Name: characterization of thymus-dependent and thymus-independent immunoglobulin isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay
Uploaded: 2018-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
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이 연구는 건강 보조금 R01 CA158402의 국가 학회 (P. 시)에 의해 지원 되었다, R21 AI128264 (P. 시), 국방부의 부여 W81XWH-13-1-0242 (P. 시), 조종사 상 암 연구소의 뉴저지에서 보조금 번호 P30CA072720를 통해 국립 암 연구소 (P. 시), 부시 생명 부여 (P. 시), 빅터 Stollar 친교 (A. Lalani)는 앤 B. 그리고 제임스 B. Leathem 친교 (미 주).

이 프로토콜의 럿 거 스 대학 기관 동물 실험 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 모든 마우스 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 동물 프로토콜에서 NIH 지침에 따라 사용 됩니다.
1. 생쥐와 순진한 마우스 세라의 컬렉션의 준비
<ol><li>특정 병원 체-무료 동물 시설에에서 예방 접종 실험에 대 한 모든 마우스를 유지.</li>
	<li>사용 하 여 일치 하는 성별, 젊은 성인 (8-12 주 이전) 녹아웃 및 littermate 같은 부모와 면역 연구에 대 한 감 금 소를 공유 하는 마우스 제어.</li>
	<li>예방 접종 및 그림 1에서처럼 혈 청 수집 일정을 계획 합니다.</li>
	<li>예방 접종 하기 전에 7 일 (-7 일)에서 각 마우스의 혈 청 순을 수확. 4 단계에서 아래의 자세한 역 궤도 출혈 및 혈 청 준비 절차를 따릅니다.</li>
</ol>2. 준비 TNP-다 당 류 (티 원) TNP KLH (TD 항)
<ol><li>TNP-다 당 류 주식과 TNP KLH 재고 솔루션의 1 mg/mL의 0.5 mg/mL을 철저 하 게 멸 균 PBS (pH 7.4)에 항 원 분말을 디졸브. Aliquot 각 항 0.5 mL/튜브, 살 균 microfuge 관으로 솔루션을 재고 하 고 장기 저장을 위한-80 ° C에는 aliquots를 유지. 여러 동결과 항 원 aliquots의 해 동 하지 마십시오.</li>
	<li>주사 당일 계산 TNP-다 당 류의 볼륨 (50 µ g/100 µ L/마우스) 또는 TNP KLH (100 µ g/100 µ L/마우스) 주입에 쥐의 수에 따라 필요한. 적절 한 수의 상 온 (RT) TNP-다 당 류 또는 TNP KLH aliquots 녹여</li>
	<li>TNP KLH 주입을 위해 먼저 10 mg/mL의 최종 농도에 살 균 PBS의 3 볼륨 졸업생 보조 (40 mg/mL)를 희석. 졸업생 보조 제 혼합물은 잘 희석 하기 전에 일시 중단 된 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 동등한 양의 단계 2.3 및 해 동된 TNP KLH 솔루션 (1 mg/mL)에서 10mg/mL 졸업생 보조 슬러리를 결합, 잘, 혼합 하 고 30 분이 TNP-KLH/졸업생 혼합 주사 전에 갓 준비에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
</ol>3입니다. 마우스의 면역
<ol><li>TNP-다 당 류 또는 TNP-KLH/졸업생 면역 biosafety 내각에 1 mL 인슐린 주사기와 쥐의 복 (i.p.) 주사를 수행 합니다. 내부 장기에 주입을 방지 하기 위해 각 마우스의 더 낮은 오른쪽 사분면에 가급적 이면 약 30 ° 각도로 바늘을 삽입 합니다.</li>
	<li>하루 0 TI Ag 예방 접종 (그림 1A)에 마우스 당 TNP-다 당 류의 i.p. 100 µ L를 주사.</li>
	<li>Ag는 TD 예방접종의 날 0 마우스 당 (신선한 단계 2.4에서에서 준비) TNP-KLH/졸업생 믹스의 i.p. 200 µ L를 주사. 메모리 연구 (그림 1B) 부스터 예방 접종으로 하루 21에 같은 주사를 반복 합니다.</li>
	<li>주입, 후의 케이지를 각 마우스를 반환 하 고 특정 병원 체 자유로운 상태에서 모든 삽입 된 생쥐를 유지 합니다.</li>
</ol>4. 레트로 궤도 출혈 및 혈 청 준비
<ol><li>다른 시간 지점에서 마우스 세라 수확:-7-7 (그림 1A); 하루에 마우스 세라 TNP-다 당 류 예방 접종에 대 한 수집 TNP-KLH/졸업생 예방 접종에 대 한 일-7, 7, 14, 28 (그림 1B)에 마우스 세라를 수집 합니다.</li>
	<li>복고풍-궤도 출혈, 각 biosafety 캐비닛25에서 1-2 분 5 %isoflurane 마우스 anesthetize. 각 마우스의 적절 한 마 취를 위해 페달 반사를 수행 합니다.</li>
