이 작품은 H JZ를 국가 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. TMBW는 Templestowe 로타리와 치료에 대 한 식사 파트너에 호주 정부에서 오스트레일리아 대학원 포상 및 호주 로타리 건강에서 앤 헨 더 슨 최고 최대 장학금 받는 사람입니다.

모든 동물 실험 동물 윤리 위원회는 멜버른의 대학에 의해 승인 되었다.
참고: 있는 adenoviral에 대 한 순서, 건설 및 세대 프로토콜 벡터 p광고-CMV-Td-톰, p광고-CMV-GFP 와 p광고 CAGA12-뤽/Td-톰 이전 설명된11,12, 13. 모든 벡터를 상업적으로 사용할 수 있습니다.
1. 바이러스 Titer 결정 50% 조직 문화 감염 복용량 (TCID50)를 사용 하 여
<ol><li>1 x 106 DMEM + 10 %FBS 미디어 10 ml에서 HEK293A 셀을 준비 합니다.</li>
	<li>바닥이-96-잘 빠진 셀 문화 접시의 각 음에 세포 현 탁 액의 100 µ L 씨.</li>
	<li>완전 한 매체에서 바이러스의 1: 100 희석의 1 mL를 준비 합니다. 열 1의 각 음에 희석된 바이러스의 11 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>1의 최종 희석까지 세포 현 탁 액의 100 µ L와 희석된 바이러스의 11 µ L를 혼합 하 여 96 잘 접시에 직접 직렬 10 희석 수행 x1012 에 도달. 세포는 비 점착이이 단계에서 웰 스 간에 전송 되는 셀의 수 일정 하 게 유지.</li>
	<li>11 µ L 10의 높은 희석으로 시작 하는 각 열에 각 희석의 플라스틱4. 피 펫 팁을 바이러스 성 입자의 크로스 오버를 제한 하려면 각 희석 바꿉니다.</li>
	<li>부정적인 통제로 열 12 완전 한 바이러스 무료 미디어의 11 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>10% CO2와 37 ° C에서 7-10 일 동안 접시를 품 어.</li>
	<li>현미경을 사용 하 여, cytopathic 또는 세포 독성 효과의 징후를 표시 하는 각 열에는 우물의 수 점수. 감염의 어떤 표시 든 지 있으면 잘 긍정을 고려 하십시오.</li>
	<li>리드와 Muench (1938) 통계 방법14를 사용 하 여 각 희석에 대 한 긍정적인 우물의 분수를 계산 합니다.</li>
	<li>비례 거리 (PD)를 사용 하 여 계산: (A-50)/(A-B), A는 위의 또는 50% 비율 응답 및 B는 50% 미만 비율 응답</li>
	<li>TCID50 를 사용 하 여 계산: 10X-PD, 여기서 X는 희석 50% 보다 큰 응답을 주는.</li>
	<li>다음을 사용 하 여 바이러스 titer 계산: 0.69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL</li>
</ol>2. 아 데 노비 루스 나 결정
<ol><li>씨 1.0-1.5 x 500 μ와 105 MDA-MB-231 셀 DMEM 문화 포함 된 미디어 5% FBS 12의 각 음에 잘 접시 (35% 셀 confluency, 총에서 6 우물).</li>
	<li>광고-CMV-Td-톰 주식 0, 250, 500, 2500에 필요한 및 다음 수식을 사용 하 여 5000 나의 볼륨 계산: 나 = (볼륨 [μ] PFU/μ x) / 셀 수. 1 x 1010 (PFU/mL), 바이러스 감염의 볼륨의 titer와 광고-CMV-Td-톰 에 대 한 필요한 MOIs 있으며 0, 3.75, 7.5, 37.5, 75 μ 각각.</li>
	<li>직접 철저 한 혼합과 우물에 바이러스 성 재고를 pipetting 여 섹션 2.2에 광고-CMV-Td-톰 의 계산 볼륨 세포를 감염.</li>
	<li>24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>우물에서 미디어를 제거 하 고 즉시 5 분 동안 10% 포 르 말린의 500 μ와 셀을 수정.</li>
	<li>우물에서 포 르 말린을 발음 하 고 PBS의 500 μ와 웰 스를 한 번 씻어.</li>
	<li>5 분 동안 Hoechst 솔루션의 500 μ와 세포 핵 얼룩.</li>
	<li>Hoechst 솔루션을 제거 하 고 세척 PBS 3 번 500 μ와 우물.</li>
	<li>이미지 Td 토마토 단백질 및 세포 핵에 형광 현미경 200 배 확대를 사용 하 여 신호. 554에서 Td 토마토 단백질을 자극 및 352에서 Hoechst 염료 nm.</li>
	<li>ImageJ 나 Td 토마토15의 100% 감염에 필요한 작업을 사용 하 여 이미지를 분석 합니다.</li>
</ol>3. 듀얼-아 데 노 바이러스 전달 라이브 단일 셀에
<ol><li>씨 1.0-1.5 x 500 μ와 105 MDA-MB-231 셀 DMEM 문화 포함 된 미디어 5% FBS 12의 각 음에 잘 접시 (35% 셀 confluency, 총에서 2 웰 스).</li>
	<li>광고-CMV-GFP 의 75 μ를 가진 세포를 감염 (titer = 5 x 109 PFU/mL) 및 광고 CAGA12-Td-톰 의 7.5 μ (titer = 5 x 1010 PFU/mL)를 100% 감염 양성을 달성할 수 있는 2500만.</li>
	<li>아 데 노비 루스 감염 직후 또는 TGF-β의 우물 (10 mg/mL 재고 있음, 최종 농도 5 ng/μ) 당 0.25 μ 없이 셀을 취급 합니다.</li>
	<li>24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>단계 대조 형광 현미경 이미지 라이브 셀입니다. 470 nm와 554에서 Td 토마토 단백질 GFP를 자극 nm.</li>
	<li>세포를 해결 하 고 얼룩 세포 핵 단계 1.6-1.9에에서 설명 된 대로.</li>
	<li>Td-토마토 단백질 영상과 Hoechst 형광 현미경을 사용 하 여 얼룩. 352에 Hoechst 염료 자극 nm.</li>
	<li>ImageJ를 사용 하 여, GFP와 Td-토마토의 비율15셀을 계산 합니다.</li>
</ol>4. 살아있는 단일 세포 신호에 상처 분석 결과 치유
<ol><li>씨 4-5 105 MDA-MB-231 셀 1ml x DMEM 문화 포함 된 미디어 FBS는 6의 각 음에 잘 접시 5% (50% 셀 confluency, 총에서 2 웰 스).</li>
	<li>광고 CAGA12-Td-톰 의 22.5 μ를 가진 세포를 감염 (titer 5 x 1010 PFU/mL, 나 = = 2500).</li>
	<li>24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>두 개의 교차 라인 P200 피 펫 팁을 사용 하 여 각의 셀 계층에 스크래치.</li>
	<li>우물에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 FBS 미디어 또는 잘 (10mg/mL 재고 있음, 최종 농도 5 ng/μ) 당 TGF-β의 0.5 μ 없이 신선한 5%의 2 개 mL를 바꿉니다.</li>
	<li>5 분 동안 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓고 단계 대조 현미경에 100 배 확대를 사용 하 여 선택한 상처 영역에의 이미지.</li>
	<li>24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>전에 같은 분야에서 상처 폐쇄의 이미지를 가져가 라.</li>
	<li>세포를 해결 하 고 단계 1.6-1.9에에서 설명 된 대로 세포 핵 얼룩 상처 영역에 비 상처 영역에 형광 현미경 200 배 확대를 사용 하 여 Td 토마토 신호를 시각화.</li>
	<li>상처에 ImageJ 소프트웨어15를 사용 하 여 비 상처 영역 Td-토마토 긍정적인 세포의 비율 계량.</li>
</ol>5. 생체 외에서 Luciferase 분석 결과
<ol><li>3-5 x 5% 포함 된 DMEM 미디어의 1 mL에 104 MDA-MB-231 셀의 셀 서 스 펜 션 준비 FBS.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 2.5 μ와 감염 광고 CAGA12-루크 (titer 5 x 1010 PFU/mL, 나 = = 2500).</li>
	<li>씨는 96로 감염 된 세포에 3000 셀/100 µ L/잘 잘 플레이트.</li>
	<li>24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>우물에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 신선한 5 %FBS 미디어와 함께 또는 없이 잘 (재고 1 mg/mL, 최종 농도 1 ng/μ) 당 TGF-β의 0.1 μ의 100 µ L를 바꿉니다 및 TGF-β 억제제 잘 (재고 7 mg/mL 당 0.17 μ의 유무에 최종 농도 12 ng/μ) (소설 TGF-β ligand 트랩 단백질, 첸 그 외 여러분, 게시 되지 않은 작업).</li>
	<li>24 h에 대 한 10% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>Thaw luciferase 분석 결과 시스템 기판 밖으로 하 고 1 x 셀 문화 세포 시 약 두 배 증류수 (DDW)에서 준비.</li>
	<li>96 웰 스에서 미디어를 제거 하 고 30 분에 대 한 부드러운 동요와 궤도 셰이 커를 사용 하 여 얼음에 1 x 셀 문화 세포의 용 해 버퍼의 50 μ와 웰 스를 lyse.</li>
	<li>불투명 luciferase 접시에 각 우물에서 30 μ lysate의 전송 및 실내 온도를 따뜻하게 접시 허용.</li>
	<li>루미 노 소프트웨어에서 새 프로토콜을 만듭니다. 주입 전후 측정 1 인젝터를 선택 합니다. 1 주입 하기 전에 측정을 설정 지연 측정 및 통합 시간에 대 한 s. 주입 측정 후 설정 주입 볼륨 1의 지연 측정에 40 µ L를 주입 후 5 s s 통합 시간. 확인을 선택 하 여 설정을 확인 합니다.</li>
