이 작업은 ICELA Academia-2010 (ICREA Academia-2010)의 Catalina de Recerca / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 및 PIE14 / 00034) ), FC에 대한 Wenenschap en Technologie (SBO-140028)의 이그 제 큐 티브 (AGENTCHAP VOR Innovatie) 기술 연구소 (SBM-140028) 또한 X, M, VF-D. 및 FC는 &quot;Neuropharmacology and Pain&quot; . 이 작품은 CAPES (브라질)에서 FC까지 &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras&quot;

모든 동물 실험 절차는 Laboratory Animals 11 의 관리 및 사용 안내서에 설명되어있는 유럽 공동체 (European Community ) 에 따라 동물 실험 및 동물 관리위원회 (CEEA)에서 승인 한 바 있습니다.이 지침은 86 / 609 / CCE, FELASA 및 ARRIVE 지침. 따라서 마우스는 음식과 물을 자유롭게 접할 수있는 표준 케이지에 보관하고 표준 표준 조건 (오전 7시 30 분, 온도 22 ° C, 습도 66 %에서 시작하여 12 시간 어둡거나 밝은 주기로 유지)하에 보관합니다. 1. 불연속 Sucrose Gradient를 사용하여 마우스 뇌 시냅 토좀을 얻는 방법 참고 :이 방법은 이전에보고되었습니다 10 . <ol><li> 신선한 격리 완충액 (IB), pH 7.4를 준비하십시오. 2 M 수 크로스; 1 M 수 크로스 /0.1 mM CaCl2; 및 0.1 mM CaCl2 ( 표 1 참조). 얼음 위에서 용액을 차게하십시오. </li><li> 사자궁 경부 탈구로 5 마리 생쥐를 구부린다. 각 동물의 뇌를 잘리고 빠르게 제거하십시오. 관심의 뇌 영역 (즉, 해마, 0.25-0.35 g의 신선한 조직)을 해독하고 1 ML의 IB와 함께 얼음에 5 ML 포터 - Elvehjem 유리 튜브에 넣으십시오. </li><li> 샘플 온난을 막기 위해 얼음 조에서 우선적으로 균질화 교반기 (분당 700-900 회전 10 스트로크)를 사용하여 조직을 균질화합니다. </li><li> 4 2 ML 자당과 0.1 MM CaCl 2 2.5 ML의 6 ML을 포함하는 15 ML 튜브에 균질 조직 (1 ML)를 놓습니다 ° C. 튜브를 뒤집어서 천천히 혼합하십시오. 주 : 칼슘의 첨가는 세포 소기관 간의 접착 상호 작용을 유지하고 다른 &quot;밀도&quot;의 구조를 보존하는 데 필수적입니다. </li><li> 12 ML 원심 분리기 튜브에 솔루션을 놓고 천천히 sucrose 그라디언트를 형성하는 각 튜브의 상단에 1 M 자당 / 0.1 MM CaCl 2 2.5 ML을 추가합니다. 참고 : 위치에 레이블을 붙이십시오.영구 마커를 사용하여 원심 분리 관의 기울기 인터페이스. </li><li> 원심 분리기 튜브를 해당 철강 지지대와 닫힌 뚜껑과 함께 IB 용액으로 칭량 및 평형을 취합니다. </li><li> 스윙 버킷 로터 원심 분리기를 사용하여 100,000 x g 및 4 ° C에서 3 시간 동안 튜브를 원심 분리하십시오. 모든 강철 지지대로 로터를 완전히 채 웁니다 (필요한 경우 비어 있음). </li><li> myelin이 포함 된 상단 레이어를 삭제합니다. 