	<li>집게와 엄지 다시 그렇게 소켓25에서 안구 돌출 안구 주위 피부를 당기고 한 손으로 마 취 마우스를 잡아. 눈알25아래 눈 소켓의 안쪽 모서리에 45 °의 각에서 비 heparinized 파스퇴르 피 펫 또는 모 세관 튜브를 삽입 합니다.</li>
	<li>부드러운 하향 압력을 적용 하 고 피 펫 또는 정 맥에 침입 하 고 150-200 µ L 피 펫 또는 튜브에 혈액의 수집을 부드럽게 튜브를 회전. 즉시 살 균 1.5 mL microfuge 관에 혈액을 전송 하 고 복구할 수 그것의 감 금에 마우스를 반환 합니다.</li>
	<li>혈액 샘플 1-2 h 응고를 위한 RT에 앉아 보자.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 13000 x g 에서 coagulated 혈액 샘플을 원심 새로운 살 균 1.5 mL microfuge 관에 혈액 응고의 위에 명확한 혈 청을 전송 합니다.</li>
	<li>잔여 혈액 응고를 제거 하 고 명확한 혈 청 수집 단계 4.6 한 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>약 50 µ L/튜브, 살 균 1.5 mL microfuge 관으로 혈 청 수-80 ° c.에서 세라를 저장 하 고</li>
	<li>각 눈은 모든 실험에 대 한 최대 두 번 출혈이 있도록 다른 시간 지점에서 출혈에 대 한 눈을 대체. 출혈 하는 터미널에서 안락사 하기 전에 각 마우스에서 최대 1 mL의 혈액을 수집 합니다. 5% CO2 자 궁 경부 전위 뒤 마우스를 안락사. 참고: 비장 B 세포 흐름 cytometric 분석 및 생체 외에서 문화 연구를 위한 수확 될 수 있습니다. 우리는 또한 각 마우스의 유전자 형을 확인 하기 위해 splenocytes에서 게놈 DNA를 준비 합니다.</li>
</ol>5. 마우스 Ig Isotype-특정 ELISA
<ol><li>
버퍼 및 ELISA 하기 전에 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>500 mL 커플링 버퍼 (PBS, pH 7.4)을 준비 합니다.</li>
		<li>세척 솔루션의 500 mL를 준비 (PBS-T (0.05% 트윈 20), pH 7.4).</li>
		<li>100 mL 차단 버퍼의 준비 (1% BSA PBS, pH 7.4에 4 ° C에 저장).</li>
		<li>1 L 기판 버퍼의 준비 (1 M diethanolamine, pH 9.8 (H2O, pH 10 M HCl을 사용 하 여 조정의 1 L에 diethanolamine의 97 mL)와 0.5 m m MgCl2). 알루미늄 호 일 병을 배치 하 여 빛 으로부터 기판 버퍼를 보호 합니다. 4 ° c.에 게</li>
		<li>정지 솔루션 (3 M NaOH) 100 mL를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ELISA 격판덮개 코트:
	<ol>
<li>총 혈 청 Ig isotype ELISA에 대 한 96-잘 면역 접시 10 µ g/mL isotype-특정 캡처 polyclonal 염소 반대로 마우스 Ig의 코트 (M, g 1은, G2a, G2b, G3, A, 또는 E) Abs에 커플링 버퍼 (PBS)에 100 µ L/잘.</li>
		<li>TNP 특정 Ig isotype ELISA, 면역 96 잘 접시 10 µ g/mL의 PBS에 TNP(38)BSA에 100 µ L/잘 코트.</li>
		<li>높은 선호도 TNP 특정 Ig isotype ELISA, 면역 96 잘 접시 10 µ g/mL PBS에 TNP(3)BSA의 100 µ L/잘26코트. 4 ° C에서 접시를 밤새 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>코팅 부 화 후 2 번 200 µ L/잘 PBS-t와 접시 세척 워시 버퍼를 삭제 하 고 오 점 각 세척 후 번호판 (종이 타 올의 스택에 각 접시를 거꾸로 탭)를 건조.</li>
	<li>번호판을 차단: 차단의 200 µ L/잘 추가 코팅된 판으로 (PBS에 1 %BSA)를 버퍼링 하 고 실시간에 1 시간에 대 한 번호판을 품 어</li>
	<li>
번호판을 차단 하는 동안 Ig isotype 표준 및 별도, 치료 96 잘 접시에 150 µ L/잘 차단 버퍼에서 혈 청 샘플의 희석을 준비 합니다.
	<ol>
<li>250 ng/mL Ig isotype 표준 시작 표준 농도 (St01)으로 준비 하 고 서 표준의 직렬 희석 1: 2의 7 ~ 10 할 (St02 St07 또는 St10, 그림 2A).</li>
		<li>1: 100 또는 1: 500 희석에 샘플 시작 희석으로 요소 고 3 또는 4 1시 10분의 총 Ig isotype에 대 한 직렬 희석 또는 각 혈 청 샘플 (그림 2A) TNP 특정 Ig isotype에 대 한 1:5 직렬 희석 마우스 혈 청을 준비. IgE ELISA에 대 한 시작 희석으로 1:2 희석 요소에 마우스 혈 청 샘플을 준비 하 고 각 혈 청 샘플의 직렬 희석 1: 5의 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>차단, 후 단계 5.4 세 번 200 µ L/PBS-T의 우물에서에서 접시를 세척 하 고 오 점 건조 판 각 세척 후.</li>