	<li>DDW로 인젝터 튜브를 놓고 사용 하기 전에 인젝터 튜브 청소 프라임 설정에서 인젝터 1 단추를 클릭 합니다. 다음 DDW와 공기 튜브에서 모든 솔루션을 플러시 인젝터 1의 두 개의 추가 소수 다음 장소에서 인젝터 튜브를 제거 합니다. 인젝터 튜브를 반딧불 기판 및 프라임 기판 준비를 두 번 다시 넣으십시오.</li>
	<li>루미 노에 예제와 함께 불투명 luciferase 접시를 놓고 소프트웨어에 옵션 을 선택 합니다. 관심의 웰 스를 선택 하 고 적용을 클릭 합니다. Luciferase 신호 측정을 시작 을 누릅니다.</li>
	<li>측정 완료 되 면 제거 하 고 접시 물으로 린스. 인젝터 관으로 공기와 반딧불 기판 관으로 다시 프라임 인젝터 1로 튜브를 배치 하 여 모든 나머지 기판을 복구 합니다. DDW로 인젝터 튜브를 놓고 두 개의 추가 소수 모든 나머지 기판의 인젝터 튜브 청소를 수행 합니다.</li>
</ol>6. 셀 라이브 신호 이미징에 비보에 대 한 준비
<ol><li>종양 이식 전에 h 48 175 cm2 플라스 크 (총에서 10 플라스 크)에 2-3 106 MDA-MB-231 셀 배 씨. 셀에 20 mL의 5%를 포함 된 DMEM 미디어 문화 FBS 37 ° c, 10% CO2.</li>
	<li>24 시간 후, 추가 300 μ의 광고 CAGA12-루크 (titer 5 x 1010 PFU/mL, 나 = = 2500) 각 플라스 크에. 또 다른 24 h에 대 한 문화에 셀을 계속.</li>
	<li>이식의 날, 오래 된 미디어를 제거 하 고 한 번 20 mL PBS, pH 7.4의와 아 데 노 바이러스 감염 세포를 씻어. 플라스 크에 0.05% 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 하 고 모든 플라스 크의 표면에 트립 신 수 있도록 약간 플라스 크를 흔들어. 37 ° C, 3 분 동안 10% CO2 배양 기에 있는 플라스 크를 놓습니다.</li>
	<li>FBS-포함 된 DMEM 미디어의 8 mL 플라스 크에 추가 하 여는 트립 신을 끄다. 유리 시 약 병에 모든 셀 정지를 전송 합니다.</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산 하 고 두 50 ml 원심 분리기 튜브 107 셀 x 4.8 전송.</li>
	<li>트립 신을 제거 하 여 720 ml 신선한 FBS DMEM 미디어의 셀 resuspend RT 5 분에 대 한 400 x g에서 셀 원심</li>
	<li>살 균 5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 160 μ 추가 Matrigel (10% 총 matrigel 중지).</li>
	<li>얼음에 세포 이식까지 유지.</li>
</ol>7. Orthotopic 주입
<ol><li>그리고 무게 12 SCID 마우스 제어 및 치료 그룹 (6 쥐/그룹)으로 마우스를 무작위로 할당.</li>
	<li>무 균 환경을 유지 하기 위하여 살 균 바이오-캐비닛에 주입을 수행 합니다. Anaesthetize 1 L/분 장소 열 패드 마우스의 산소 흐름 속도 2.5-4.5 %isoflurane 사용 하 여 마우스와 눈 연 고 각 막의 손상을 방지 하려면 양쪽 눈에 윤 활의 한 방울을 분배. isoflurane에 연결 코 콘으로 주 둥이 배치 하 여 마 취를 유지 하는 동안 부정사 위치에 열 패드를 마우스를 수정.</li>
	<li>핀치를 발 끝에 대 한 반응의 부족에 의해 마 취의 성공을 확인 합니다. 1 L/min 산소 주입의 신호에 대 한 1.5-2.5%의 유지 보수 복용량 isoflurane를 줄입니다.</li>
	<li>80% 에탄올으로 담근 면봉을 사용 하 여 중간 선 양쪽에 제 4 젖꼭지에서 피부를 청소.</li>
	<li>촉진을 통해 4번째 유 방 지방 패드를 찾아서 더 조직을 노출 하는 지방 패드를 짠 다.</li>
	<li>잘 아래로 pipetting으로 세포 현 탁 액을 혼합. 부드럽게 27 G 인슐린 주사기로 세포 혼합물의 50 µ L를 발음 하 고 유 방 지방 패드는 마우스의 양쪽에 주입.</li>
	<li>뚱뚱한 패드의 붓기에 대 한 느낌으로 성공적인 주입을 확인 합니다. 부드럽게 지방 패드를 분리 하 고 감 금 소에 다시 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>새 장을 얻기 위해 의식 그리고 다음 3 일 동안 지주 방에 다시 감 금 소를 배치 마우스 수 있도록 적어도 30 분 동안 히트 패드에 둡니다.</li>
</ol>8. IVIS 이미징
<ol><li>생활 이미지 소프트웨어를 엽니다.</li>
	<li>IVIS 시스템 제어판에서 IVIS 시스템 초기화 버튼을 클릭 하 여 초기화 합니다. 온도 기호를 녹색 밝혀 졌 때까지 기다립니다.</li>
	<li>컨트롤 패널에서 Luminescent 이미징 모드를 선택 합니다.</li>
	<li>Isoflurane 마 취 약 실 및 IVIS 시스템을 켭니다.</li>
	<li>1 L/min 산소 2.5-4.5 %isoflurane 사용 하 여 쥐를 anaesthetize. Anaesthetized, 유지 보수에 대 한 1.5-2.5%에서 isoflurane 설정. 복 (i.p.) 주입에 의해 쥐로 D-소의 150 밀리 그램/kg 체중을 주사.</li>
	<li>IVIS 시스템으로 마우스를 즉시 전송, 온도 제어 이미징 플랫폼에 그들을 배치 하 고 원뿔에 그들의 코를 장소.</li>
	<li>컨트롤 패널에서 시퀀스 설정 버튼 클릭 하 고 중간 Binning선택.</li>
	<li>다음과 같이 이미지 노출 시간 설정: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 그리고 120 s. 시작 소 주사 후 약 3 분 영상 신호를 시작 될 때까지 이미지를 계속 (일반적으로 약 20 분 걸릴 것 이다).</li>
	<li>코 통해 isoflurane 마 취를 유지 하면서 IVIS에서 쥐를 제거 하 고 50 µ L PBS 또는 50 µ L TGF-β 신호 전달 억제제 (50 μ g/종양) 종양 내 주입을 통해 마우스를 치료.</li>
	<li>장에 다시 쥐를 넣고 30 분 이상 열 패드에 그들을 두고. 다음 지주 방에 케이지를 놓습니다.</li>
	<li>IVIS 치료 다음 날 위에서 설명한 절차를 이미지를 반복 합니다.</li>
</ol>9. 데이터 분석
<ol><li>오픈 생활 이미지 소프트웨어에 파일을 저장.</li>
	<li>보기 를 사용 하 여 이미지 정보를 찾기 | 이미지 정보입니다.</li>
	<li>같은 노출 시간과 비슷한 시간 포인트에서 촬영 한 사진을 선택 합니다. 그룹으로 사진을 로드 합니다.</li>
	<li>강도 정상화 이미지 조정 에서 개별 상자 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>강도 분석을 광자 모드를 선택 합니다. 투자 수익 도구에 관심 영역 (ROI) 버튼을 선택 하 여 신호 강도 수량화 합니다.</li>
	<li>발광 신호를 포함 하는 지역에 투자 수익 원을 드래그 하 고 신호 강도 얻으려고 측정 버튼을 클릭.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Massague, J., Like, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+receptors+for+type+beta+transforming+growth+factor.+Ligand+binding+and+affinity+labeling+in+human+and+rodent+cell+lines.">Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).</li><li>Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+import+function+of+Smad2+is+masked+by+SARA+and+unmasked+by+TGFbeta-dependent+phosphorylation.">The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).</li><li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+signaling+in+context.">TGFbeta signaling in context.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).</li><li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad+transcription+factors.">Smad transcription factors.</a> Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).</li><li>Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transforming+growth+factor+beta+in+human+disease.">Role of transforming growth factor beta in human disease.</a> The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).</li><li>Zhu, H. J., Burgess, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transforming+growth+factor-beta+signaling.">Regulation of transforming growth factor-beta signaling.