עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי לבריאות, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) H-JZ. TMBW הוא הנמען של פרס לתארים מתקדמים אוסטרליה מן הממשלה האוסטרלית ו אן הנדרסון הטען את המלגה הבריאות רוטרי אוסטרלי בשותף עם סיבובי של Templestowe, דיין לריפוי.

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי אוניברסיטת מלבורן חיה ועדת האתיקה.
הערה: פרוטוקול רצף, בנייה, דור עבור adenoviral המומנט pCMV-Td-עד תום, pAd-CMV-GFP ו p-לוק12לספירה-CAGA/Td-טום כבר שתואר לעיל11,12, 13. כל כיווני זמינים מסחרית.
1. וירוס כייל נוגדנים נחישות שימוש במינון 50%-ראגנטים זיהומיות (TCID50)
<ol><li>להכין 1 x 106 תאים HEK293A 10 מ"ל של DMEM + 10% FBS מדיה.</li>
	<li>זרע µL 100 של השעיה תא לתוך כל טוב של צלחת תרבות תא 96-ובכן שטוח התחתונה.</li>
	<li>להכין 1 מ"ל של בטחונות לדילול המניות וירוס שלם בינוני. להוסיף µL 11 של וירוס מדולל כל טוב של עמודה 1.</li>
	<li>ביצוע דילולים 10-fold טורי ישירות בצלחת טוב 96 על-ידי ערבוב µL 11 של וירוס מדולל עם 100 µL תא השעיה עד לדילול הסופי של 1 x1012 מתמלאת. למרות תאים שאינם מחסידי בשלב זה, מספר התאים מועברים בין בארות נשאר קבוע.</li>
	<li>פיפטה 11 µL של כל דילול לתוך כל עמודה החל הדילול הגבוהה של 104. להחליף טיפים פיפטה כל דילול להגבלת צולבות על נגיפים.</li>
	<li>הוסף µL 11 של מדיה מווירוסים מלאה כדי עמודה 12 כפקד שלילי.</li>
	<li>תקופת דגירה צלחת של 7-10 ימים ב 37 ° C עם 10% CO2.</li>
	<li>באמצעות מיקרוסקופ, ציון מספר בארות בכל עמודה מציג סימנים של אפקטים cytopathic או ציטוטוקסיות. שקול חיובי טוב אם יש סימן לזיהום קיים.</li>
	<li>לחשב את השבר של בארות חיובי עבור כל דילול באמצעות את ריד, Muench השיטה הסטטיסטית (1938)14.</li>
	<li>לחשב את המרחק פרופורציונלית (PD) באמצעות: (A-50)/(A-B), כאשר A הוא אחוז התגובה לעיל או שווה ל- 50% ו- B הוא התגובה אחוז מתחת ל 50%.</li>
	<li>לחשב באמצעות TCID50 : 10X-PD, כאשר X הוא הדילול נותן מענה גדול מ-50%.</li>
	<li>לחשב כייל ויראלי מלהשתמש הבאות: (0.011 x TCID50) PFU/mL</li>
</ol>2. אדנו MOI נחישות
<ol><li>זרע 1.0-1.5 x 10 תאים5 מד א-MB-231 עם 500 μL DMEM תרבות המדיה המכילה 5% FBS ב כל טוב של 12 טוב צלחת (35% תא confluency, וולס 6 סה כ).</li>
	<li>לחשב את נפחי Ad-CMV-Td-טום המניות הדרושות 0, 250, 500, 2500, 5000 MOI באמצעות בעקבות הנוסחה: MOI = (נפח [μL] x PFU/μL) / מספר של תאים. Ad-CMV-Td-טום עם כייל עונה 1 פרק 1010 (PFU/mL), אמצעי האחסון להידבקות בווירוס MOIs הנדרשים הם 0, 3.75, 7.5, 37.5 ו- 75 μL בהתאמה.</li>
	<li>להדביק את התאים עם נפחי Ad-CMV-Td-טום סעיף 2.2 מחושב על ידי ישירות pipetting מניות ויראלי לתוך הבארות עם ערבוב יסודי.</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>מסיר את המדיה מן הבארות, לתקן מיד את התאים עם 500 μL של 10% פורמלין במשך 5 דקות.</li>
	<li>האחות של פורמלין מבארות ולשטוף וולס עם μL 500 ל- PBS פעם אחת.</li>
	<li>כתם גרעין התא עם 500 μL של פתרון Hoechst במשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את הפתרון Hoechst ולשטוף הבארות עם 500 μL PBS 3 פעמים.</li>
	<li>התמונה החלבון Td-עגבניה, גרעין התא אות באמצעות 200 X הגדלה על מיקרוסקופ זריחה. לרגש חלבון Td-עגבניות-554 nm ו לצבוע Hoechst-352 ננומטר.</li>
	<li>ניתוח תמונות באמצעות ImageJ כדי לקבוע את העבודה ש-MOI הדרושים עבור 100% זיהום של עגבניות Td-15.</li>
</ol>3. התמרה חושית כפול-אדנו בתאים יחיד בשידור חי
<ol><li>זרע 1.0-1.5 x 10 תאים5 מד א-MB-231 עם 500 μL DMEM תרבות המדיה המכילה 5% FBS ב כל טוב של 12 טוב צלחת (35% תא confluency, וולס 2 סה כ).</li>
	<li>להדביק תאים עם 75 μL של Ad-CMV-GFP (כייל נוגדנים = 5 x 109 PFU/mL) ו- 7.5 μL של Ad-CAGA12-Td-טום (כייל נוגדנים = 5 x 1010 PFU/mL) כדי להשיג 2,500 למשרד הפנים, אשר ניתן להשיג 100% זיהום חיוביות.</li>
	<li>יטפל בתאים עם או בלי μL 0.25 של TGF-β לכל טוב (10 mg/mL במלאי, 5 ng/μL כמו הריכוז הסופי) מיד לאחר אדנו זיהום.</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>התמונה תאים חיים עם שלב ניגודיות פלורסצנטיות מיקרוסקופ. לרגש GFP-470 nm וחלבון Td-עגבניות-554 ננומטר.</li>
	<li>לתקן תאים, כתם גרעין התא כפי שמתואר צעדים 1.6 - 1.9.</li>
	<li>התמונה החלבון Td-עגבניות ואת Hoechst כתם באמצעות מיקרוסקופ זריחה. לרגש את צבען Hoechst-352 ננומטר.</li>
	<li>שימוש ImageJ, לחשב שאחוז חיובי GFP ו- Td-עגבניות תאים15.</li>
</ol>4. איתות התא יחידה בשידור חי, ריפוי פצעים Assay
<ol><li>זרע 4-5 x 10 תאים5 מד א-MB-231 1 מ ל DMEM תרבות המדיה המכילה 5% FBS ב כל טוב של 6 טוב צלחת (50% תא confluency, וולס 2 סה כ).</li>
	<li>להדביק את התאים עם 22.5 μL של Ad-CAGA12-Td-טום (כייל נוגדנים = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500).</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>לגרד שני קווים מצטלבים על השכבה תא של מכל קידוח באמצעות טיפ פיפטה P200.</li>