파스퇴르 피펫으로 synaptosome 분수에 해당하는 1.25-M과 1-M sucrose interphase 사이의 흰 고리를 수집하십시오. </li><li> 원심 분리 관에서 IB를 사용하여 9 배로 시냅 토좀을 희석하십시오. </li><li> 원심 분리기 튜브를 해당 철강 지지대와 닫힌 뚜껑과 함께 IB 용액으로 칭량하고 평형을 유지하십시오. </li><li> 스윙 버킷 로터 원심 분리기를 사용하여 15,000 x g 및 4 ° C에서 30 분간 튜브를 원심 분리하십시오. </li><li> 상등액을 버리고 resuspend th펠릿에 1.1 mL의 IB 용액을 첨가 하였다. 이 시냅 토좀 용액 100 μL를 모으고 11,000 x g 및 4 º C에서 5 분간 원심 분리하십시오. </li><li> synaptosomal 펠렛을 5 % sodium dodecyl sulfate (SDS)에 재현 탁하고이 샘플을 -20 ° C에 보관하십시오. 참고 :이 샘플은 추가 Western-blot 분석을위한 총 synaptosome 분율에 해당합니다. 남아있는 시냅 토좀 분획 (~ 1 mL)은 사용 전까지 -20 ℃에서 동결되거나 후속 시냅스 분획을 위해 처리 될 수 있습니다. synaptosomes 또는 정제 된 시냅스는 총 해마 부피의 1 ~ 2 %를 나타낸다. </li></ol> 2. 전 -, 사후 - 및 외 연접 - 격리 <ol><li> 신선한 용해 버퍼 (pH 6.0) 2x를 준비하십시오. 1x 가용화 완충액, pH 6.0; 가용화 완충액, pH 8.0; 및 0.1 mM CaCl2 ( 표 1 참조). 얼음 위에서 용액을 차게하십시오. 참고 :이 용액의 pH는 반드시 정확해야합니다좋은 subsines 분별을 달성하기 위해 조정. </li><li> 천천히 1 ML 재 합성 synaptosomal 분수 (단계 1.12 참조) 0.1 MM CaCl 2 5 ML로 천 희석하십시오. </li><li> ice-cold 2x 가용화 완충액 (pH 6.0)과 동일한 부피 (5 mL)를 넣고 빙상의 비이커에서 높은 교반하에 얼음 위에서 50 분 동안 배양한다. 참고 : pH 6.0의 Triton X-100의 1 %가 모든 세포막 단백질을 용해 시키지만 시냅스 접촉 또는 접합부 ( 예 : 전 및 시냅스 후 구조)에서 단백질을 보존합니다 4 . </li><li> 원심 분리 관에 넣으십시오. 0.1 mM CaCl2와 2 배 가용화 완충 용액 (pH 6.0)을 동등한 부피의 스틸 지지체와 닫힌 뚜껑과 함께 무게를 달고 평형을 이룬다. </li><li> 스윙 버킷 로터 원심 분리기를 사용하여 40,000 x g 및 4 ° C에서 30 분간 튜브를 원심 분리하십시오. 생성 된 상등액은 세포 외 분획을 나타내며,펠릿은 시냅스 접합부 ( 즉, 시냅스 후 분획)에 상응한다. </li><li> 4,000 x 4 및 4 ºC에서 원심 분리 된 15 mL 10K 필터 튜브를 사용하여 비회원 분획이 들어있는 상등액을 최종 200 μL 부피로 농축합니다. </li><li> -20 ℃에서 미리 냉각 (-20 ℃) ​​한 아세톤 5 방울 (1 mL)을 사용하여 결과로 농축 된 엑시 신 시냅스 분획 (200 μL)을 침전시킨다. </li><li> 다음 날, 18,000 x g 과 -15 ° C에서 30 분간 외 발성 분열물을 원심 분리한다. 