</a> Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).</li><li>Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;+in+Cancer.">TGF&#946; in Cancer.</a> Cell. 134, 215-230 (2008).</li><li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+live+cell+TGF-beta+signaling+imaging:+breast+cancer+cell+motility+and+migration+is+driven+by+sub-populations+of+cells+with+dynamic+TGF-beta-Smad3+activity.">Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity.</a> Molecular cancer. 14, 50 (2015).</li><li>Clarke, D. C., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+quantitative+nature+of+TGF-beta/Smad+signaling.">Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling.</a> Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).</li><li>Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+single-molecule+study+of+TGF-beta/Smad+signaling.">Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).</li><li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+reagents+for+improved+in+vitro+and+in+vivo+examination+of+TGF-beta+signalling.">New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling.</a> Growth factors. 29, 211-218 (2011).</li><li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene.">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).</li><li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Stat3+and+Smad7+to+restore+TGF-beta+cytostatic+regulation+of+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo.</a> Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Method+of+Estimating+Fifty+Per+Cent+Endpoints.">A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+inhibits+transforming+growth+factor+beta-mediated+transcription+by+repressing+Smad3+transcriptional+activity.">c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).</li><li>Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta-induced+nuclear+localization+of+Smad2+and+Smad3+in+Smad4+null+cancer+cell+lines.">TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines.</a> Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4, 43-63 (2017).</li><li>Wang, I. I., Huang, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+technology+for+gene+manipulation+and+functional+studies.">Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies.</a> Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).</li><li>Kochanek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+adenoviral+vector:+Replacement+of+all+viral+coding+sequences+with+28+kb+of+DNA+independently+expressing+both+full-length+dystrophin+and+beta-galactosidase.">A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).</li><li>Wang, Q., Finer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-generation+adenovirus+vectors.">Second-generation adenovirus vectors.</a> Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).</li><li>Durham, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+replication-defective+adenoviral+recombinants+in+dissociated+cultures+of+nervous+tissue.">Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue.</a> Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).</li><li>MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+vector-mediated+gene+transfer+to+primitive+human+hematopoietic+progenitor+cells:+assessment+of+transduction+and+toxicity+in+long-term+culture.">Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture.</a> Blood. 96, 100-108 (2000).</li><li>Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+wild-type+contamination+in+a+recombinant+adenoviral+preparation+by+PCR.">Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR.</a> Biotechniques. 18, 444-447 (1995).</li><li>Choi, Y., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+vaccine+applications.">Viral vectors for vaccine applications.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).</li><li>de Cassan, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+potent+adjuvants+to+enhance+the+immunogenicity+and+protective+efficacy+of+protein+vaccines+can+be+overcome+by+prior+immunization+with+a+recombinant+adenovirus.">The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus.</a> Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).</li><li>Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+with+modified+fibers+for+altering+viral+tropism.">Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism.</a> Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).</li><li>Wickham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer+by+adenovirus+vectors+containing+chimeric+fiber+proteins.">Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins.</a> Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).</li><li>Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Virus vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+receptor+NR4A1+promotes+breast+cancer+invasion+and+metastasis+by+activating+TGF-beta+signalling.">Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling.</a> Nature communications. 5, 3388 (2014).</li></ol>