	<li>מסיר את המדיה הישנה מבארות והחלף 2 מ"ל של טרי 5% FBS מדיה עם או בלי μL 0.5 של TGF-β לכל טוב (10 mg/mL במלאי, 5 ng/μL כמו ריכוז סופי).</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 5 דקות, תמונות של אזורים שנבחרו הפצע באמצעות 100 X הגדלה במיקרוסקופ ניגוד שלב.</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>קח תמונות של סגירת הפצע על האזורים כמו בעבר.</li>
	<li>לתקן את התאים, כתם גרעין התא, כפי שמתואר צעדים 1.6 - 1.9 והמחש Td-עגבניות אות אזור הפצע ואזור ללא פציעה באמצעות 200 X הגדלה על מיקרוסקופ זריחה.</li>
	<li>לכמת את אחוז תאים חיוביים Td-עגבניות הפצע ואזור ללא פציעה באמצעות תוכנת ImageJ15.</li>
</ol>5. במבחנה לוציפראז Assay
<ol><li>להכין השעיה תא של 3-5 x 10 תאים4 מד א-MB-231 1 מ"ל של המדיה DMEM המכילה 5% FBS.</li>
	<li>להדביק תאים הבולם עם 2.5 μL של Ad-CAGA12- לוק (כייל נוגדנים = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500).</li>
	<li>זרע התאים הנגועים 96. ובכן צלחת-µL תאים/100 3000/טוב....</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>להסיר את המדיה הישנה מבארות ולהחליף עם 100 µL של 5% טרי FBS מדיה עם או בלי μL 0.1 של TGF-β לכל טוב (1 mg/mL במלאי, 1 ng/μL כמו הריכוז הסופי), נוכחות או היעדרות של 0.17 μL של TGF-β מעכב לכל טוב (7 mg/mL במלאי 12 ng/μL כמו ריכוז סופי) (לא פורסם הרומן TGF-β ליגנד מלכודת חלבון, צ'ן. et al., עבודה).</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>להפשיר את המצע מערכת assay לוציפראז והכן 1 x תא תרבות פירוק ריאגנט במים מזוקקים כפול (DDW).</li>
	<li>להסיר מדיה מן הבארות 96 ואת lyse וולס עם μL 50 1 x תא תרבות פירוק מאגר על קרח באמצעות של תפקודי לב / נשימה עם עצבנות עדין למשך 30 דקות.</li>
	<li>להעביר 30 μL של lysate מכל קידוח לתוך צלחת לוציפראז אטום ולאפשר את הצלחת לחמם לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>על תוכנת luminometer, ליצור פרוטוקול חדש. בחרו ' מזרק 1 עם מדידות לפני ואחרי הזרקת. לקבוע מידות לפני הזרקת-1 s עבור אינטגרציה בזמןוהן עיכוב במדידה . עבור לאחר הזרקת המדידה, מוגדר נפח הזרקה µL 40 לעיכוב מדידה של 1 s לאחר הזרקת ו- 5 s זמן אינטגרציה. לאשר את ההגדרות על-ידי בחירת אישור.</li>
	<li>למקם את צינור מזרק DDW ולחץ על לחצן מזרק 1 תחת ההגדרות ראש הממשלה כדי לנקות את הצינור מזרק לפני השימוש. הבא להסיר את הצינור מזרק DDW והמקום באוויר ואחריו עוד שני מספרים ראשוניים של מזרק 1 ריקון כל פתרון באמצעות הרכבת התחתית. מקם את הצינור מזרק לתוך המצע גחלילית, שוב ראש הממשלה פעמיים כדי להכין את המצע.</li>
	<li>למקם את הצלחת לוציפראז אטום עם הדוגמיות luminometer ולבחור אפשרויות על התוכנה. לסמן את הבארות עניין ' ולחץ על ' החל'. הקש התחל למדוד לוציפראז אות.</li>
	<li>לאחר מדידות מלאה, להסיר ולשטוף את הצלחת עם מים. לשחזר את כל המצע הנותרים לתוך הצינור מזרק על ידי הנחת הצינור לתוך אוויר ואת ראש הממשלה מזרק 1 בחזרה לתוך צינור המצע גחלילית. למקם את צינור מזרק DDW ולבצע עוד שני מספרים ראשוניים לנקות את הצינור מזרק של כל מצע הנותרים.</li>
</ol>6. תא לקראת חיים איתות דימות In Vivo
<ol><li>48 h לפני ההשתלה הגידול, זרע 2-3 x 10 תאים6 מד א-MB-231 לתוך 175 ס' ' מ2 מבחנות (10 מבחנות סה כ). התרבות התאים ב- 20 מ של המדיה DMEM המכילה 5% FBS ב 37 מעלות צלזיוס, 10% CO2.</li>
	<li>24 שעות לאחר מכן, להוסיף 300 μL של Ad-CAGA12- לוק (כייל נוגדנים = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500) לתוך כל הבקבוק. לשמור תאים תרבות אחרת במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>ביום של ההשתלה, מסיר את המדיה הישנה ולשטוף את התאים אדנו נגוע פעם אחת עם 20 מ של PBS, pH 7.4. להוסיף 2 מ של 0.05% טריפסין-EDTA לתוך הבקבוק, לנער את הבקבוק מעט כדי לאפשר טריפסין לכסות את כל השטח את הבקבוק. הניחו את הבקבוק ב כדי החממה 37 ° C, 10% CO2 למשך 3 דקות.</li>
	<li>להרוות את טריפסין על-ידי הוספת 8 מ של DMEM המכילים FBS מדיה לתוך מבחנות. העברת כל המתלים תא לתוך בקבוק ריאגנט זכוכית.</li>
	<li>לספור את מספר הנייד באמצעות hemocytometer והעבר 4.8 x 107 תאים שני צינורות צנטריפוגה 50 מ.</li>
	<li>Centrifuge התאים ב 400 g x עבור 5 דקות ב RT כדי להסיר טריפסין resuspend בתאים 720 מ"ל של מדיה FBS-DMEM טריים.</li>
	<li>להעביר את המתלים תא לתוך צינור סטרילי 5 מ"ל ולהוסיף 160 μL Matrigel (matrigel סה כ 10% השעיה).</li>
	<li>לשמור תאים על הקרח עד ההשרשה.</li>
</ol>7. Orthotopic-השרשה
<ol><li>שוקל 12 SCID עכברים ולהקצות באופן אקראי עכברים קבוצות בקרה וטיפול (6 עכברים/קבוצה).</li>
	<li>ביצוע ההשתלה ביו-ארון סטרילי כדי לשמור על סביבה נקייה. להרדים את העכבר באמצעות איזופלוריין 2.5-4.5% שיעור זרימת החמצן של המקום L לדקה 1 העכבר על משטח חום, לוותר על טיפה של שימון העין משחה על שתי העיניים כדי למנוע נזק הקרנית. לתקן את העכבר על משטח חום במצב פרקדן בעת שמירה על הרדמה על ידי הצבת את החוטם לתוך קונוס האף מחובר לאיזופלוריין.</li>