원심 분리 후, 아세톤 상등액을 버리고 펠렛을 건조시켜 아세톤 흔적을 제거한다. </li><li> 마지막으로 5 % SDS의 200 μL와 extrasynaptic 단백질을 포함하는 펠렛을 resuspend. 필요한 경우 펠릿을 초음파 처리하십시오. </li><li> 그것을 방해하지 않고 조심스럽게 사전 및 postsynaptic 분수를 포함하는 펠렛을 1x 용해 버퍼, 산도 6.0 2 ML로 씻으십시오. 버퍼를 폐기하십시오. </li><li> Resuspend유리 파스퇴르 (Pasteur) 피펫을 사용하여 1x 가용화 완충액 (pH 8.0) 10 mL로 펠렛 화 하였다. 참고 : pH 8.0의 Triton X-100의 1 %가 시냅스 전문화를 용해하지만 불용성 시냅스 후 밀도 4를 유지 합니다. </li><li> 얼음에 비커에서 높은 교반하에 얼음에 50 분 동안 현탁액을 품어. </li><li> 원심 분리 관에 넣으십시오. 해당 튜브 지지대와 닫힌 뚜껑 안에 1x 가용화 완충 용액 (pH 8.0)으로 튜브의 무게를 달고 평형을 이룬다. </li><li> 스윙 버킷 로터 원심 분리기를 사용하여 40,000 x g 및 4 ° C에서 30 분간 튜브를 원심 분리하십시오. 결과 상층 액은 시냅스 전 분획에 상응하고 펠렛은 시냅스 후 분획에 상응한다. </li><li> 단계 2.6-2.9에서 설명한대로 presynaptic 분수를 포함하는 뜨는을 처리합니다. </li><li> 5 % SDS의 200 μL와 postsynaptic 분수를 포함하는 펠렛을 Resuspend. 펠렛을 초음파 처리하세요.f가 필요합니다. </li></ol> 3. 멤브레인 분별을 검증하기 위해 immunoblot으로 시료를 분석하십시오 <ol><li> bicinchoninic 산성 단백질 분석을 사용하여 각 분획 ( 즉, 총, 여분, 사전 및 시냅스 후 분수)에서 단백질의 양을 결정합니다. </li><li> 각 분획에서 20 μg의 단백질을 취해 SDS- 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 시료 완충액 중 50 μL의 최종 부피로 희석한다. 100 ℃에서 5 분간 끓입니다. </li><li> 환원 조건에서 4 % 농축 젤로 SDS-PAGE 전기 영동 10 %로 단백질을 분리하십시오. 염료가 낮은 젤에 들어갈 때까지 80V의 정전압으로 전기 영동 한 다음 전압을 120V로 증가시킵니다. </li><li> 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮기고 IB 블로킹 용액으로 45 분간 실온에서 연속적으로 흔들어 블로킹합니다. </li><li> 표시된 기본 항체 ( 즉, 안티 SNAP - 25,항 -PSD-95, 항 - 시냅토 피신 또는 항 -GPR37)를 연속적으로 흔들어 주면서 IB 차단 용액으로 희석시켰다. </li><li> IB 세척 용액으로 멤브레인을 3 번 세척 (각각 10 분)하여 결합되지 않은 1 차 항체를 제거합니다. </li><li> 표시된 2 차 항체와 함께 상온에서 어두운 조건에서 90 분 동안 지속적으로 흔들어주세요. </li><li> IB 세척 용액으로 멤브레인을 3 번 세척 (각각 10 분)하여 결합되지 않은 2 차 항체를 제거합니다. </li><li> 멤브레인을 화학 발광 기질과 함께 배양하십시오 (어두운 조건에서 혼합액을 준비하고 제조사가 제공 한 용액 A와 B의 1 : 1 비율을 따르십시오). </li><li> 화학 발광 검출 장치에서 막을 분석하십시오. </li></ol>