저자는 충돌의 관심을 보고.

TGF-β/Smad3 단일 라이브 셀에 신호의 실시간 이미징에 대 한 수 있도록 기술을 개발 했습니다. 이 새로운 방법을 사용 하 여, 우리는 이전 확인 셀의 하위 인구 동적 TGF-β/Smad3 transcriptional 활동 향상 된 내 습 및 마이그레이션8에 연결. 이 방법은 Smad3 인 산화의 서쪽 오 점 등 TGF-β 신호에 대 한 전통적인 분석 실험에 개선 및 TGF-β는이 포착 하 여 유전자 발현을 대상 TGF-β/Smad3 종양 인구 내의 신호 및 강조의 단일 세포 생물학의 중요성입니다. 또한, 시간이 소모 및 비싼 핵 전 좌 수와 같은 단일 셀 이미징의 대체 방법에서 수행 하는 경우 라이브 세포와 유전자 전사16,17에 항상 번역 하지 않을 수 있습니다. 이러한 메서드는 신호 변환의 업스트림 경로 검사 하는 것이 중요, 아 데 노비 루스 기자 시스템 생물학 기능에 관하여 개별 셀에서 TGF-β/Smad3 신호에 독특한 관점을 제공 합니다.
크게, 우리의 방법에서 TGF-β/Smad3 신호 통로의 비보에 탐지에 대 한 과민 하 고 재현할 수 메서드를 제공 합니다 실시간 종양 진행 및 치료 하는 동안. 마찬가지로 전통적인 안정 luciferase vivo에서 화상 진 찰, 마우스 내 TGF-β/Smad3 신호 탐지 세포의 수와 발기인 활동18의 수준에 따라 달라 집니다. 피하 조직 분석에 대 한 작은 간섭 제공, 세포의 증가 깊이 신호 검출의 감도 줄일 것입니다. 그것은 다른 기관, 폐와 뼈, 등 다른 암;에 사용 하기 위해 메서드를 확장 수 그러나, 신호 최적화 또는 비보 전 영상 관심의 암 모델에 필요한 감도 달성 하기 위해 좋습니다.
아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 추가 혜택의 응용 프로그램 라이브 셀에 동시에 여러 신호 통로의 분석을 확장 하는 것입니다. 그림 2A, 우리 MDA-MB-231 셀 2 별도 아 데 노 바이러스 벡터, CMV GFP와 CAGA 톰으로 불리고 될 수 있는 시연 했다. 이 듀얼 감염 시스템 보고 형광 기자 단백질 및 luciferase 기자 (반딧불과 Guassia luciferase 기자 단백질을 사용 하 여)를 통해 두 개의 서로 다른 신호 통로를 더 확장할 수 있습니다. 우리의 실험실 (데이터 표시 되지 않음) 라이브 암 세포 선의 수에 BMP/Smad1 및 TGF-β/Smad3 신호 통로의 동시 신호를 달성 했다.
아 데 노비 루스 기자 시스템 TGF-β/Smad 신호 통로의 라이브 셀 이미징에 대 한 쉽고 편리한 방법을 모두 제공 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 시스템에는 다른 일반적으로 사용 되 기자 시스템에 비해 뚜렷한 장점이 있습니다. 첫째, 아 데 노 바이러스 벡터는 그들에 게19,20,,2122transduce 하기 어려운 세포 라인에 대 한 최적의 시스템을 만들기 최고의 바이러스 성 변환 효능 들을 보고 됩니다. 또한 바이러스 성 기술에 있는 현재 전진으로 증가 외 인 DNA 용량23에 대 한 허용 하는 바이러스 성 게놈의 대부분을 제거 하 여 'gutless' 아 데 노 바이러스 벡터를 생성할 수 있습니다. 비 바이러스 성 전달 시스템에 비해 아 데 노 바이러스 벡터 훨씬 더 큰 배송 효율19,20,21 셀 변환에 대 한 비용, 신속 하 고 쉽게 응용 프로그램을 나타내는 ,22.
이 프로토콜 사용 하 여 복제 무능 2 세대 아 데 노비 루스 식 시스템 E1a와 E1b 단백질을 표현 하지 않는 포유류 세포, 최소화 biosafety 위험24. 그러나, 이러한 향상 된 biosafety 기능, 아 데 노 바이러스 입자 수에 높은 효능25,26기본 인간 세포 transduce. 미국 Biosafety 수준 2와 견제 adenoviral 벡터의 처리 및 아 데 노 바이러스의 폐기 장비를 오염 할 때 좋습니다. HEK293A 세포에 아 데 노비 루스의 대규모 확대 복제 유능한 "야생-타입" 아 데 노비 루스27의 드문 발생 될 수 있습니다. PCR 검사는 야생-타입 오염27를 식별 하기 위해 수행 되어야 한다.
복제 무능 아 데 노 바이러스 벡터 식에서 과도 하 고 호스트 DNA20,21와 통합 하지 않습니다. 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 장기 실험의 유효성을 확인 하는 실험 식 그들의 기자 단백질의 안정성을 식별 하는 것이 좋습니다. 셀 내에서 아 데 노 바이러스 벡터의 식 시간 세포와 바이러스 방어의 분할 시간에 비례 이다. 재현 가능한 결과 보장 하기 위해, 그것은 중요 바이러스 titer 바이러스 성 각 일괄 처리에 대 한 정확 하 게 결정 됩니다. 또한, 지나치게 높은 볼륨은 아 데 노 바이러스의 세포 독성 또는 cytopathic 효과 귀 착될 수 있다 그리고 그것은 중요 한 최상의 결과 보장 하기 위해 사용 되는 최적의 나 줄지어 각 셀에 대 한 경험적으로 결정 됩니다. 또한, vivo에서 아 데 노 바이러스 벡터의 사용 면역 반응;을 일으킬 수 있다 어디 면역 반응 실험의 기본 관측 되지 않습니다 면역-손상 된 동물20,21권장 됩니다. 추가 품질 관리는 백신 치료28,29에 보조로는 아 데 노 바이러스를 사용 하 여 검증 되었습니다 비록 adenoviral 벡터 대상 면역 반응를 사용 하는 경우 필요 합니다.
아 데 노비 루스 기자 시스템 모두를 분할 하 고 분할 비의 기본 및 교양 셀 라인의 광범위 한 범위에 사용할 수 있습니다 자연20,22. 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여, 우리는 뇌를 포함 한 암 세포 선의 수에 100% 감염 속도 달성, 유 방, 잘 기본 마우스 Embryological 섬유 아 세포 (MEF) 및 개 신장 상피 (MDCK) 세포로 대 장. 또한, adenoviral 벡터 제공 향상 된 기관 대상으로 효능 변환30,31셀 형 특정 수용 체에 대 한 선호도 증가를 더 수정할 수 있습니다.
이 방법의 응용 프로그램은 다른 신호 통로 셀 호스트를 확장할 수 있습니다. Adenoviral 기자 시스템의 주요 이점에는 싸구려, 높은 변환 효율, 빠른 실험 설치 및 호스트 DNA21,32와 통합의 부족 포함 됩니다. 이 방법은 많은 현재 분석 실험을 vivo에서 , 포함 한 모델의 새로운 타겟된 치료제33평가에 적용할 수 있습니다. 우리는이 기술 사용 하 여 신호 통로 및 새로운 생물학적 발견과 새로운 치료법의 개발을 선도 하는 생물 학적 과정 사이 관계의 우리의 이해를 향상 시킬 것입니다 바랍니다.