	<li>לאשר את ההצלחה של הרדמה על ידי חוסר התגובה שאורך קמצוץ. להפחית איזופלוריין ל מנה תחזוקה של 1.5-2.5% חמצן 1 ליטר/דקה על התזכורת של השרשה.</li>
	<li>לנקות את העור מהפטמה הרביעי משני הצדדים עד האמצע באמצעות את ניקוי אוזניים? הטבלתי 80% אתנול.</li>
	<li>למצוא 4th החלב השמן משטח באמצעות מישוש וסוחטים כרית השומן לחשוף עוד יותר את הרקמה.</li>
	<li>מערבבים התליה תא היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. בעדינות תשאף 50 µL תערובת תא לתוך מזרק אינסולין 27G, מזריקים לתוך משטח שומן החלב משני הצדדים של העכבר.</li>
	<li>לאשר זריקה מוצלחת על ידי תחושת נפיחות של כרית השומן. לשחרר את הפנקס השמן בעדינות ומניחים את העכבר בחזרה לתוך הכלוב.</li>
	<li>השאר את הכלובים על משטח חום במשך לפחות 30 דקות לאפשר העכברים לקבל הכרה ולאחר מכן מקם את הכלובים בחזרה בחדר המעצר למשך 3 ימים.</li>
</ol>8. IVIS הדמיה
<ol><li>פתח את התוכנה תמונה חיה .</li>
	<li>לאתחל את המערכת IVIS באמצעות לחיצה על הלחצן לאתחל IVIS מערכת בלוח הבקרה. המתן עד השלט החום הופך לירוק.</li>
	<li>בחר מצב הדמיה Luminescent בלוח הבקרה.</li>
	<li>הפעל הרדמה איזופלוריין קאמרית ומערכת IVIS.</li>
	<li>להרדים את העכברים באמצעות איזופלוריין 2.5-4.5% חמצן 1 ליטר/דקה. ברגע מרדימים, לקבוע איזופלוריין 1.5-2.5% לצורך תחזוקה. להזריק 150 מ"ג/ק"ג משקל גוף של D-luciferin לתוך עכברים בזריקה בקרום הבטן (i.p.).</li>
	<li>מיד להעביר עכברים לתוך המערכת IVIS, למקם אותם על הפלטפורמה הדמיה מבוקרי טמפרטורה ולמקם את האף שלהם לתוך קונוס האף.</li>
	<li>לחץ על כפתור ההתקנה רצף בלוח הבקרה ובחר Binning בינונית.</li>
	<li>להגדיר את זמן החשיפה הדמיה כדלקמן: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, ו- 120 ס' התחלה הדמיה כ 3 דקות אחרי הזריקה luciferin והמשך אל התמונה עד האות מתחיל לרדת (בדרך כלל זה לוקח בערך 20 דקות).</li>
	<li>להסיר את העכברים IVIS תוך שמירה על איזופלוריין באלחוש דרך קונוס האף, להתייחס העכברים עם 50 µL PBS או 50 µL TGF-β איתות מעכב (50 μg/גידול) באמצעות הזרקת אינטרה-הגידול.</li>
	<li>לשים העכברים בכלוב ולהשאיר אותן על משטח חום במשך לפחות 30 דקות. ואז למקם את הכלוב חזרה לחדר המעצר.</li>
	<li>חזור על IVIS הדמיה ההליך כמתואר לעיל ביום שלאחר הטיפול.</li>
</ol>9. ניתוח נתונים
<ol><li>פתח לשמור קבצי תמונה חיה תוכנה.</li>
	<li>למצוא המידע על התמונה באמצעות תצוגה | נתוני תמונה.</li>
	<li>בחר תמונות שצולמו בנקודת זמן דומה עם חשיפה זמנית. לטעון תמונות כקבוצה.</li>
	<li>בטל את סימון התיבה בודדים בתוך התמונה להתאים לנרמל את העוצמה.</li>
	<li>בחרו מצב הפוטון לנתח את העוצמה. לכמת את עוצמת האות על-ידי בחירת לחצן אזור של הריבית (ROI) רועי כלים.</li>
	<li>גררו את העיגול רועי האזור המכיל את האות ביולומנאסן ולחץ על לחצן אמצעי כדי לרכוש את עוצמת האות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Massague, J., Like, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+receptors+for+type+beta+transforming+growth+factor.+Ligand+binding+and+affinity+labeling+in+human+and+rodent+cell+lines.">Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).</li><li>Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+import+function+of+Smad2+is+masked+by+SARA+and+unmasked+by+TGFbeta-dependent+phosphorylation.">The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).</li><li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+signaling+in+context.">TGFbeta signaling in context.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).</li><li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad+transcription+factors.">Smad transcription factors.</a> Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).</li><li>Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transforming+growth+factor+beta+in+human+disease.">Role of transforming growth factor beta in human disease.</a> The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).</li><li>Zhu, H. J., Burgess, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transforming+growth+factor-beta+signaling.">Regulation of transforming growth factor-beta signaling.</a> Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).</li><li>Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;+in+Cancer.">TGF&#946; in Cancer.</a> Cell. 134, 215-230 (2008).</li><li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+live+cell+TGF-beta+signaling+imaging:+breast+cancer+cell+motility+and+migration+is+driven+by+sub-populations+of+cells+with+dynamic+TGF-beta-Smad3+activity.">Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity.</a> Molecular cancer. 14, 50 (2015).</li><li>Clarke, D. C., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+quantitative+nature+of+TGF-beta/Smad+signaling.">Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling.</a> Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).</li><li>Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+single-molecule+study+of+TGF-beta/Smad+signaling.">Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).</li><li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+reagents+for+improved+in+vitro+and+in+vivo+examination+of+TGF-beta+signalling.">New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling.</a> Growth factors. 29, 211-218 (2011).</li><li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene.">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).</li><li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Stat3+and+Smad7+to+restore+TGF-beta+cytostatic+regulation+of+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo.</a> Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Method+of+Estimating+Fifty+Per+Cent+Endpoints.">A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Jun+inhibits+transforming+growth+factor+beta-mediated+transcription+by+repressing+Smad3+transcriptional+activity.">c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).</li><li>Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta-induced+nuclear+localization+of+Smad2+and+Smad3+in+Smad4+null+cancer+cell+lines.">TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines.</a> Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).</li><li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery:+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes &amp; Diseases. 4, 43-63 (2017).</li><li>Wang, I. I., Huang, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+technology+for+gene+manipulation+and+functional+studies.">Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies.</a> Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).</li><li>Kochanek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+adenoviral+vector:+Replacement+of+all+viral+coding+sequences+with+28+kb+of+DNA+independently+expressing+both+full-length+dystrophin+and+beta-galactosidase.">A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).</li><li>Wang, Q., Finer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-generation+adenovirus+vectors.">Second-generation adenovirus vectors.</a> Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).</li><li>Durham, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+replication-defective+adenoviral+recombinants+in+dissociated+cultures+of+nervous+tissue.">Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue.</a> Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).</li><li>MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+vector-mediated+gene+transfer+to+primitive+human+hematopoietic+progenitor+cells:+assessment+of+transduction+and+toxicity+in+long-term+culture.">Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture.</a> Blood. 96, 100-108 (2000).</li><li>Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+wild-type+contamination+in+a+recombinant+adenoviral+preparation+by+PCR.">Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR.</a> Biotechniques. 18, 444-447 (1995).</li><li>Choi, Y., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+vaccine+applications.">Viral vectors for vaccine applications.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).</li><li>de Cassan, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+potent+adjuvants+to+enhance+the+immunogenicity+and+protective+efficacy+of+protein+vaccines+can+be+overcome+by+prior+immunization+with+a+recombinant+adenovirus.">The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus.</a> Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).</li><li>Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+with+modified+fibers+for+altering+viral+tropism.">Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism.</a> Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).</li><li>Wickham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer+by+adenovirus+vectors+containing+chimeric+fiber+proteins.">Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins.</a> Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).</li><li>Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Virus vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+receptor+NR4A1+promotes+breast+cancer+invasion+and+metastasis+by+activating+TGF-beta+signalling.">Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling.</a> Nature communications. 5, 3388 (2014).</li></ol>