	<li>5.6 단계에서 준비 된 접시를 100 µ L/잘 희석 Ig isotype 표준 (캡처 및 탐지 Abs에 대 한 적절 한) 및 희석된 혈 청 샘플 단계 5.5에서에서 전송. 표준 및 4 ° C에서 샘플 접시를 밤새 품 어.</li>
	<li>PBS-T의 200 µ L/잘 사용 3 회 접시를 세척 하 고 오 점 건조 판 각 세척 후.</li>
	<li>각 접시에 추가 된 적절 한 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP)의 10 µ g/mL의 100 µ L/잘-활용된 isotype 특정 염소 반대로 마우스 Ig (M, g 1은, G2a, G2b, G3, A, 또는 E) Abs 차단 버퍼에 희석.</li>
	<li>실시간에서 1-2 h에 대 한 AP 활용 된 Abs와 번호판을 품 어 IgE 검출에 대 한 1-2 h 37 ° c.에 대 한 번호판을 품 어</li>
	<li>5 mg 인산 가수분해 효소 기판 기판 버퍼의 10 ml에서의 2 개의 정제를 용 해 하 여 1 mg/mL 기판 솔루션의 준비.</li>
	<li>각 판 5 번 PBS-T의 200 µ L/잘 세척 하 고 오 점 건조 판 각 세척 후.</li>
	<li>100 µ L/잘 기판 솔루션의 각 접시에 추가 합니다. RT는 일반적으로 몇 분만에 개발 하는 반응을 수 있습니다.</li>
	<li>
405에 각 접시를 읽고 nm microplate 리더를 사용 하 여 관련된 소프트웨어와 함께.
	<ol>
<li>"Lm1" 파장을 설정 하려면 "설정"을 클릭 "405 nm" "확인"을 클릭 합니다.</li>
		<li>"빈" 웰 스, "표준" 우물과 96 잘 접시 설치 프로그램에 "알 수 없는" 우물을 할당 하려면 "서식 파일"을 클릭 합니다.</li>
		<li>"표준" 우물 "시리즈" "첫 번째 샘플"로"St01" 설정 "시작"최고", 선택 하 고"복제""2"로 설정을 클릭 하십시오. "샘플 Descriptor"를 확인 하 고 "표준 값"을 입력: ""로"ng/mL단위"를 선택 "250"로 "시작 값", "단계" "2"로 설정. "확인"을 클릭 합니다.</li>
		<li>클릭 하십시오 "읽기" 읽을 접시 가장 집중 표준에 도달 하는 때 ~ 1의 광학 밀도 (OD).</li>
		<li>"파일" 메뉴를 클릭 하 고 파일을 저장 하려면 "저장"을 클릭 합니다.</li>
		<li>때 가장 집중된 표준 접근 ~ 1.5, 2, 2.5, OD405 각각 접시를 다시 읽기 "읽기"를 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>25 µ L/3 M NaOH의 우물을 추가 하 여 반응을 중지 합니다. 한 번에 한 접시 5.12 5.15 단계를 완료 합니다.</li>
	<li>
Microplate 리더 소프트웨어를 사용 하 여 ELISA 데이터 분석:
	<ol>
<li>읽기 파일의 Ig isotype 기준의 OD405 값을 확인 하 고 자세한 데이터 분석을 위한 기준의 좋은 선형 범위와 적절 한 독서를 선택 합니다.</li>
		<li>4-매개 변수 피팅 프로그램 표준 곡선을 플롯을 선택 합니다. Co-효율적인 표준 곡선 (R2) > 0.98 좋은 데이터 품질을 보장 하기 위해 필요를 확인 하십시오.</li>
		<li>각 샘플의 OD405 값 희석 요인 증가 함께 감소 여부를 확인 합니다. "미지수"를 클릭 하 여 모든 희석된 샘플 우물의 농도 검색 합니다.</li>
		<li>농도 계산에 대 한 Ig isotype 표준 곡선의 선형 범위에서 OD405와 각 샘플의 적절 한 음을 선택 합니다.</li>
		<li>계산 하는 수식을 사용 하 여 각 샘플의 Ig isotype 농도 혈 청: 혈 서 농도 = x 희석 요소 선택된 잘 농도.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그래프를 플롯 하 고 적절 한 소프트웨어9,,1011를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다. 혈 청의 수직 점도 Ig isotype 레벨 비교 같은 시간 지점에서 Ig 응답을 확인 합니다. TD 메모리 응답 연구, 부스터 예방 접종 전후 Ig isotype 응답을 검사 시간 코스 응답 곡선을 확인 합니다. 오차 막대를 사용 하 여 샘플의 각 그룹의 표준 편차 (SD) 표시. Ig isotype 응답 마우스의 두 genotypes 사이 비교, 통계적 의미를 확인 하려면 양측 데이터에 대 한 짝이 없는 t 테스트를 사용 합니다. P 값 < 0.05로 상당히 다른 설정 합니다.</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