변형 시키는 성장 인자 (TGF-β) β는 heterodimeric 유형 II의 구성 된 복잡 한을 통해 인간 발달에 연루는 필수적인 cytokine 이며 유형 I 수용 체1. 유형 II 수용 체에 바인딩 결과 신규 모집과 인 산화의 유형 내가 차례로 다운스트림 Smad2/3 단백질2,3phosphorylates 수용 체. 이 핵에 translocates 유전자 전사4규제 하는 복잡 한 형성 하 Smad4에 Smad2/3 단백질 바인딩 활성화. 항상성 조건 TGF-β/Smad 신호는 단단히 통제; 그러나, 많은 질병, 신호 통로 폐지 되 고 종종 overexpressed 질병5,,67의 진행 하는 최고의. 최근 연구는 TGF-β 세포 응답은 이기종 및 TGF-β/Smad 활성 세포의 부분 모집단은 시간에 따른 방식으로8,9생물 학적 기능에 대 한 책임을 증명 하고있다. 종종 평균 TGF-β/Smad 효과10을 quantitate만 세포 활동의 스냅샷을 제공 하는 고정된 끝점 분석 실험의 사용을 포함 하는 TGF-β/Smad 신호의 일반적인 세포 분석. 그러나이 방법,, 수 있습니다 정확 하 게 대표 하지 질병의 진행 하는 동안 생리 적인 상태에서 TGF-β/Smad 신호 분자 행동. 이미지 기반 라이브 셀 캡처 공간 및 시간 이해 세포 및 생물 학적 과정의 역동성의 분석.
우리의 목표는 TGF-β/Smad 아 데 노비 루스 기반 시 약을 사용 하 여 신호의 라이브 셀 이미징에 대 한 중요 한 높은 처리 방법을 개발 했다. 여기, 우리 Smad3 CAGA 모티브 바인딩 시퀀스와 luciferase (루크) 또는 Td-토마토 (Td-톰) 리포터 유전자를 표현 하는 아 데 노비 루스 인간 유 방 암 세포 선 MDA-MB-231 감염. Adenoviral 기자 시스템 암 세포 라인에 100% 감염 속도에서 발생할 수 있는 플라스 미드 소개에 대 한 신속 하 고 저렴 한 방법을 제공 합니다. Adenoviral 기자 시스템은 또한 성공적으로 적용 되었습니다 기존의 플라스 미드11transfect 하기 어려운 셀 라인에. 이 프로토콜에서 TGFβ/Smad 신호 통로의 라이브 셀 이미징 달성을 재현할 수 및 비 침범 성 과정 설명 합니다 및 모두 에서 vivo에서 체 외.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>1881024</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Scientifix Life</td><td>FBS500-S</td><td>Heat inactivated before use</td></tr><tr><td>Recombinant Human TGF-&amp;beta;1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21</td><td>Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5117</td><td>Dilute in to PBS to make final concentration at 1 &amp;mu;L/mL</td></tr><tr><td>Luciferase Reporter Assay Kit</td><td>Promega</td><td>197897</td><td>Dilute 5x in PBS before use</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Promega</td><td>9100-002</td><td></td></tr><tr><td>Phase contrast fluorescence microscopy</td><td>OLYMPUS</td><td>IX50</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>VivoGl Luciferin</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III In Vivo Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Diltue to 0.05% (1x) in PBS</td></tr><tr><td>Cell Culture Lysis 5x Reagent</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Dilute to 1x in DDW</td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293A</td><td>ThermoFisher</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>PRKDC-SCID</td><td>Animal Resources Centre</td><td>SCIDF6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Zoetis</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Chem-supply</td><td>EA043-10L-P</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Night Time</td><td>Allergan</td><td>1750D</td><td>Lubricating Eye Ointment</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Composition&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (4 mM); NaHPO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;(16 mM); NaCl (0.12M)</td></tr><tr><td>FBS-DMEM&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>5% heat inactivated FBS; 10 &amp;mu;g/mL penicillin; 100 &amp;mu;g/mL streptomycin</td></tr></tbody></table>

live cell imaging of the tgf-	&beta;/smad3 signaling pathway in vitro and in vivo using an adenovirus reporter system