המחברים מדווחים שאין ניגודי אינטרסים.

פיתחנו שיטה כדי לאפשר הדמיה בזמן אמת של TGF-β/Smad3 איתות בתאים חיים יחיד. הרומן בשיטה זו בעבר זיהינו אוכלוסיה המשנה של תאים עם דינמי TGF-β/Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק שהיה משויך הפלישה משופר והעברה8. שיטה זו משפרת על מבחני המסורתי של TGF-β איתות, כגון שהכלים המערבי של זרחון Smad3 ו- TGF-β ממ?...

שינוי צורה של גורם גדילה β (TGF-β) הוא ציטוקין חיוני מעורבים בהתפתחות האדם כי אותות דרך heterodimeric קומפלקס המורכב מסוג II ו סוג אני קולטנים1. איגוד לסוג קולטן II תוצאות הגיוס, זרחון של סוג אני קולטן, אשר בתורו phosphorylates במורד הזרם Smad2/3 חלבונים2,3. אלה מופעלות Smad2/3 חלבונים לאגד Smad4, יוצרים קומפלקס translocates לתוך הגרעין ומסדיר שעתוק גנים4. בתנאים homeostatic TGF-β/Smad איתות בחוזקה מוסדר; עם זאת, מחלות רבות, מסלול איתות הוא deregulated, לעיתים קרובות overexpressed המוביל התקדמות של המחלה5,6,7. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי תגובת תאי TGF-β heterogenous, subpopulations של תאים פעילים TGF-β/Smad אחראים על תפקוד ביולוגי ב8,באופן תלוי-זמן9. ניתוח הסלולר הנפוצות של TGF-β/Smad איתות כרוך השימוש של מבחני קבוע נקודת הקצה לספק רק תמונה של פעילות תאית, לעיתים קרובות quantitate של אפקט ממוצע TGF-β/Smad10. שיטות אלו, עם זאת, לא במדויק ייצגו ההתנהגויות מולקולרית של TGF-β/Smad איתות במצב פיזיולוגי במהלך התקדמות המחלה. תמונה מבוססי ניתוח של תאים חיים ללכוד את הדינמיקה של הסלולר תהליכים ביולוגיים עם הבנה הן יכולות.
המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה תפוקה גבוהה רגיש של תא חי הדמיה של TGF-β/Smad איתות באמצעות ריאגנטים המבוסס על אדנו. כאן, אנחנו נגועים הקו התא סרטן השד אנושי מד א-MB-231 עם אדנו המבטאת את רצף מחייב מוטיב Smad3 CAGA, לוציפראז (לוק) או Td-עגבניות (Td-טום) מדווח. מערכות כתב adenoviral מספקות שיטה מהירה וזולה מבוא פלסמיד שיכול לגרום שיעור זיהום 100% של שורות תאים סרטן. מערכות כתב adenoviral גם הוחלו בהצלחה על שורות תאים שקשה transfect עם פלסמיד קונבנציונאלי11. ב פרוטוקול זה נתאר תהליך לא פולשנית הדירים להשגת תא חי הדמיה של מסלול איתות TGFβ/Smad הן vivo והן בתוך חוץ גופית.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>1881024</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C waterbath before use</td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Scientifix Life</td><td>FBS500-S</td><td>Heat inactivated before use</td></tr><tr><td>Recombinant Human TGF-&amp;beta;1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21</td><td>Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5117</td><td>Dilute in to PBS to make final concentration at 1 &amp;mu;L/mL</td></tr><tr><td>Luciferase Reporter Assay Kit</td><td>Promega</td><td>197897</td><td>Dilute 5x in PBS before use</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Promega</td><td>9100-002</td><td></td></tr><tr><td>Phase contrast fluorescence microscopy</td><td>OLYMPUS</td><td>IX50</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>VivoGl Luciferin</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III In Vivo Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Diltue to 0.05% (1x) in PBS</td></tr><tr><td>Cell Culture Lysis 5x Reagent</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Dilute to 1x in DDW</td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293A</td><td>ThermoFisher</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>PRKDC-SCID</td><td>Animal Resources Centre</td><td>SCIDF6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Zoetis</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Chem-supply</td><td>EA043-10L-P</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Night Time</td><td>Allergan</td><td>1750D</td><td>Lubricating Eye Ointment</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Composition&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (4 mM); NaHPO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;(16 mM); NaCl (0.12M)</td></tr><tr><td>FBS-DMEM&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>5% heat inactivated FBS; 10 &amp;mu;g/mL penicillin; 100 &amp;mu;g/mL streptomycin</td></tr></tbody></table>

