이 기술을 사용하면 최소한의 조작으로 여러 omics 플랫폼에 사용할 대규모 웜 모집단을 수집할 수 있습니다. 이 기술은 우리가 각 견본의 전체적인 그림을 얻기 위하여 다중 omics 실험에 걸쳐 혼합 단계 C.elegans 인구를 수집할 수 있습니다. 중력 성인을 대규모 배양 판에 표백하기 위해, 벌레가 분젠 버너 위에 픽을 하고, 세균 잔디 가장자리에서 신선한 대장균을 대규모 배양 판에 스쿱하는 데 사용합니다.
스팟 표백을 위해 네 번째 청크 플레이트에서 하나의 그레이드 성인을 선택하고 E.coli 잔디에서 멀리 큰 문화 판의 한 구석에 갓 준비 알칼리성 hypochlorite 용액의 다섯 마이크로 리터를 추가합니다. 중력 성인을 알칼리성 hypochlorite 용액에 넣고 선충을 눌러 큐티클을 방해하고 계란을 방출합니다. 총 5명의 성인이 대장균 잔디 밭 주변에 똑같이 고르게 배치되면 뚜껑을 접시에 다시 놓습니다.
대규모 배양 판에서 샘플을 수확하려면 M9 용액 50 밀리리터를 하나의 대규모 배양 판 표면에 붓고 플레이트를 소용돌이쳐 M9이 전체 선충 성장 매체 아가로즈 표면을 덮도록 합니다. M9을 가진 멸균 세리컬 파이펫을 프라임하고 M9및 벌레 인구가 접시의 한 구석에 모일 수 있도록 접시를 기울입니다. 프라이밍 파이펫을 사용하여 웜 서스펜션을 흡인하고 웜을 50밀리리터 원문 튜브에 추가합니다.
튜브를 로커에 놓고 세균 덩어리와 파편을 방해합니다. 모든 벌레가 세 개의 플레이트에서 수집되었을 때, 각 튜브에서 15 밀리리터의 벌레를 각각 3개의 15 밀리리터 원모 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 튜브의 벌레를 퇴적시합니다. 조심스럽게 웜 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼 네이넌트를 흡인하고 각 튜브에 13 밀리리터의 벌레 현탁액을 추가하십시오.
튜브를 뒤집어 펠릿을 다시 중단하고 가능한 한 많은 박테리아와 파편을 씻어 내고 벌레를 다시 원심분리하십시오. 각 전체 웜 개체수가 수집되면 세척당 신선한 M9 용액 10밀리리터에서 벌레 펠릿을 세 번 세척하십시오. 마지막 세척 후, 이중 증류수 10 밀리리터에 각 청소 된 벌레 펠릿을 다시 중단합니다.
인구 크기 추정의 경우, 샘플당 900 마이크로리터의 M9 용액으로 각 튜브에서 웜 샘플 의 3 개의 100 마이크로 리터 알리쿼트를 신속하게 희석하고 알리쿼트를 사용하여 직렬 희석을 만듭니다. 알리쿼트가 계산되는 동안 배양물의 지속적인 이동을 위해 로커에 스톡 웜 샘플 서스펜션을 배치하고 웜 희석을 균일할 때까지 혼합합니다. 첫 번째 1개에서 10개의 웜 샘플에서 5개의 마이크로리터를 유리 현미경 슬라이드에 추가하고 가벼운 현미경으로 벌레를 계산합니다.
샘플에 50개 미만의 웜이 있는 경우 1:100 및 1:1, 000 희석제수를 계산합니다. 50개 이상의 웜이 있는 경우 다음 직렬 희석으로 이동합니다. 각 희석복제의 각 알리쿼트 복제를 세번 계산한 후 희석 수를 평균하여 웜의 예상 인구 크기를 결정합니다.