여기, 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에 TD와 TI Ig isotype 응답 특성에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜의 성공적인 구현에는 표 1, ELISA 분석 실험 접시, 예방접종 Ags, 마우스 Ig isotype-특정 항 체 및 표준에에서 지정 된 재료 사용을 해야 합니다. 애 란에 대 한 치료는 조직 배양 배지를 사용 하지 않도록 주의 해야 합니다. 표준 및 혈 청 샘플의 희석 별도 치료 플레이트 (라운?...

B 림프 구 체액 성 면역에 주요한 선수 및 포유류 생산 항 체, 면역 글로불린 (Ig)1,2라고도 할 수 있는 유일한 셀 형식이 있습니다. B 세포에 의해 은닉 하는 항 체 중립화, 보완 활성화, 보호 면역3선도, opsonization 등 다양 한 메커니즘을 통해 병원 균 침입에 대 한 강력한 방어를 제공 합니다. B 세포에 의해 항 체의 분 비는 일반적으로 두 가지 신호3특정 B 세포의 전체 활성화 후만 이루어집니다. 신호 1 B 세포 수용 체 (BCR) 특정 순진한 B 셀3의 표면에 표현 하는 항 원 (Ag)의 직접 바인딩에 의해 릴레이 됩니다. 신호 2의 원본에 따라 B 세포 활성화 thymus (TD) 또는 thymus-독립 (티)3,4로 나눌 수 있습니다. TD 항 응답에서 신호 2는 세포에 의해 활성화 된 동족 CD4 T 도우미 (TH), CD154, co-stimulatory 수용 체 CD40 B 세포1,2,3에 대 한 리간드를 표현 하는 제공 됩니다. TI 항 응답에서 신호 2 수용 체 통행세 같이의 어느 약혼에서 온다 (타입-1의 경우 TLRs TI Ag)는 BCRs의 광범위 한 cross-linking 또는 (2 형의 경우 TI Ag)는 b 세포3,4. 타입-1 티타늄 (TI 1) 항은 TLRs, 세균성 lipopolysaccharides (LPS), 바이러스 성 RNAs 등 미생물 CpG DNA4,5의 미생물 ligands. 2 형 티타늄 (TI-2) 항 원 높은 반복 구조, 있고 장기 및 영구 BCRs4,6의 여러 cross-linking에 의해 B 세포에 신호를 제공할 수 있습니다. TI-2 항의 전형적인 예로 폐 렴 구 균 다 당 류와 다 당 류 hapten 활용6,7있습니다. TD와 TI 항 강력한 항 원 특정 IgM 응답을 이끌어내는 수 고 또한 항 원 제시 세포 (Apc) 모 수석 세포 (DCs)1 에서 제공 하는 도움 isotype 전환 항 체 (IgG, IgA, ige의)의 생산을 일으킬 수 있다 2,3. 또한, TD와 TI 항 APCs의 도움으로 메모리 응답을 유도 하는 것 수 있지만 TD 항 메모리 B 세포 생성3,8유도에 더 효율적입니다.
이 프로토콜에서 TD와 TI 서 응답 TNP-다 당 류 (중립, 높은 분기 hapten 활용 모델 항 원 2,4,6-trinitrophenyl-열쇠 구멍 삿 hemocyanin (TNP KLH)와 복 (i.p.) 예방 접종에 의해 쥐에 elicited는 그리고 높은 질량), 각각9,,1011. TD 항 원 항 체12의 생산을 강화 하는 보조 일반적으로 사용 됩니다. 여기 우리의 프로토콜에 TNP KLH 졸업생, 면역 연구12에 일반적으로 사용 되는 보조로 주사 된다. 사용할 수 있는 adjuvants의 다른 예로 완전 하거나 불완전 한 Freund의 보조 제 (CFA 또는 아일랜드), monophosphoryl-지질 A / 트 레 할 로스 dicorynomycolate ("Ribi" 보조), 및 CpG oligodeoxynucleotides, 등13, 14. 예방 접종, 후 마우스 세라 다른 시간 지점에서 수확 하 고 세라에 TNP 특정 항 체 Ig isotype-특정 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)9,10, 를 사용 하 여 계량은 11.
애 란은 의학에서 진단 도구와 또한 생물 의학 연구15,16분석 도구로 서 널리 사용 되는 접시 기반 분석 결과 이다. 그것은 감지 analytes 항 체, 호르몬, cytokines, 발산, 그리고 다양 한 항 원, 등등을 포함 하 여 계량 하는 데 사용 됩니다. ELISA는 직접, 간접, 샌드위치 및 경쟁적인 ELISA15,16를 포함 하 여 여러 가지 다른 형식에서 수행할 수 있습니다. 일반적으로, 그것은 일반적으로 결정 96 잘 접시, 기본 항 체와 알을 품는 고체 표면에 항 원 동원 정지를 포함 한다. 부 화, 후 언바운드 항 체는 멀리 세척 된다. 직접 ELISA에서 1 차적인 항 체는 효소 (일반적으로 양 고추냉이 과산화 효소 또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소), 신호 검출 악기에 의해 감지와 같은 보이는 색상 변화를 비 기판 쪼개 다 수는에 직접 활용 한 분 광 광도 계15,16. 대조적으로, 효소 연결한 이차 항 체는 1 차 항 체를 바인딩하는 데 사용 됩니다, 다음이 간주 됩니다 간접적인 ELISA15,16. 직접 ELISA 간접적인 ELISA는 더 민감한15,16빠릅니다. 샌드위치 ELISA, 번호판, 샘플에 대 한 관심의 항을 무력화 하는 데 사용 하는 "캡처" 항 체로 코팅 하 고 캡처된 항 원 직접 또는 간접적인 방식으로15, 에 또 다른 "탐지" 항 체에 의해 검출 될 수 있다 16. 샌드위치 ELISA 항 원 antigen의 두 개의 서로 다른 항 체에 의해 감지 되 면 이후 높은 특이성을 제공. 경쟁적인 ELISA에서 경쟁 샘플 항 원 및 주 항 체 바인딩 위한 플레이트-바인딩 항 간에 설정 하 고 샘플에 있는 항 원 농도 기판에서 신호 감소를 측정 하 여 정량은 15 , 16. 경쟁 ELISA 위에서 언급 한 직접 또는 간접 형식을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 및 단지 1 개의 epitope15,16작은 항 원의 검출을 위한 유용.