성장 인자 (TGF-β) β 신호 변환 세포 항상성에 필요한 많은 중요 한 기능을 조절 하 고 암 등 많은 질병에 overexpressed 일반적으로 있다. TGF-β는 강하게 연루 전이에 늦게 단계 암 진행 동안 철새 및 침략 적인 종양 세포의 하위 집합을 활성화. 신호 경로 분석에 대 한 현재 메서드 끝점 모델, 종종 생물 학적 이벤트의 신호 포스트-임시 측정을 시도 하 고 질병의 진보적인 성격을 반영 하지 않습니다에 초점. 여기, 라이브 셀에 transcriptional 활성화를 검색할 수 있는 TGF-β/Smad3 신호 전달 경로 대 한 소설 아 데 노비 루스 기자 시스템 특정을 설명 합니다. 광고 CAGA12-Td-톰 기자를 활용 하 여, 우리 24 시간 시험관내의 MDA-MB-231 셀의 100% 감염 속도 얻을 수 있습니다. 형광 기자의 사용에 살아있는 단일 세포의 영상에 대 한 수 있습니다 transcriptionally 활성 셀의 직접 식별과 실시간. TGF-β와 감염 된 세포의 자극 transcriptionally 활성화 하 고 특정 한 생물학 기능에 관련 된 셀의 하위 집합만 표시 됩니다. 이 이렇게 높은 특이성 및 단일 세포 수준에서 감도 TGF-β 신호 vitro에관련 생물 학적 기능의 이해 향상을 수 있습니다. Smad3 transcriptional 활동 수도 있습니다 보고 vivo에서 에서 응용 프로그램을 통해 실시간으로 광고 CAGA12-루크 기자. 광고-CAGA12-루크 전통적인 안정적 transfected luciferase 셀 라인으로 동일한 방식으로 측정 될 수 있다. Vivo에서 이식 세포의 Smad3 transcriptional 활동 통해 기존의 IVIS 이미징 분석 하 고 종양 진행, TGF-β 신호 통로의 역학에 대 한 독특한 통찰력을 제공 하는 동안 라이브 모니터 수 있습니다. 우리의 프로토콜 설명 라이브 세포 신호 통로의 빠른 높은 처리량 이미징에 대 한 허용 하는 유리 기자 전달 시스템 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 메서드는 이미지를 기반으로 분석 및 기본 생물학 및 치료 개발에 대 한 과민 하 고 재현 가능한 방식으로 선물의 범위를 확장할 수 있습니다.

단일 세포 생체 외에서 이미징 라이브
정확 하 게 평가 아 데 노비 루스 기반 시 약을 사용 하 여 단일 세포에서 TGF-β/Smad 신호의 활성화, 그것은 먼저는 최적의 다양성의 감염 (MOI) 각 셀 라인을 결정 하는 것이 중요. 최적의 나 셀의 100%는 아니 현재 cytopathic 또는 세포 독성 효과 adenoviral 감염에 대 한 긍정적인 결정 됩니다. 이 결정, 우리는 긍정적인 감염의 감 적으로 constitutively 활성 광고-CMV-Td-톰 기자를 사용 합니다. 아 데 노 바이러스 감염 세포의 비율이 나 의존 하는 방식으로 0에서 5000 나에 증가 되었다. 2500만에서 MDA-MB-231 셀 (그림 1A, 1B)에 100 %Td-톰 식을 관찰합니다. 픽셀 강도/셀도 나, 향상 된 감도 및 검출 transcriptional 출력 (그림 1C)의 제공으로 증가 했다. 따라서, 일 2, 500의 나 어디 셀에 동시에 광고-CMV-GFP (세포 감염에 대 한 긍정적인 제어 역임)와 광고 CAGA12-Td-톰 감염 했다 이중 감염을 수행 하기 위해 사용 되었다. 단일 셀 Td-톰 식 라이브와 고정 셀에 셀에 걸쳐 TGF-β/Smad3 전사의 이기종 활성화를 나타내는 다양 한 수준의 제공. (그림 2A, 2B). MDA-MB-231 셀 셀의 26 %TGF-β의 자극, TGF-β 치료 (그림 2C) 없이 0% 양성에 비해 후 감지 TGF-β/Smad3 transcriptional 활동 24 시간을 표시 하는 약만 GFP 식이 제시의 100%. 사용 하 여 아 데 노비 루스 기반 시 약 생물학 과정 동안 TGF-β/Smad3 transcriptional 활동을 조사, MDA-MB-231 셀 광고 CAGA12-Td-톰 2500 나 감염 되었고 분석 결과 치유 하는 상처를 받게. 감염 된 MDA-MB-231 세포 전시 일반 마이그레이션 동작 및 셀 5 ng/mL TGF-β 비-TGF-β 치료 세포 (그림 3A)에 비해 향상 된 상처 폐쇄 했다 치료. 특히, 약 62% 상처 지역에 있는 세포는 TGF-β 치료 (그림3B) 후 비 상처 영역 (32%)에서 관찰 보다 상당히 더 높은 양의 TGF-β/Smad3 transcriptional 활동 제시. 따라서, 아 데 노 바이러스 기반 시 약 체 외에서살아있는 단일 세포에서 TGF-β 신호 통로의 이미징에 대 한 그들의 응용 프로그램 확인.
TGF-β 신호 이미징 vivo에서 라이브
광고 CAGA12-뤽 기자의 감도 첫 번째 테스트 했다 생체 외에서 TGF-β의 자극 및 TGF-β 억제제의 존재에 대 한 응답. 감염 된 MDA-MB-231 셀 1 ng/mL TGF-β와 자극 되었다, luciferase 기자 활동을 1,200-fold 기초 치료 MDA-MB-231 수준에 비해 증가. 이 응답은 눈에 띄게 TGF-β 억제제 (그림 4A)의 12 µ g/mL에 의해 차단 됩니다. 광고 CAGA12-루크 시 약 이후에 유 방 종양 orthotopic 이식 동물 모델에서 테스트를 했다. 제어 및 TGF-β 억제제 그룹 시연된 비슷한 luciferase 기자 활동 치료 전에 치료. 그러나, 컨트롤 그룹에 대 한 luciferase 신호 변화 하지 않았다 PBS 치료 후, 마우스 약 3 신호 감소 (그림 4B, 4c)를 보여주었다 TGF-β 억제제로 치료 하는 반면. 이러한 결과의 TGF-β 신호 활동에서 vivo에서 동물 희생을 위한 필요 없이 라이브 실시간 모니터링에 대 한 가능성을 보여 줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57926/57926fig1v2.jpg"> 그림 1입니다. 아 데 노비 루스 기반 시 약의 나의 결정. MDA-MB-231 셀 광고-CMV-Td-톰 다른 나에 감염 되었고 12 우물 격판덮개로 시드. 감염 후 24 h, 셀 고정 하 고 핵 Hoechst에 의해 스테인드. (A) 이미지 Td-톰 긍정적인 세포 (빨간색)와 핵 (파란색)을 시각화 하 게 되었고 ImageJ로 계량. (B) 비율의 Td-톰 긍정적인 세포. (C) Td-톰 픽셀 강도/셀 배경으로 정규화. 이러한 수치는 최소 3 독립적인 실험의 대표. 표시 된 데이터는 triplicates ± sd. 규모의 바 = 50 µ m (200 X). <a href="/files/ftp_upload/57926/57926fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57926/57926fig2.jpg"> 그림 2입니다. 듀얼에 대 한 단일 셀 이미징. 광고-CMV-GFP 와 나 (2500)에서 광고 CAGA12-Td-톰 감염 그리고 12 우물 격판덮개로 시드 MDA-MB-231 셀 듀얼 했다. 24 시간 후 감염, 세포 치료 5 ng/mL TGF-β의 유무에 관계 없이. (A) 치료 후 h 24, GFP 긍정적인 (녹색) 및 Td-톰 긍정적인 (빨간) 세포를 시각화 하는 이미지가 포함 된 셀 라이브 했다. 셀 다음 고정 하 고 정량화에 대 한 Hoechst 여 핵 스테인드. (B) 이미지 시각화 GFP 긍정적인 (녹색), Td-톰 긍정적인 (빨간) 세포와 핵 (파란색)을 찍은 사진. (C)는 GFP 또는 Td-톰 긍정적인 세포 ImageJ로 계량 했다 고 긍정적인 세포의 비율을 계산 했다. 이러한 수치는 최소 3 독립적인 실험의 대표. 표시 된 데이터는 triplicates ± sd. 통계 의미 스튜던트 t-검정에 의해 결정 되었다 (* * * p ≤0.0001). 눈금 막대 50 µ m (200 X)를 =. <a href="/files/ftp_upload/57926/57926fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57926/57926fig3.jpg"> 그림 3입니다. 세포 이동 촉진 라이브 셀 TGF-β 신호. MDA-MB-231 셀 광고 CAGA12-Td-톰 나 (2500)에서 감염 되었고 6 웰 플레이트에 시드. 감염 후 24 h, 세포를 상처를 만드는 P200 피 펫 팁을 사용 하 여 긁힌 했다 및 미디어 교체 없이 5 ng/mL TGF-β. 또 다른 24 h 후 셀 고정 하 고 시각적 표현을 위한 Hoechst 여 핵 스테인드. (A) 상처 폐쇄, 규모의 명암 단계 바 = 100 µ m (X 100). (B) Td-톰 긍정적인 (빨간) 세포와 핵 (파란색). 눈금 막대 50 µ m (200 X) = (C) Td-톰 긍정적인 세포 ImageJ로 계량 했다 고 긍정적인 세포의 비율 계산 했습니다. 이러한 수치는 최소 3 독립적인 실험의 대표. 표시 된 데이터는 triplicates ± sd. 통계 의미 스튜던트 t-검정에 의해 결정 되었다 (* * * p ≤0.0001). <a href="/files/ftp_upload/57926/57926fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57926/57926fig4.jpg"> 그림 4입니다. Vivo에서 TGF-β 신호 영상 라이브. (A) MDA-MB-231 세포 감염 되었다 광고 CAGA12-루크 고 다음 24 h에 대 한 96 웰 플레이트에 시드. 그 후, 세포 치료 없이 1 ng/mL TGF-β는 존재 또는 부재에 12 µ g/mL TGF-β 억제제의 하룻밤. 전체 세포 lysate luciferase 활동을 기반으로 측정 했다. Luciferase 활동 유도 치료 제어 표준화의 배도 제시 했다. 표시 된 데이터는 triplicates ± sd (B). MDA-MB-231 세포 감염 되었다 광고 CAGA12-루크 이식 하기 전에 24 시간. 셀은 SCID 마우스의 양쪽에서 유 방 지방 패드에 이식 했다. 72 h 후, 이미징 IVIS (PBS 제어 그룹) 및 50 µ g/종양 TGF-β 억제제 치료 그룹에 대 한 24 시간 처리 전후에 수행 되었다. (C) 광자 플럭스 생활 이미지 소프트웨어 계량 했다. 표시 된 데이터는 각 치료 그룹 (n = 12) ± sd. 통계 의미 스튜던트 t-검정에 의해 결정 되었다 (* * p ≤0.01 * * * p ≤0.0001). p/s 참조 광자/미 <a href="/files/ftp_upload/57926/57926fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of the TGF-	Î²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System at JoVE.com

