다. 이러한 Ca2 + 증가 칼슘 센서, GCaMP, 캘리포니아2 + 형광 방출11결과의 구조적 변화를 겪 습에 의해 감지할 수 있습니다.
이 문서에서는, 초파리 뇌를 사용 하 여 이미징 방법 explants 칼슘 설명 되어 있습니다. 특정 뉴런을 활성화 하는 펩 티 드의 능력을 테스트 하기 위해 테스트 펩 티 드 GCaMP 표현 뇌 explant에 적용 되 고 형광 변화 confocal 현미경 검사 법에 의해 모니터링 됩니다. GPCR의 참여는 GPCR 부족 돌연변이 두뇌를 사용 하 여 동일한 분석 결과 수행 하 여 다음 확인 된다. 이미징 및 유전학의이 조합은 펩 티 드에 의해 기관 대 기관 통신에 대 한 정확한 정보를 제공 합니다-GPCRs. 가능 수정 및이 프로토콜의 응용 프로그램 또한 토론 된다.

<table><tbody><tr><td>Tungsten rod</td><td>A-M systems, Sequim, WA, USA</td><td>717000</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik, Paris, France</td><td>3049100</td><td>putty-like reusable adhesives</td></tr><tr><td>Watch glass, square, 1 5/8 in</td><td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td><td>T900</td><td>Phosphated buffered salts</td></tr><tr><td>CCHa2</td><td>SCRUM Inc., Tokyo, Japan</td><td></td><td>Custum-synthesized peptide</td></tr><tr><td>Ghrerin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4372-s</td><td></td></tr><tr><td>Nociceptin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4313-v</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager A2</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>Axio Imager A2</td><td>fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>420957-9900-000</td><td>water-immersion objective lens</td></tr><tr><td>P-725 PIFOC objective scanner with long travel range</td><td>Physik Instrumente GmbH &amp;amp; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>N/A</td><td>piezoelectric-activated lens mover</td></tr><tr><td>Confocal Scanner Unit CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan</td><td>CSU-W1</td><td>spinning disc confocal head</td></tr><tr><td>ImagEM C9100-13</td><td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td><td>C9100-13</td><td>EM-CCD camera</td></tr><tr><td>OBIS 488 nm LS 60 mW</td><td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td><td>1178770</td><td>488-nm laser</td></tr><tr><td>488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>dichroic beam splitter</td></tr><tr><td>528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>FF01-528/38-25</td><td>emission filter</td></tr><tr><td>&amp;micro;Manager</td><td>Open Imaging, Inc.</td><td>N/A</td><td>https://micro-manager.org</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>U. S. National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>TurboReg</td><td>Philippe Th&amp;eacute;venaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne</td><td>N/A</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr></tbody></table>

ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila

내 분 비 신호에 의해 기관 대 기관 통신 예를 들어 뇌에 주변에서은 항상성 유지 하기 위한 필수. 내 분 비 연구 모델 동물로, 초파리 melanogaster, 어떤은 정교한 유전자 도구 및 게놈 정보, 점점 사용 되고있다. 이 문서에는 초파리 뇌 explants의 칼슘 이미징 하는 방법을 설명합니다. 이 메서드는 직접 뇌에 호르몬의 신호 감지 수 있습니다. 그것은 잘 알려진 많은 펩 티 드 호르몬 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs), 누구의 활성화 세포내 캘리포니아2 +농도 있는 증가 일으키는 통해 행동. 신경 활성화는 또한 세포내 캘리포니아2 + 레벨을, 캘리포니아2 + 유입 및 캘리포니아2 + 바인딩과 그물 (ER)에 저장 된 자료를 올린다. 칼슘 센서, GCaMP, 이러한 Ca2 + 변화를 모니터링할 수 있습니다. 이 방법에서는, GCaMP의, 신경에 표현 하 고 GCaMP을 표현 하는 애벌레 뇌를 해 부하 고 교양 비보 전. 테스트 펩 티 드 다음 뇌 explant에 적용 되 고 형광 변화 GCaMP에 장착 된 CCD 카메라 회전 디스크 confocal 현미경을 사용 하 여 검색. 이 메서드를 사용 하 여 모든 수용 성 분자는 시험 될 수 있다, 그리고 신경 활성화와 관련 된 다양 한 셀룰러 이벤트 적절 한 형광 표시기를 사용 하 여 이미지 수 있습니다. 또한, 이미징 챔버를 수정 하 여 이미지 다른 초파리 장기 나 다른 동물의 장기를이 메서드를 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용 하는 펩 티 드 호르몬, CCHa2에 의해 뇌 인슐린 생산 세포 (IPCs)의 정품 인증 시험 되었다. 야생-타입 두뇌의 IPCs GCaMP6s로 표시 했다 dilp2-GAL412 (박사 Rulifson 선물), UAS-GCaMP6s13 (김 박사 선물)의 조합을 사용 하 여. 애벌레 두뇌 explants 합성 CCHa2 펩 티 드로 치료 했다 그리고 GCaMP6s에서 형광 실시간으로 기록 했다...

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Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

9.2K 조회수.  Nagoya University. 이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

에서 이미징 칼슘<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 활성화에

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

연구

발생학

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

신경과학

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

의 생리적 반응을 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

면역학 및 감염병학

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Calcium Imaging을 통한 Drosophila 의 간질형 이벤트 모니터링

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

저자 스포트라이트: 간질 연구의 최근 발전에 대한 기술 및 연구 결과에 대한 통찰력 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

생체 내 성체 초파리에서 미각 유도 신경 반응의 칼슘 이미징

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

Ex Vivo Calcium Imaging to Study Drosophila Brain Responses to Neuropeptides

Source:&#160;<a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57701/ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine-signaling-in-drosophila'><span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Ishimoto, H.&#160;et. al.,<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila.&#160;J. Vis. Exp.<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> (2018)</a> &#160;This video demonstrates calcium imaging to study&#160;Drosophila brain responses to neuropeptides. Neurons expressing a fluorescent calcium indicator reveal intracellular calcium dynamics and functional responses to signaling molecules.

Source:&#160;Ishimoto, H.&#160;et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila.&#160;J. Vis. Exp. ...

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

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에서 이미징 칼슘

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발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

생체 내 성체 초파리에서 미각 유도 신경 반응의 칼슘 이미징

Ex Vivo Calcium Imaging to Study Drosophila Brain Responses to Neuropeptides