항 체의 측정에 대 한 대체 기술을 포함 라디오-immunoassay (RIA), electrochemiluminescence (ECL) 분석 결과 및 표면 플라스몬 공명 (SPR) 시험17. 리아 첫 번째 immunoassay 높은 특이성 및 방사선된 약18,19를 사용 하 여 감도 항 원 (항 체)의 존재 그 조치를 개발 했다. 그러나, 방사성 독성, 폐기 비용, 수명 및 방사성 재료와 함께 작동 하도록 특별 한 라이선스 문제로 인해 ELISA는 더 나은 하 고 일반에 대 한 더 편리한 기술20,21을 사용 하 여 키를 누릅니다. ECL은 chemiluminescent 반응 반응성이 매우 높은 종, 전극의 표면에 안정적인 선구자에서 생성 하는 전기를 사용 하 여 시작 되 고 analytes의 양을 측정 하는 데 사용 될 수 있는 매우 중요 한 분석 결과 (항 원 등 또는 항 체)22. 그러나, ECL 특별 한 계기를 요구 하 고 따라서 사용 되지 않습니다으로 광범위 하 게 일 라23. SPR은 직접 분석 결과 ligands의 바인딩은 측정 하는 데 사용할 수 있습니다 (예., 항 체)를 분자를 움직일 수 (예., 항 원) 센서에 칩 표면24. SPR 매우 구체적으로 실시간으로 상호 작용을 감지 하 고 ELISA로 이라는 시 약의 사용을 요구 하지 않습니다. 그러나, SPR 또한 특별 한 장비를 필요로 하 고 ELISA17보다 낮은 감도 있다. 다른 방법의 한계를 감안할 때, ELISA는이 프로토콜에 우리의 목적을 위해 가장 적합 하 고 편리한 기술 이다. 여기, 우리는 총 Ig isotype 수준 분석 및 항 원 특정 Ig isotypes의 분석에 대 한 간접적인 ELISA의 절차에 대 한 샌드위치 ELISA 사용 하 여를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>VersaMax Tunable Microplate Reader</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>VERSAMAX</td><td>Equipment to read the plates</td></tr><tr><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>Software for the plate reader</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>Software for graphing and statistics</td></tr><tr><td>TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL)</td><td>Biosearch Technologies</td><td>F-1300-10</td><td>A TI Ag for immunization</td></tr><tr><td>TNP-KLH</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5060-5</td><td>A TD Ag for immunization</td></tr><tr><td>TNP(38)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 (conjugation ratio: 38)</td><td>Coating Ag for TNP-specific ELISA</td></tr><tr><td>TNP(3)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 (conjugation ratio: 3)</td><td>Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig</td></tr><tr><td>Imject Alum</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>PI-77161</td><td>Alum adjuvant for immunization</td></tr><tr><td>Falcon Polypropylene tubes</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-959-11A</td><td>For incubation of TNP-KLH/alum</td></tr><tr><td>BD Insulin Syringe</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-829-1B</td><td>For i.p. injection of mice</td></tr><tr><td>Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-245-61</td><td>For