Name: characterization of mlkl-mediated plasma membrane rupture in necroptosis
Uploaded: 2018-08-07T15:00:00.000+00:00
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1. 복제 및 셀 라인 생성
<ol><li>PCR 증폭 NBB 지역 해당 아미노산 잔류물 1-140 (NBB140), 인간 MLKL cDNA에서에 대 한 프레임 표준 제한 효소 기반 복제 oligomerization 도메인 2 x FK506 의무적인 단백질 (2xFKBP 또는 2xFV)와 금성 형광에 하 단백질에 Doxycycline (Dox)-NBB140를 유도할 수 있는 retroviral 벡터 pRetroX-TRE3G-2xFV-금성 (표 1, 그림 1A-B).</li>
	<li>기본 mlkl또는 ripk3-/- mlkl-/- -/- 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 과도 transfection SV40 큰 항 원과 녹색 실험실에서 사용할 수 있는 각 생쥐에서 얻은 불멸 플라스 미드를 표현합니다. ~ 1-2에서 불멸 하 게 셀을 선택, 주 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린과 스, 1mm 나트륨 pyruvate, 표준 조직에서 37 ° C, 5% CO2 에서 불필요 한 아미노산 보충 DMEM에 유지 하 고 문화 인큐베이터입니다.</li>
	<li>SV40 불후 mlkl-/- MEFs 제어 역방향 항생물질 transactivator (rtTA)와 transduce-blasticidin 저항 유전자 (우리의 수정된 플라스 미드)를 포함 하는 플라스 미드에서 표현 하는 레트로 바이러스를 포함 하 고 1에 대 한 치료 5 μ g/mL blasticidin rtTA28안정적으로 표현 하는 셀에 대 한 선택과 주.</li>
	<li>공상 MLKL를 포함 하는 Dox를 유도할 수 있는 retroviral 벡터와 rtTA 표현 MEFs transduce (pRetroX-NBB140-2xFV-금성-순수 하지 않아) 4 μ g/mL puromycin를 사용 하 여 변환 후 1 주 2 일에 대 한 선택.</li>
</ol>2. 라이브 셀 현미경 이미징 Necroptosis MLKL 중재의
<ol><li>플레이트 mlkl-/- NBB140을 표현 하는 MEFs-2xFV-24에서 잘 (1 mL/잘) 당 50, 000 셀의 밀도에서 금성 판, 고 밤새 품 어 (그림 2A). 라이브 셀 자동된 셀 카운팅 ( 재료의 표참조)에 대 한 얼룩 사용 합니다.</li>
	<li>Dox 12 h에 대 한 세포 치료 (0.5 μ g/mL) NBB140의 표현을 유도-2xFV-금성.</li>
	<li>25 nM 멤브레인 스며들 지 않는 녹색 형광 외 25 nM FKBP dimerizer (Dim)와 necroptosis를 유도 표준 DMEM에 ( 재료의 표참조) 염색 (1.2 참조). NBB140에 의해 그들의 원형질 막 무결성은 손상으로 necroptosis를 받고 셀 염료 축적-파열 중재. 3 중 또는 quadruplicate에서 분석을 수행 합니다.</li>
	<li>단일 또는 듀얼 컬러 이미징 시스템 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 necroptosis을 모니터링 하려면 혈관 포유류 조직 문화 인큐베이터에 각각 이미징 장치에 놓습니다.</li>
	<li>소프트웨어를 오픈 ( 재료의 표참조) 곧 스캔 작업 목록에서 일정 탭을 선택. 참고:: 이 프로토콜은 단일 색상 시스템을 사용 하 여 이미징 이지만 비슷한 소프트웨어가 듀얼 컬러 시스템에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>속성 탭에서 "실제 레이아웃" 탭에 "빨리 형광" "쟁반, 그릇, 검색 유형", 그리고 "스캔 패턴"을 선택 합니다.</li>
	<li>"스캔 시간"를 클릭 하 여 "타임 라인" 창에 총 시간 포인트와 수집 (일반적으로 1 수집 1 h 6 12 h, h 또는 빠른-속도 론 necroptosis에 대 한 모든 5 분 마다 0.5 h)의 주파수를 추가 하 고 "응용 프로그램을 선택 하 여 이미지 수집 시작 히 "(빨간 버튼)</li>