live cell imaging of the tgf-	&beta;/smad3 signaling pathway in vitro and in vivo using an adenovirus reporter system

שינוי צורה של גורם גדילה איתות β (TGF-β) מסדיר תפקידים חשובים רבים הדרושים עבור הסלולר הומאוסטזיס, נפוץ overexpressed במחלות רבות, כולל סרטן. TGF-β הוא בחריפות בהפרות גרורות במהלך התקדמות סרטן בשלב מאוחר, הפעלת קבוצת משנה של תאים סרטניים נודדות ופולשני. השיטות הקיימות עבור ניתוח מסלול איתות להתמקד על הקצה של דגמים, אשר לעיתים קרובות מנסים למדוד איתות פוסט-הוק של אירוע ביולוגי, ואינם משקפים את אופי המחלה מתקדמת. . הנה, נדגים מסוים מערכת הכתב הרומן אדנו עבור מסלול איתות TGF-β/Smad3 שיכול לזהות הפעלת גנים ברמת השעתוק בתאים חיים. ניצול של הכתב Ad-CAGA12-Td-טום , ניתן להשיג שיעור זיהום 100% של מד א-MB-231 תאים בתוך 24 שעות בתוך חוץ גופית. השימוש של עיתונאי פלורסנט מאפשר הדמיה של תאים בודדים בשידור חי ב בזמן אמת עם זיהוי ישיר של תאים transcriptionally פעיל. גירוי של תאים נגועים עם TGF-β מציג רק תת-ערכה של תאים transcriptionally פעיל ומעורב תפקודים ביולוגיים ספציפיים. גישה זו מאפשרת ירידה לפרטים גבוהה ורגישות ברמה תא בודד כדי לשפר את ההבנה של תפקודים ביולוגיים הקשורים TGF-β איתות במבחנה. Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק ניתן גם דיווח ויוו ב בזמן אמת באמצעות היישום של Ad-CAGA12- לוק כתב. לספירה-CAGA12- לוק ניתן למדוד באופן זהה כקווים תא לוציפראז stably transfected המסורתי. יכול להיות מנותח באמצעות הדמיה IVIS המקובלת ונשאר להשגחה חי במהלך התקדמות הגידול, לספק תובנה ייחודית הדינמיקה של מסלול איתות TGF-β Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק של תאים מושתלים ויוו . פרוטוקול שלנו מתאר מערכת משלוח כתב יתרון המאפשר הדמיה תפוקה גבוהה מהירה של תא חי מסלולי איתות גם במבחנה וגם בתוך vivo. בשיטה זו ניתן להרחיב מגוון של התמונה לפי מבחני במתנה בגישה לשחזור והרגיש יסוד ביולוגיה ופיתוח טיפולית.