ELISA</td></tr><tr><td>Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom</td><td>VWR</td><td>82050-622</td><td>For serial dilutions of standards and samples</td></tr><tr><td>Phosphatase substrate, 5 mg Tablets</td><td>Sigma</td><td>S0942-200TAB</td><td>AP substrate</td></tr><tr><td>Diethanolamine</td><td>VWR</td><td>IC15251690</td><td>A component of AP substrate buffer</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-01</td><td>Capture Ab for mouse IgM</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-01</td><td>Capture Ab for mouse IgG1</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-01</td><td>Capture Ab for mouse IgG2a</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-01</td><td>Capture Ab for mouse IgG2b</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-01</td><td>Capture Ab for mouse IgG3</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-01</td><td>Capture Ab for mouse IgA</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-01</td><td>Capture Ab for mouse IgE</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-04</td><td>Detection Ab for mouse IgM</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-04</td><td>Detection Ab for mouse IgG1</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-04</td><td>Detection Ab for mouse IgG2a</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-04</td><td>Detection Ab for mouse IgG2b</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-04</td><td>Detection Ab for mouse IgG3</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-04</td><td>Detection Ab for mouse IgA</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-04</td><td>Detection Ab for mouse IgE</td></tr><tr><td>Mouse IgM standard</td><td>BD Biosciences</td><td>553472</td><td>TNP-specific IgM, Clone&amp;nbsp; G155-228</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 standard</td><td>BD Biosciences</td><td>554054</td><td>TNP-specific IgG1, Clone&amp;nbsp; 107.3</td></tr><tr><td>Mouse IgG2a standard</td><td>BD Biosciences</td><td>556651</td><td>TNP-specific IgG2a, Clone&amp;nbsp; G155-178</td></tr><tr><td>Mouse IgG2b standard</td><td>BD Biosciences</td><td>554055</td><td>TNP-specific IgG2b, Clone&amp;nbsp; 49.2</td></tr><tr><td>Mouse IgG3 standard</td><td>BD Biosciences</td><td>553486</td><td>KLH-specific IgG3, Clone&amp;nbsp; A112-3</td></tr><tr><td>Mouse IgA standard</td><td>BD Biosciences</td><td>550924</td><td>Mineral oil-induced IgA, Clone&amp;nbsp; MOPC-320</td></tr><tr><td>Mouse IgE standard</td><td>BD Biosciences</td><td>557079</td><td>TNP-specific IgE, Clone&amp;nbsp; C38-2</td></tr></tbody></table>