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여기에 제시된 프로토콜은 뇌 영역 내의 특정 단백질의 부갑상선 분포 연구에 대한 강력한 생화학 도구를 구성합니다. 그러나 여기서 강조해야 할 기술에 내재 된 몇 가지 단점이 있습니다. 예를 들어, 주요 제한 사항 중 하나는 모든 subsynaptic 분수의 immunoblot 분석을 수행하기 위해 합리적인 금액의 단백질을 정화하는 데 필요한 조직의 상대적으로 큰 금액입니다. 이 문제는 시냅스 ( 즉, 시?...

시냅스 전달은 시냅스의 물리적 무결성에 달려 있는데, 이것은 포스터 (Foster)와 셔링턴 (Sherrington)에 의해 1897 년에 상상 된 개념이다. 따라서 정상 신경계와 병리학 적 상태 모두에서 중요한 신경 전달 요소 ( 예 : 이온 채널, 수용체 등 )의 분포를 이해하는 것이 시냅스 기능을 해명하는 데 필수적입니다. 전자 현미경 (EM)은 프로토 타입 중추 신경계 (CNS) 시냅스의 현재의 미세 구조 개념에 엄청난 공헌을했습니다. 이러한 방식으로 EM은 사전 및 후기 시냅스 밀도의 차이를 정교하게 정의했으며, 이는 일정한 거리 (~ 25 nm)의 틈으로 구분됩니다. 흥미롭게도, postsynaptic 장치는 소위 postsynaptic 밀도, 또는 PSD 2 라는 자사의 원형 막 아래 상대적으로 지속적인, 전자 밀도 농축을 보여줍니다. 반대로, presynaptic 장치에서, noticeabl불연속 cytomatrix 네트워크는 원형 막 바로 아래에 배치되어 있으며, 이것은 시냅스 소포를 원형 막 멤브레인 활성 영역 3에 정렬 및 도킹하는 데 필수적입니다. 따라서 EM은 구조적으로 보존 된 CNS 시냅스 내에서 단백질 분포를 조사하기위한 황금 실험 접근법을 구성합니다. 그러나 전자 현미경 사진에서 제공하는 정보는 정적입니다. 사실, 축적 된 증거는 생체 내 시냅스가 극도로 역동적이어서 지속적인 시냅스 전달에서 극적인 구조 변화를 경험한다는 것을 보여줍니다. 또한, 시냅스의 형태와 구성은 다양한 CNS 지역에서 발달, 성숙, 노화 및 신경 병리학 적 상태의 발달에 따라 변할 수있다. 전반적으로 생리 조건에서 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 데 초점을 맞춘 프로토콜은 시냅스 기능에 대한보다 포괄적 인 연구를위한 유용한 도구입니다. 등에 의해 처음으로 기술 된이 막 분획 화 방법은, (2001) 4 는 사전 및 사후의 시냅스 장치 내에서 발생하는 접착 상호 작용을 약화시키는 pH 변화에 기초한다. 첫째, pH 6.0에서 약한 세제를 사용하여 사전 및 사후 시냅스 장치를 보유하고 가용화되어 시냅스 접촉에서 추출 할 수있는 비회원 막 영역에서 유지되는 접착 접합을 식별 할 수 있습니다. 결과적으로, 중성 세제의 존재하에 pH를 6.0에서 8.0으로 올리는 것은 접합체 접합부의 강도를 약화시켜 접합 전 활성 영역이 접합 후 밀도에 단단히 결합되도록합니다. 따라서, presynaptic 구획은 너무윤활유는 후자 농도에서 분리 될 수 있는데, 이는 사용 된 세제의 농도가 그 가용화를 촉진시키지 않기 때문에 대부분 보존된다. 흥미롭게도, 분할 효율은 결국 90 % 이상으로, 다른 subsynaptic 마커에 의해 확인할 수 있습니다 : i ) synaptosomal 관련 단백질 25 (SNAP - 25), presynaptic 활성 영역에서; ii ) synaptophysin, extrasynaptic 분수에서 ( 즉, 활성 영역 외부 및 microsomes 포함); 그리고 ⅲ ) postsynaptic density 단백질 95 (PSD-95). 특히,이 뇌막 분화 방법은 성공적으로 사용되었습니다. 따라서, 알파 - 아미노 -3- 하이드 록시 -5- 메틸 -4- 이속 사졸 프로피온산 (AMPA) 수용체 5 , 아데노신 A1 수용체 (A1R) 6 및 아데노신 A1 수용체와 같은 상이한 수용체의 부갑상선의 국소화를 정확하게 결정할 수 있었다. ,아데노신 A 2A 수용체 (A 2A R) 7 , 아데노신 트리 포스페이트 (ATP) P2 수용체 8 , 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 서브 유닛 9 및 파킨슨 병 관련 수용체 GPR37 10 . 그러나, 여러 가지 제한 사항은 특정 연결 단백질의 시냅스 분포의 적절한 평가를 방해 할 수 있습니다. 따라서이 과정에서 우리는 전체 프로토콜을 완전하게 기술 할뿐만 아니라, 필요한 많은 양의 조직, 낮은 단백질 수율 및 단백질의 효율을 검증하기위한 필수 요구 사항과 같은 고려해야 할 중요한 포인트를 강조합니다. 명확한 실험을하기 전에 각 분리.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,316,211,211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>2,112,211,210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H2O</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,313,961,210</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail Set III</td><td>Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,236,541,209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,311,651,604</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Non fat dry milk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,216,591,211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,314,941,210</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,316,781,211</td><td></td></tr><tr><td>Basic 20 pH</td><td>Crison, Alella, Spain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td><td>VWR, Radnor, PA, USA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td>344059</td><td>Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson, Danbury, Connecticut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Compact Balance EK-610</td><td>A&amp;amp;D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GR 200 Precision Balance</td><td>A&amp;amp;D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GPR37</td><td>Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.</td><td></td><td>Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td><td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td><td></td><td>Primary antibodies diluted 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Secondary antibody diluted 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Secondary antibody diluted 1:30,000</td></tr></tbody></table>

brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization

시냅스 단백질의 구성과 기능을 평가하는 것은 신경 과학에서 중요한 과제입니다. 그러나 동적 인 단백질 - 단백질 상호 작용과 인산화 반응에 의해 조절되기 때문에 시냅스에서 발생하는 신경 전달을 평가하는 것은 쉽지 않습니다. 따라서, 어떤 방법이 시냅스 전달을 연구하는데 사용될 때, 주요 목표는 이러한 일시적인 생리 학적 변형을 보존하는 것이다. 여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다. 즉, 프로토콜은 presynaptic, postsynaptic, 그리고 extrasynaptic 구획에서 단백질 농축을 수행하는 생화학 방법론을 설명합니다. 첫째, synaptosomes, 또는 시냅스 터미널, 불연속 자당 그라디언트를 통해 모든 시냅스 구획을 포함하는 뉴런에서 얻은 것입니다. 참고로,이 초기 시냅스 막 준비의 품질은 c의복. 결과적으로, 다른 subsynaptic 구획의 분리는 차별적 인 pH 조건에서 순한 세제를 사용하여 가벼운 solubilization과 달성됩니다. 이것은 그래디언트 및 등 원심 원심 분리에 의한 분리를 허용합니다. 마지막으로, 다른 subsynaptic 구획 ( 즉, 사전, 사후 및 extrasynaptic 막 분수)에서 단백질 농축은 잘 특성화 된 시냅스 단백질 마커 ( 즉, SNAP - 25, PSD - 95, 그리고 synaptophysin을 사용하여 immunoblot 분석의 수단으로 유효성 검사, 각각의 신경 세포 단백질의 시냅스 분포를 직접 평가할 수있다.

설명 된 방법론은 일반적으로 신경 단백질의 subsynaptic 분석과 일반적으로 시냅스 수용체 5 , 6 , 7 , 8 , 9 의 분리 및 생화학 적 특성 결정에 사용되었습니다. 흥미롭게도, 여기에 표시된 대표 결과는 고아 G 단백질 - 결합 수용체 즉, 파킨슨 병 관련 수?...

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Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다.

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

10.3K 조회수.  Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat.  여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다. 

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Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 Synaptoneurosomes의 준비