	<li>Necroptosis 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 계량 ( 재료의 표참조) ","개체 세기 새로운 분석 배경 수준 이상의 고정 분할 임계값"," 작업 창에서 선택 하 여를 유혹 하 여 결정 될 수 있다는 분석에 사용 된 여러 이미지에 배경 영역에 마우스 커서입니다.</li>
	<li>현재 이미지를 사용 하 여 Previewing를 선택 하 여 형광 개체를 검토 하 고 필요에 따라 임계값 수준을 수정.</li>
	<li>"발사 새로운 분석" 탭을 열어 녹색 형광 카운트를 통합, "시간 범위"를 선택, 선택 분석 "분석 작업 이름"를 입력 하 고 "확인"을 눌러 하 웰 스.</li>
	<li>액세스 각 작업 이름을 두 번 클릭 하 고 외부 그래픽 소프트웨어에서 추가 분석을 위해 그래프/내보내기 창에서 내보내기로 "분석 작업" 탭에서 데이터를 분석 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>녹색 형광 긍정적인 (+ ve)으로 데이터 카운트/m m2 을 quantitate 또는 합류 하 여 카운트를 정상화 하 고 녹색 형광 + ve 카운트/합류로 데이터를 표현 한다.</li>
	<li>필요에 따라 실험 끝점에서 100 셀 얼룩 막 permeant 녹색 형광의 nM 염색 ( 재료의 표참조). 끝점에서 녹색 형광/녹색 형광의 비율로 서 %necroptotic 셀으로 데이터를 정상화.</li>
</ol>3. 라이브 셀 Confocal 현미경 이미징 플라즈마 멤브레인 모집 및 MLKL에 의해 Permeabilization의
<ol><li>플레이트 mlkl-/- NBB140을 표현 하는 MEFs-2xFV-유리에 잘 (0.5 mL/잘) 당 20000 셀의 밀도에서 금성 4 잘 현미경 챔버와 PBS에서 30 분 동안 37 ° C에서 50 µ g/mL fibronectin 청소용된 바닥, ~ 12 h ( 에 대 한 품 어 그림 2B).</li>
	<li>Dox 셀 치료 (0.5 μ g/mL) ~ 12 h NBB140의 표현을 유도를 위한-2xFV-금성.</li>
	<li>Necroptosis 25 포함 된 신선한 매체 (1 mL/음) 잠복기에 의해 유도 nM NBB140유도 Dim-2xFV-금성 활성화와 전 좌 원형질 막에.</li>
	<li>환경 제어와는 63 거꾸로 스탠드에 내장 하는 confocal 현미경 검사는 회전 디스크 레이저 챔버 위 1.4 나 목표 수집 선택의 소프트웨어를 사용 하 여 이미징 시작 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>소프트웨어를 초기화, 선택 하 고 "포커스" 아이콘과 YFP 필터 구성 (여기 파장 515 nm).</li>
	<li>보기의 필드와 초점 비행기를 찾아서 "명확한 초점" 탭을 사용 하 여 시스템을 유지 관리 하는 초점을 참여.</li>
	<li>수집을 시작 하려면 다음 필터 구성, 적절 한 EMCCD 카메라 노출 시간과 강화, 및 이득 취득의 길이 간격을 포함 하 여 시간 경과 인수 매개 변수 할당 "캡처" 탭을 선택 합니다.</li>
	<li>형광 NBB140의 세포질 재분배를 모니터링-2xFV-necroptosis 인수 동안 금성 단백질 이미지 마다 10 EMCCD 카메라 (동영상 1) 515 nm 레이저를 사용 하 여 s. 참고: Photobleaching 형광 단백질 영상과 관심사 이다. 금성은 photobleaching29에 더 강한 형광 단백질 중 하나입니다. 형광 단백질 photobleaching에 더 취약을 사용 하는 경우 이미지 매일 30 s 이상 이미징 시간 포인트 사이의 신호의 복구를 허용 하도록.</li>
	<li>NBB140의 플라즈마 멤브레인 협회를 모니터링 하려면-2xFV-necroptosis, 동안 금성 이미지 마다 10의 샘플 준비 3.3에서 총 내부 반사 형광에 의해 사용 하 여 자동화 된 TIRF 슬라이더를 갖춘 현미경 (TIRF) 현미경 및 100 X 1.4 나 목적 그리고 EMCCD 카메라 (동영상 2). 단계 3.5-3.7, 하지만 현미경 챔버의 샘플 및 아래쪽 유리 두께 따라 TIRF 초점 탭 TIRF 각도 조정. 참고: LCK-C-RFP와 같은 플라즈마 멤브레인 마커로 사용할 수 있습니다 컨트롤로 TIRF 분석에서 플라즈마 멤브레인 지역화.</li>
	<li>가우스 함수 (마 알고리즘)의 부정적인 정규화 된 두 번째 파생 된 회선으로 품질을 향상 시키기 위해 처리 하는 이미지를 수행 합니다.</li>