חיים תא בודד דימות in vitro
כדי להעריך באופן מדויק את ההפעלה של TGF-β/Smad איתות של תאים בודדים באמצעות אדנו מבוסס ריאגנטים, חשוב לברר קודם של האופטימלית הריבוי של זיהום (MOI) עבור כל קו תא. למשרד הפנים אופטימלית נקבע 100% של תאים הן חיוביות על זיהו...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of the TGF-	Î²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System at JoVE.com

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

כאן, אנו מציגים עבור תא חי הדמיה של TGF-β/Smad3 פעילות איתות באמצעות מערכת הכתב אדנו פרוטוקול. המערכת עוקבת אחר פעילות גנים ברמת השעתוק בזמן אמת, ניתן להחיל שני תאים בודדים במבחנה , החימודלים.

חיים תא הדמיה של TGF-β/Smad3 איתות לשביל במבחנה , In Vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

live-cell-imaging-tgf-smad3-signaling-pathway-vitro-vivo-using-an

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.3K Views.  University of Melbourne. כאן, אנו מציגים עבור תא חי הדמיה של TGF-β/Smad3 פעילות איתות באמצעות מערכת הכתב אדנו פרוטוקול. המערכת עוקבת אחר פעילות גנים ברמת השעתוק בזמן אמת, ניתן להחיל שני תאים בודדים במבחנה , החימודלים.

Video: Live Cell Imaging of the TGF-	β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

במצע כפולה vivo bioluminescent ההדמיה

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Medicine

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Immunology and Infection

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of TGF-&#946; signaling can lead to breast cancer. TGF-&#946; elicits its effects on proliferation and differentiation via specific cell surface TGF-&#946; type I and type II receptors (i.e., T&#946;RI and T&#946;RII) that contain an intrinsic serine/threonine kinase domain. Upon TGF-&#946;-induced heteromeric complex formation, activated T&#946;RI elicits intracellular signaling by phosphorylating SMAD2 and SMAD3. These activated SMADs form heteromeric complexes with SMAD4 to regulate specific target genes, including plasminogen activation inhibitor 1 (PAI-1, encoded by the SERPINE1 gene). The induction of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) allows epithelial cancer cells at the primary site or during colonization at distant sites to gain an invasive phenotype and drive tumor progression. TGF-&#946; acts as a potent inducer of breast cancer invasion by driving EMT. Here, we describe systematic methods to investigate TGF-&#946; signaling and EMT responses using premalignant human MCF10A-RAS (M2) cells and mouse NMuMG epithelial cells as examples. We describe methods to determine TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation by Western blotting, SMAD3/SMAD4-dependent transcriptional activity using luciferase reporter activity and SERPINE1 target gene expression by quantitative real-time-polymerase chain reaction (qRT-PCR). In addition, methods are described to examine TGF-&#946;-induced EMT by measuring changes in morphology, epithelial and mesenchymal marker expression, filamentous actin staining and immunofluorescence staining of E-cadherin. Two selective small molecule TGF-&#946; receptor kinase inhibitors, GW788388 and SB431542, were used to block TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation, target genes and changes in EMT marker expression. Moreover, we describe the transdifferentiation of mesenchymal breast Py2T murine epithelial tumor cells into adipocytes. Methods to examine TGF-&#946;-induced signaling and EMT in breast cancer may contribute to new therapeutic approaches for breast cancer.

We describe a systematic workflow to investigate TGF-&#946; signaling and TGF-&#946;-induced EMT by studying the protein and gene expression involved in this signaling pathway. The methods include Western blotting, a luciferase reporter assay, qPCR, and immunofluorescence staining.

לימוד TGF-β איתות ו TGF-β-induced אפיתל-ל-mesenchymal מעבר בסרטן השד ותאים נורמליים

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

ב Vivo שני צבעים 2-פוטון הדמיה של תאי כתב שתייגת גנטית בעור

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Bioengineering

An Efficient Method for Adenovirus Production

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types and organs. However, recombinant adenoviral technology is laborious, time-consuming, and expensive. Here, we present an improved protocol using the pAdEasy system to obtain purified adenoviral particles that can induce a strong green fluorescent protein (GFP) expression in transduced cells. The advantages of this improved method are faster preparation and decreased production cost compared to the original method developed by Bert Vogelstein. The main steps of the adenoviral technology are: (1) the recombination of pAdTrack-GFP with the pAdEasy-1 plasmid in BJ5183 bacteria; (2) the packaging of the adenoviral particles; (3) the amplification of the adenovirus in AD293 cells; (4) the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium; and (5) the viral titration and functional testing of the adenovirus. The improvements to the original method consist of (i) the recombination in BJ5183-containing pAdEasy-1 by chemical transformation of bacteria; (ii) the selection of recombinant clones by &#8220;negative&#8221; and &#8220;positive&#8221; PCR; (iii) the transfection of AD293 cells using the K2 transfection system for adenoviral packaging; (iv) the precipitation with ammonium sulfate of the viral particles released by AD293 cells in cell culture medium; and (v) the purification of the virus by one-step cesium chloride discontinuous gradient ultracentrifugation. A strong expression of the gene of interest (in this case, GFP) was obtained in different types of transduced cells (such as hepatocytes, endothelial cells) from various sources (human, bovine, murine). Adenoviral-mediated gene transfer represents one of the main tools for developing modern gene therapies.