characterization of thymus-dependent and thymus-independent immunoglobulin isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay

또한 분 비 면역 글로불린 (Ig), B 세포, 체액 성 면역에서 plasmablasts/플라스마 세포 분화 되 나, 항 체는 다양 한 메커니즘을 통해 병원 균 침입에 대 한 강력한 방어를 제공 합니다. 예방 접종의 하나의 주요 목표는 생명을 위협 하는 감염을 방지 하기 위해 보호 항 원 특정 항 체를 유도 하는 것입니다. 모두 thymus-종속 (TD)와 thymus-독립 (TI) 항 강력한 항 원 특정 IgM 응답을 이끌어 낼 수 있습니다 또한 도움으로 메모리 B 세포의 생성 뿐만 아니라 isotype 전환 항 체 (IgG, IgA, ige의)의 생산을 일으킬 수 있다 항 원 제시 세포 (Apc)에 의해 제공. 여기, 우리는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)을 사용 하 여 마우스에 TD 및 TI Ig isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에서 TD와 TI 서 응답은 elicited 쥐에 hapten 활용 모델 항 (졸업생)에 TNP KLH와 (PBS)에 TNP-다 당 류와 복 (i.p.) 예방 접종에 의해 각각. TD 메모리 응답을 유도, 졸업생에 TNP KLH의 부스터 예방 접종 같은 항 원/보조 제와 함께 첫 번째 접종 후 3 주에 제공 됩니다. 예방접종 전후 다른 시간 지점에서 마우스 세라 수확. 총 혈 청 Ig 수준 그리고 TNP 특정 항 체는 이후 각각 Ig isotype-특정 샌드위치 및 간접적인 ELISA를 사용 하 여 계량. 올바르게 각 Ig isotype의 혈 청 농도 측정, 샘플 표준 곡선의 선형 범위에 맞게 적절 하 게 희석 해야 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 지속적으로 얻은 신뢰할 수 있는 결과 높은 특이성 및 감도. Cytometry, 비장 immunohistochemical 및 B 세포의 생체 외에서 문화 다른 상호 보완적인 방법으로 사용 하는 경우 얼룩 (IHC),이 프로토콜을 허용할 것 이다 항 체의 포괄적인 이해를 얻기 위해 연구원 주어진된 실험 설정에 응답 합니다.