</ol>4입니다. 전자 현미경 검사 법
<ol><li>플레이트 mlkl-/- NBB140을 표현 하는 MEFs-2xFV-플라즈마 코팅 150 m m에 5 백만 셀의 밀도에서 금성 문화 접시를 셀, 12 h (그림 3)에 대 한 품 어.</li>
	<li>Doxycycline 셀 치료 (0.5 μ g/mL) 주의1-140의 표현을 유도-2xFV-12 h에 대 한 비너스.</li>
	<li>유도 NBB140-2xFV-금성 활성화 및 25와 원형질 막에 전 5 분 동안 homodimerizer의 nM. 이 이번 라이브 셀 이미징에 관찰 하는 necroptosis의 활동에서 설정 됩니다.</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 10 mL의 2.5%도, 2% paraformaldehyde 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 ph 7.4 (cacodylate 버퍼) 37 ° c.에 미리 예 열을 사용 하 여 셀을 수정</li>
	<li>된다고 하 여 샘플을 수집 하 고 500 x g에서 10 분에 대 한 샘플을 회전. 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼에 1.5% 칼륨 ferrocyanide 감소 2% 오스뮴 tetroxide에 1.5 h에 대 한 샘플 접미사 오스뮴 tetroxide 얼룩 에이전트에서에서 널리 이용 된다 가장 대비를 제공 하는. 우리는 SEM 셀 necroptosis를 겪고 전에 예비 분석으로 가장을 사용 합니다.</li>
	<li>500 x g, 린스 버퍼에 다음에 5 번 5 분 초순에에서 샘플을 린스 (4.6 참조), 물, 그리고 자동 프로세서에 에탄올. 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>SEM에 대 한 1 %uranyl 아세테이트와 aspartate 중 금속 얼룩31이전 고정된 샘플 얼룩.</li>
	<li>탈수 알코올 및 프로필 렌 산화물 솔루션의 등급된 시리즈를 통해 샘플.</li>
	<li>하드 수 지 수 지 블록을 얻기 위해32 에 샘플을 포함 합니다.</li>
	<li>분석의 올바른 영역을 결정 하는 0.5 μ m의 두꺼운 부분을 잘라.</li>
	<li>전기 전도성 금속 (리 듐)의 초박형 필름으로 샘플 코트.</li>
	<li>이미지 및 분석 샘플 (그림 3). 정량화, 대 한 수 지 블록 표면에 노출 된 세포의 낮은 확대 이미지 5에서 스캔 되는 전자 현미경을 사용 하 여 케빈.</li>
	<li>SEM으로 촬영 된 개별 이미지에 걸쳐 세포를 시각화 하거나 이미징 소프트웨어 하나의 연속 이미지30으로 여러 분야의 보기 가입 활용 될 수 있습니다. 대략 100 셀 셀 선택의 소프트웨어에 고해상도 몽타주를 생성 하 여 이러한 방식으로 necroptosis를 겪고의 분수를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 ( 재료의 표참조). 참고: 미리 괴 사 성 또는 괴 사 성 고기의 진행과 정상 세포 기능 비교 SEM으로 괴 사 성 형태를 채 점 합니다. 이러한 기능에는 원형질 막 변경 microvilli 실종을 포함 하 여, 병합, 10에서 배열 하는 셀에 파열 nm 1 µ m 크기, 또는 적어도 30-40%의 cytosolic 셀 영역에 걸쳐 세포 기관이 구조의 손실.</li>
</ol>5. 핵 자기 공명 (NMR) 분광학에 의해 MLKL의 지질 바인딩
<ol><li>15N 표시 NBB1-156 표준 단백질 표정 및 앞에서 설명한24로 정화 하 여 준비 합니다.</li>
	<li>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol 염화 소금 (18:0 PI), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) 염화 소금 (18:1 PI) 얼음 처럼 차가운 CHCl3 각 1 mg/mL의 최종 농도 대 한 500 µ L에 500 µ g을 분해.</li>
	<li>1 mg/mL 18:0, 18:1 실내 온도에서 1 분 동안 쥡니다 물 욕조에 PI를 sonicate 또는 얼음 물 혼합물에 5 분까지.</li>
	<li>
Aliquot 1 mg/mL 18:0 고 개별 NMR 적정 시리즈 (그림 4)에 대 한 깨끗 한 유리 튜브로 18:1 PI. 유리 밀폐 주사기를 사용 하 여 유기 용 매에 있는 전송 지질.