Here, we present a protocol for adenovirus production using the pAdEasy system. The technology includes the recombination of the pAdTrack and pAdEasy-1 plasmids, the adenovirus packaging and amplification, the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium, the viral titration, and the functional testing of the adenovirus.

שיטה יעילה לייצור אדנווירוס

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has been responsible for over 242 million infections and more than 4.9 million deaths worldwide. Similar to other viruses, studying SARS-CoV-2 requires the use of experimental methods to detect the presence of virus in infected cells and/or in animal models. To overcome this limitation, we generated replication-competent recombinant (r)SARS-CoV-2 that expresses bioluminescent (nanoluciferase, Nluc) or fluorescent (Venus) proteins. These reporter-expressing rSARS-CoV-2 allow tracking viral infections in vitro and in vivo based on the expression of Nluc and Venus reporter genes. Here the study describes the use of rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus to detect and track SARS-CoV-2 infection in the previously described K18 human angiotensin-converting enzyme 2 (hACE2) transgenic mouse model of infection using in vivo imaging systems (IVIS). This rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus show rSARS-CoV-2/WT-like pathogenicity and viral replication in vivo. Importantly, Nluc and Venus expression allow us to directly track viral infections in vivo and ex vivo, in infected mice. These rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus represent an excellent option to study the biology of SARS-CoV-2 in vivo, to understand viral infection and associated COVID-19 disease, and to identify effective prophylactic and/or therapeutic treatments to combat SARS-CoV-2 infection.

This protocol describes the dynamics of viral infections using luciferase- and fluorescence-expressing recombinant (r)SARS-CoV-2 and an in vivo imaging systems (IVIS) in K18 hACE2 transgenic mice to overcome the need of secondary approaches required to study SARS-CoV-2 infections in vivo.

הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי בעכברים מהונדסים K18 hACE2 באמצעות דיווח-מבטא רקומביננטי SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable model for tracing tumor progression and angiogenesis simultaneously in a visual and sensitive manner. Bioluminescence imaging displays its unique superiority in living imaging due to its advantages of high sensitivity, strong specificity, and accurate measurement. Presented here is a protocol to establish a tumor-bearing mouse model by injecting a Renilla luciferase-labeled murine breast cancer cell line 4T1 into the transgenic mouse with angiogenesis-induced Firefly luciferase expression. This mouse model provides a valuable tool to simultaneously monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging in a single mouse. This model may be widely applied in anti-tumor drug screening and oncology research.

This protocol describes the establishment of a tumor-bearing mouse model to monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging.

הדמיה ביולומינסנציה כפולה של התקדמות הגידול ואנגיוגנזה

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

ההדמיה של תא חי של ראשוני cardiomyocytes ילודים החולדה בעקבות adenoviral וlentiviral התמרה באמצעות דיסק מסתובב confocal מיקרוסקופית

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Biology

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell cytoskeletal structures. This involves the assembly-disassembly of higher-order macromolecular structures at a given time and location, a process that is particularly sensitive to perturbations caused by overexpression of proteins. Methods that can preserve protein homeostasis and maintain near-to-normal cellular morphology are highly desirable to determine the functional contribution of a protein of interest in a wide range of cellular processes. Transient depletion-rescue experiments based on RNA interference are powerful approaches to analyze protein functions and structural requirements. However, reintroduction of the target protein with minimum deviation from its physiological level is a real challenge. Here we describe a method termed adenofection that was developed to study the role of molecular chaperones and partners in the normal operation of dividing cells and the relationship with actin remodeling. HeLa cells were depleted of BAG3 with siRNA duplexes targeting the 3&#39;UTR region. GFP-tagged BAG3 proteins were reintroduced simultaneously into &#62;75% of the cells using recombinant adenoviruses coupled to transfection reagents. Adenofection enabled to express BAG3-GFP proteins at near physiological levels in HeLa cells depleted of BAG3, in the absence of a stress response. No effect was observed on the levels of endogenous Heat Shock Protein chaperones, the main stress-inducible regulators of protein homeostasis. Furthermore, by adding baculoviruses driving the expression of fluorescent markers at the time of cell transduction-transfection, we could dissect mitotic cell dynamics by time-lapse microscopic analyses with minimum perturbation of normal mitotic progression. Adenofection is applicable also to hard-to-infect mouse cells, and suitable for functional analyses of myoblast differentiation into myotubes. Thus adenofection provides a versatile method to perform structure-function analyses of proteins involved in sensitive biological processes that rely on higher-order cytoskeletal dynamics.

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Adenofection: שיטה בחקר התפקיד של מלוויהם מולקולריים הסלולרית Morphodynamics ידי ניסויי דלדול-הצלה

Cellular processes such as mitosis and cell differentiation are governed by changes in cell shape that largely rely on proper remodeling of the cell ...