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

여기, 우리는 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 하는 TGF-β/Smad3 신호 활동의 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜을 제시. 이 시스템 실시간 transcriptional 활동을 추적 하 고 두 단일 세포에 생체 외에서 그리고 살아있는 동물에 적용 될 수 있다모델.

라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

live-cell-imaging-tgf-smad3-signaling-pathway-vitro-vivo-using-an

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.3K 조회수.  University of Melbourne. 여기, 우리는 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 하는 TGF-β/Smad3 신호 활동의 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜을 제시. 이 시스템 실시간 transcriptional 활동을 추적 하 고 두 단일 세포에 생체 외에서 그리고 살아있는 동물에 적용 될 수 있다모델.

비디오: Live Cell Imaging of the TGF-	β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

연구

의학

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

면역학 및 감염병학

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of TGF-&#946; signaling can lead to breast cancer. TGF-&#946; elicits its effects on proliferation and differentiation via specific cell surface TGF-&#946; type I and type II receptors (i.e., T&#946;RI and T&#946;RII) that contain an intrinsic serine/threonine kinase domain. Upon TGF-&#946;-induced heteromeric complex formation, activated T&#946;RI elicits intracellular signaling by phosphorylating SMAD2 and SMAD3. These activated SMADs form heteromeric complexes with SMAD4 to regulate specific target genes, including plasminogen activation inhibitor 1 (PAI-1, encoded by the SERPINE1 gene). The induction of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) allows epithelial cancer cells at the primary site or during colonization at distant sites to gain an invasive phenotype and drive tumor progression. TGF-&#946; acts as a potent inducer of breast cancer invasion by driving EMT. Here, we describe systematic methods to investigate TGF-&#946; signaling and EMT responses using premalignant human MCF10A-RAS (M2) cells and mouse NMuMG epithelial cells as examples. We describe methods to determine TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation by Western blotting, SMAD3/SMAD4-dependent transcriptional activity using luciferase reporter activity and SERPINE1 target gene expression by quantitative real-time-polymerase chain reaction (qRT-PCR). In addition, methods are described to examine TGF-&#946;-induced EMT by measuring changes in morphology, epithelial and mesenchymal marker expression, filamentous actin staining and immunofluorescence staining of E-cadherin. Two selective small molecule TGF-&#946; receptor kinase inhibitors, GW788388 and SB431542, were used to block TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation, target genes and changes in EMT marker expression. Moreover, we describe the transdifferentiation of mesenchymal breast Py2T murine epithelial tumor cells into adipocytes. Methods to examine TGF-&#946;-induced signaling and EMT in breast cancer may contribute to new therapeutic approaches for breast cancer.

We describe a systematic workflow to investigate TGF-&#946; signaling and TGF-&#946;-induced EMT by studying the protein and gene expression involved in this signaling pathway. The methods include Western blotting, a luciferase reporter assay, qPCR, and immunofluorescence staining.