그런 다음 웜 샘플을 적절한 실험 알리쿼트로 분할하고 플래시는 영하 80도 저장을 위해 액체 질소의 샘플을 동결합니다. 대형 입자 흐름 세포측정을 위한 웜 샘플을 준비하기 위해, M9 용액의 10 밀리리터의 최종 부피에 4개의 혼합 단계 웜 알리쿼트에 약 5회 10회 희석하고 밀리리터 E.coli당 1밀리그램의 200 마이크로리터를 추가하고 0.5 마이크로몰라 적색 형광 마이크로스피어용 용액을 0.5 마이크로몰라 의 희석을 허용한다. 흔들로 실온에서 20 분 인큐베이션 후 원심 분리에 의해 벌레와 미세 구를 수집하고 과도한 박테리아와 내부화 되지 않은 마이크로 스피어를 제거하기 위해 신선한 M9 용액으로 벌레를 두 번 세척하십시오.
두 번째 세척 후, M9 용액의 5 밀리리터에 펠릿을 다시 놓습니다. 펠릿이 깨끗해 보이는 경우, 벌레에 50 밀리마일라 나트륨 아지드로 보충된 M9의 5밀리리터를 추가하고 정확한 계산 및 크기 조정을 위해 벌레를 곧게 펴고 안락사시키기 위해 로커에 튜브를 놓습니다. 인구 분포 문서의 경우 보정된 384웰 플레이트 템플릿을 열고 20개의 게이트된 개체를 4개의 우물로 분배하도록 템플릿을 설정하여 샘플의 20bar 영역에 대해 각 게이트 영역의 4개의 기술 복제본을 얻습니다.
40밀리리터의 벌레 샘플을 대형 입자 흐름 사이토미터에 적재하고 시료를 지속적으로 교반하면서 자동으로 샘플을 정렬하기 시작하여 샘플에서 정산을 방지하고 동시에 샘플에서 보정된 384웰 플레이트로 물체를 분배합니다. 전체 샘플을 정렬하고 최대 게이트 영역 수가 384웰 플레이트에 분배되면 사이토미터에서 샘플을 제거하고 계측기를 청소합니다. 대규모 배양 플레이트 방법은 C.Elegans의 15개 균주에서 시험되었으며, 여기에는 카노르하비티스 유전학 센터 돌연변이와 카노르하비티스 엘레간 천연 다양성 자원 야생 균주의 혼합물이 포함되어 있습니다.
이 분석에서, 대규모 배양 플레이트 방법은 약 94, 500 내지 9, 290, 000의 인구 크기를 산출하였다. 기준 균주 PD1074 내의 평균 인구 규모와 균주 전반에 걸쳐 약 240 만 개의 웜이었습니다. 평균 12.2 대규모 배양판 성장일의 과정을 통해 C.elegans 균주 사이의 추정 인구 규모에서 유의한 차이가 발견되지 않았습니다.
PD1074 대규모 배양판은 10~14일 동안 평균 성장 시간으로 전체 혼합 단계 인구로 성장했습니다. 가장 느린 성장 균주는 최대 20 일 동안 증가하고 가장 빠르게 성장하는 균주는 최소 10 일 동안 증가했다. PD1074에 대한 이 샘플 분포에서, 벌레는 큰 입자 흐름 사이토미터에 중력 성인을 통해 L1 단계에서 측정되었다.
샘플 전반에 걸친 인구 분포의 변동에 대한 후속 이미징 및 시각화결과 파이프라인이 C.elegans의 혼합 스테이지 인구를 생성한 것으로 나타났습니다. 샘플 수집 전반에 걸쳐 웜을 정확하게 계산하여 성장과 연구에서 비교할 수 있는 데이터를 얻는 것이 중요합니다. 이 수집 접근법은 C.elegans 인구 내에서 발생하는 복잡한 역학에 대한 이해를 확장하기 위해 RNA 염기서열 분석, 유전체학 및 기타 오믹스 분석에 적용 될 수 있습니다.
이 기술을 통해 우리는 각 샘플의 전체적인 그림을 얻기 위해 여러 omics 실험에 걸쳐 혼합 된 C.elegans 인구를 수집 할 수 있습니다.