우리는 면역 체계, TRAF3, TI 및 TD Ig isotype 응답9,,1011의 중요 한 레 귤 레이 터의 역할을 조사 하기 위해이 프로토콜을 이용 했다. TRAF3 직접 또는 간접적으로 통제 한다 타고 난 및 적응형 면역 수용 체, TNF 수용 체 superfamily를 포함 하 여 다 수의 신호 변환, 수용 체 통행세 같이 그리고 T 세포 수용 체/CD28, ?...

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Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

이 종이에 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에서 T-종속 및 T-독립 면역 글로불린 (Ig) isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 단독으로 사용 하거나 흐름 함께에서 cytometry 쥐 T-종속 및 T 독립적인 항 원 면역 다음에 Ig 중재 하는 B 세포 isotype 응답 차이 식별 하는 연구를 수 있게 됩니다.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.4K 조회수.  Rutgers University. 이 종이에 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에서 T-종속 및 T-독립 면역 글로불린 (Ig) isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 단독으로 사용 하거나 흐름 함께에서 cytometry 쥐 T-종속 및 T 독립적인 항 원 면역 다음에 Ig 중재 하는 B 세포 isotype 응답 차이 식별 하는 연구를 수 있게 됩니다.

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Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

연구

발생학

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

면역학 및 감염병학

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

마우스와 차세대 시퀀싱에 의해 인간의 항 체 레파토리의 식별

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.

인플루엔자 A 바이러스 감염 중 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 반응 평가

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model

In recent years, Hashimoto's thyroiditis (HT) has become the most common autoimmune thyroid disease. It is characterized by lymphocyte infiltration and the detection of specific serum autoantibodies. Although the potential mechanism is still not clear, the risk of Hashimoto's thyroiditis is related to genetic and environmental factors. At present, there are several types of models of autoimmune thyroiditis, including experimental autoimmune thyroiditis (EAT) and spontaneous autoimmune thyroiditis (SAT).
EAT in mice is a common model for HT, which is immunized with lipopolysaccharide (LPS) combined with thyroglobulin (Tg) or supplemented with complete Freund's adjuvant (CFA). The EAT mouse model is widely established in many types of mice. However, the disease progression is more likely associated with the Tg antibody response, which may vary in different experiments.
SAT is also widely used in the study of HT in the NOD.H-2h4 mouse. The NOD.H2h4 mouse is a new strain obtained from the cross of the nonobese diabetic (NOD) mouse with the B10.A(4R), which is significantly induced for HT with or without feeding iodine. During the induction, the NOD.H-2h4 mouse has a high level of TgAb accompanied by lymphocyte infiltration in the thyroid follicular tissue. However, for this type of mouse model, there are few studies to comprehensively evaluate the pathological process during the induction of iodine.
A SAT mouse model for HT research is established in this study, and the pathologic changing process is evaluated after a long period of iodine induction. Through this model, researchers can better understand the pathological development of HT and screen new treatment methods for HT.

Several types of animal models of Hashimoto's thyroiditis have been established, as has spontaneous autoimmune thyroiditis in the NOD mouse. H-2h4 mice are a simple and reliable model for HT induction. This article describes this approach and evaluates the pathological process for a better understanding of the SAT murine model.

마우스 자발성 자가면역 갑상선염 모델 생성

In recent years, Hashimoto's thyroiditis (HT) has become the most common autoimmune thyroid disease. It is characterized by lymphocyte infiltration and ...

Isolation and Characterization of Antigen-Specific T cells in Mouse Lungs(마우스 폐에서 항원 특이적 T 세포의 분리 및 특성 분석)

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

저자 스포트라이트: Tetramers를 사용하여 마우스 폐에서 항원 특이적 T 세포를 검출하기 위한 최적화된 프로토콜

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

펩타이드를 이용한 생쥐 폐의 희귀 항원 특이적 T 세포 식별: 주요 조직적합성 복합체 테트라머

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

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흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착