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

연구

신경과학

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

불연속 자당 구배를 사용 시냅틱 세포막과 시냅스 밀도 단백질의 제조

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

청각 차별 학습 한 후 마우스 뇌 영역의 높은 해상도 양적 시냅틱 프로테옴 프로파일

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS induces generalized tonic-clonic seizures with low mortality and neuronal death and is a widely-used model to screen anti-epileptic drugs. Here, we describe an ECS induction method in which a brief 55-mA current is delivered for 0.5 s to male rats 200 - 250 g in weight via ear-clip electrodes. Such bilateral stimulation produced stage 4 - 5 clonic seizures that lasted about 10 s. After the cessation of acute or chronic ECS, most rats recovered to be behaviorally indistinguishable from sham &#34;no seizure&#34; rats. Because ECS globally elevates brain activity, it has also been used to examine activity-dependent alterations of synaptic proteins and their effects on synaptic strength using multiple methods. In particular, subcellular fractionation of the postsynaptic density (PSD) in combination with Western blotting allows for the quantitative determination of the abundance of synaptic proteins at this specialized synaptic structure. In contrast to a previous fractionation method that requires large amount of rodent brains, we describe here a small-scale fractionation method to isolate the PSD from the hippocampi of a single rat, without sucrose gradient centrifugation. Using this method, we show that the isolated PSD fraction contains postsynaptic membrane proteins, including PSD95, GluN2B, and GluA2. Presynaptic marker synaptophysin and soluble cytoplasmic protein &#945;-tubulin were excluded from the PSD fraction, demonstrating successful PSD isolation. Furthermore, chronic ECS decreased GluN2B expression in the PSD, indicating that our small-scale PSD fractionation method can be applied to detect the changes in hippocampal PSD proteins from a single rat after genetic, pharmacological, or mechanical treatments.

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy for severe depression. ECS globally stimulates activity in the hippocampus, leading to synaptogenesis and synaptic plasticity. Here, we describe methods for ECS induction in rats and for subcellular fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in synaptic proteins.

쥐와 분류 된 그들의 Postsynaptic 밀도 단백질에 변화 발작 유발 검사 Electroconvulsive 발작

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal communication. Therefore, alterations in their abundance, function, and relationships with other synaptic elements have been observed as a major correlate of alterations in brain function and cognitive impairment in neurodegenerative diseases and mental disorders. Understanding how the function of excitatory and inhibitory synaptic receptors is altered by disease is of critical importance for the development of effective therapies. To gain disease-relevant information, it is important to record the electrical activity of neurotransmitter receptors that remain functional in the diseased human brain. So far this is the closest approach to assess pathological alterations in receptors' function. In this work, a methodology is presented to perform microtransplantation of synaptic membranes, which consists of reactivating synaptic membranes from snap frozen human brain tissue containing human receptors, by its injection and posterior fusion into the membrane of Xenopus laevis oocytes. The protocol also provides the methodological strategy to obtain consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and &#947;-aminobutyric acid (GABA) receptors, as well as novel detailed methods that are used for normalization and rigorous data analysis.

The protocol demonstrates that by performing microtransplantation of synaptic membranes into Xenopus laevis oocytes, it is possible to record consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid and &#947;-aminobutyric acid receptors.

기능적 연구를 위한 인간 시냅틱 수용체를 재활성화하기 위한 시냅틱 멤브레인의 미세이식

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological disorders. The characterization of synaptic sub-compartments by biochemical isolation is, therefore, a powerful method to elucidate the molecular bases of synaptic processes, both in health and disease. This protocol describes the isolation of synaptic terminals and synaptic sub-compartments from mouse brains by subcellular fractionation. First, sealed synaptic terminal structures, known as synaptosomes, are isolated following brain tissue homogenization. Synaptosomes are neuronal pre- and post-synaptic compartments with pinched-off and sealed membranes. These structures retain a metabolically active state and are valuable for studying synaptic structure and function. The synaptosomes are then subjected to hypotonic lysis and ultracentrifugation to obtain synaptic sub-compartments enriched for synaptic vesicles, synaptic cytosol, and synaptic plasma membrane. Fraction purity is confirmed by electron microscopy and biochemical enrichment analysis for proteins specific to sub-synaptic compartments. The presented method is a straightforward and valuable tool for studying the structural and functional characteristics of the synapse and the molecular etiology of various brain disorders.

This protocol presents a robust, detailed method to obtain highly pure synaptosomes, synaptic vesicles, and other synaptic fractions from the mouse brain. This method enables the evaluation of synaptic processes, including the biochemical analysis of protein localization and function with compartmental resolution.

쥐의 뇌로부터 시냅스 성분의 분리를 위한 세포하 분획

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

뇌막 분획 화 :

요약

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