유방암과 정상 세포에서 TGF β 신호 및 TGF β 유도 된 상피 - 중간 엽 전환 연구

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

암 연구학

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and homeostasis of the vasculature system Therefore, deregulation in this signaling pathway results in severe vascular pathologies, such as pulmonary artery hypertension, hereditary hemorrhagic telangiectasia, and atherosclerosis. Endothelial cells (ECs), as the innermost layer of blood vessels, are constantly exposed to fluid shear stress (SS). Abnormal patterns of fluid SS have been shown to enhance TGF&#946;/BMP signaling, which, together with other stimuli, induce atherogenesis. In relation to this, atheroprone, low laminar SS was found to enhance TGF&#946;/BMP signaling while atheroprotective, high laminar SS, diminishes this signaling. To efficiently analyze the activation of these pathways, we designed a workflow to investigate the formation of transcription factor complexes under low laminar SS and high laminar SS conditions using a commercially available pneumatic pump system and proximity ligation assay (PLA).
Active TGF&#946;/BMP-signaling requires the formation of trimeric SMAD complexes consisting of two regulatory SMADs (R-SMAD); SMAD2/3 and SMAD1/5/8 for TGF&#946; and BMP signaling, respectively) with a common mediator SMAD (co-SMAD; SMAD4). Using PLA targeting different subunits of the trimeric SMAD-complex, i.e., either R-SMAD/co-SMAD or R-SMAD/R-SMAD, the formation of active SMAD transcription factor complexes can be measured quantitatively and spatially using fluorescence microscopy.
The usage of flow slides with 6 small parallel channels, that can be connected in series, allows for the investigation of the transcription factor complex formation and inclusion of necessary controls. 
The workflow explained here can be easily adapted for studies targeting the proximity of SMADs to other transcription factors or to transcription factor complexes other than SMADs, in different fluid SS conditions. The workflow presented here shows a quick and effective way to study the fluid SS induced TGF&#946;/BMP signaling in ECs, both quantitatively and spatially.

Here, we establish a protocol to simultaneously visualize and analyze multiple SMAD complexes using proximity ligation assay (PLA) in endothelial cells exposed to pathological and physiological fluid shear stress conditions.

근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 TGFβ/BMP/SMAD 신호의 시각화 및 정량화

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

생화학

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

교양 차 마우스 배아 섬유아 세포의 신호 분자의 아데노 바이러스 - 매개 유전자 제거

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

생물학

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

생체공학

An Efficient Method for Adenovirus Production

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types and organs. However, recombinant adenoviral technology is laborious, time-consuming, and expensive. Here, we present an improved protocol using the pAdEasy system to obtain purified adenoviral particles that can induce a strong green fluorescent protein (GFP) expression in transduced cells. The advantages of this improved method are faster preparation and decreased production cost compared to the original method developed by Bert Vogelstein. The main steps of the adenoviral technology are: (1) the recombination of pAdTrack-GFP with the pAdEasy-1 plasmid in BJ5183 bacteria; (2) the packaging of the adenoviral particles; (3) the amplification of the adenovirus in AD293 cells; (4) the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium; and (5) the viral titration and functional testing of the adenovirus. The improvements to the original method consist of (i) the recombination in BJ5183-containing pAdEasy-1 by chemical transformation of bacteria; (ii) the selection of recombinant clones by &#8220;negative&#8221; and &#8220;positive&#8221; PCR; (iii) the transfection of AD293 cells using the K2 transfection system for adenoviral packaging; (iv) the precipitation with ammonium sulfate of the viral particles released by AD293 cells in cell culture medium; and (v) the purification of the virus by one-step cesium chloride discontinuous gradient ultracentrifugation. A strong expression of the gene of interest (in this case, GFP) was obtained in different types of transduced cells (such as hepatocytes, endothelial cells) from various sources (human, bovine, murine). Adenoviral-mediated gene transfer represents one of the main tools for developing modern gene therapies.

Here, we present a protocol for adenovirus production using the pAdEasy system. The technology includes the recombination of the pAdTrack and pAdEasy-1 plasmids, the adenovirus packaging and amplification, the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium, the viral titration, and the functional testing of the adenovirus.

아데노바이러스 생산을 위한 효율적인 방법

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

차 쥐 신생아 심근 라이브 셀 이미징은 아데노 바이러스 다음과 렌티 바이러스 형질 도입은 공 초점 현미경 디스크를 회전시키는 사용

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell cytoskeletal structures. This involves the assembly-disassembly of higher-order macromolecular structures at a given time and location, a process that is particularly sensitive to perturbations caused by overexpression of proteins. Methods that can preserve protein homeostasis and maintain near-to-normal cellular morphology are highly desirable to determine the functional contribution of a protein of interest in a wide range of cellular processes. Transient depletion-rescue experiments based on RNA interference are powerful approaches to analyze protein functions and structural requirements. However, reintroduction of the target protein with minimum deviation from its physiological level is a real challenge. Here we describe a method termed adenofection that was developed to study the role of molecular chaperones and partners in the normal operation of dividing cells and the relationship with actin remodeling. HeLa cells were depleted of BAG3 with siRNA duplexes targeting the 3&#39;UTR region. GFP-tagged BAG3 proteins were reintroduced simultaneously into &#62;75% of the cells using recombinant adenoviruses coupled to transfection reagents. Adenofection enabled to express BAG3-GFP proteins at near physiological levels in HeLa cells depleted of BAG3, in the absence of a stress response. No effect was observed on the levels of endogenous Heat Shock Protein chaperones, the main stress-inducible regulators of protein homeostasis. Furthermore, by adding baculoviruses driving the expression of fluorescent markers at the time of cell transduction-transfection, we could dissect mitotic cell dynamics by time-lapse microscopic analyses with minimum perturbation of normal mitotic progression. Adenofection is applicable also to hard-to-infect mouse cells, and suitable for functional analyses of myoblast differentiation into myotubes. Thus adenofection provides a versatile method to perform structure-function analyses of proteins involved in sensitive biological processes that rely on higher-order cytoskeletal dynamics.

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. In vivo cardiac-specific gene delivery is commonly achieved by either systemic or local delivery. Systemic injection via tail vein is easy and efficient in manipulating cardiac gene expression by using recombinant adeno-associated virus 9 (AAV9). However, this method requires a relatively high amount of vector for efficient transduction, and may result in nontarget organ gene transduction. Here, we describe a simple, efficient, and time-saving method of intramyocardial injection for in vivo cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia (without ventilation), the pectoral major and minor muscles were bluntly dissected, and the mouse heart was quickly exposed by manual externalization through a small incision at the fourth intercostal space. Subsequently, adenovirus encoding luciferase (Luc) and vitamin D receptor (VDR), or short hairpin RNA (shRNA) targeting VDR, was injected with a Hamilton syringe into the myocardium. Subsequent in vivo imaging demonstrated that luciferase was successfully overexpressed specifically in the heart. Moreover, Western blot analysis confirmed the successful overexpression or silencing of VDR in the mouse heart. Once mastered, this technique can be used for gene manipulation, as well as injection of cells or other materials such as nanogels in the mouse heart.