	<ol>
<li>1 mg/mL 18:1 PI의 aliquot 132 µ L (어 금 니 질량 = 880.137 g/mol) CHCl3 125 µ M 농도에서 1200 µ L의 최종 물의 resuspension 볼륨에 대 한. 참고: 5mm NMR 튜브에 대 한 준비의 직렬 희석 볼륨 > 1000 µ L 및 최종 NMR 샘플의 볼륨 > 500 µ L. 3mm NMR 튜브에 대 한 준비의 직렬 희석 볼륨 > 300 µ L 및 최종 NMR 샘플의 볼륨 > 150 µ L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 1 mg/mL 돼지 뇌 L-α-phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 염화 소금 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (뇌 PI (4, 5) P2) 깨끗 한 유리 튜브에.</li>
	<li>아르곤 (Ar) 또는 질소 (N2) 유리 유리병 벽에 튀는 없이 유기 용 매를 증발을 적당 한 흐름의 가스 스트림 아래 튜브를 배치 합니다. 5 ~ 30 분 양의 10-200 µ L 유기 용 매에 대 한 일반적으로 충분 하다.</li>
	<li>정렬 유리 vial(s) Büchner 또는 큰 족집게를 사용 하 여 진공 플라스 크의 하단에는 고무 마와 인감 및 진공 라인에 연결 하는 플라스틱 튜브를 연결. 잔여 유기 물 제거를 하룻밤 가벼운 진공 아래 플라스 크 철수</li>
	<li>불활성 가스와 지질 영화 aliquots 오버레이, 밀폐 뚜껑으로 밀봉 하 고 장기 저장을 위해 사용 1 개월 이내 또는-80 ° C-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>세제 없이 NMR 샘플 버퍼 준비 (-Det) 20mm 나xHy포4 pH 6.8, 10% D2O와 20mm 나xHy포4 pH 6.8를 포함 하는 세제 (+ Det) 포함 된 10% D2O, 0.34 m m n-라우릴-β-D-maltopyranoside (DDM).</li>
	<li>추가 + 원하는 농도 달성 하 여 최대 30 분, 10 분 동안 쥡니다 번갈아 물 목욕에서 sonicate 지질 영화와 유리 유리병에 Det 버퍼 다음 검사. 참고: 쥡니다 샘플을 따뜻하게 수 있습니다. 최종 단백질 샘플 재구성 하기 전에 15 분 동안 실내 온도에 냉각 수 있습니다.</li>
	<li>지질 세제 micelles + 1:1 혼합물의 쥡니다를 사용 하 여 원하는 농도 시리즈에 대 한 Det 버퍼의 직렬 희석을 수행 합니다. 125 µ M 지질 농도에서 시작, 3 개의 반복 62.5 µ M, 31.3 µ M, 및 0.34 m m DDM 15.6 µ M 지질 얻을 것입니다.</li>
	<li>제어를 준비 하 고 단백질과-Det에 첨가제의 NMR 샘플을 참조 하 고 + Det 버퍼, 각각. 단백질 및 지질에의 각 희석에 첨가제 + Det 버퍼 추가 합니다. 참고: 15N NBB156, 단백질은 40 µ M의 최종 농도에 추가 및 Cys의 잔류물 감소 계속 2mm deuterated dithiothreitol 보충.</li>
	<li>3mm 또는 5mm NMR 튜브 (단계 5.4에서에서 참고 참조)을 샘플의 적절 한 볼륨을 전송 합니다.</li>
	<li>수동으로 NMR 악기에서 샘플 로드 하거나 SampleCase 로더 같은 자동화 플랫폼에 정렬 합니다.</li>
	<li>2D 1H-15N 상관 관계 스펙트럼 뒤에 최적화 된 가로 휴식 분광학 (TROSY)으로 품질 관리로 1H 양성자 스펙트럼에 대 한 표준 펄스 프로그램을 사용 하 여 복합 NMR 스펙트럼을 취득 또는 heteronuclear 여러 양자 일관성 (SOFAST-HMQC)33. 참고: 3 mm NMR 튜브의 사용 1 H-15N TROSY (3 h) 또는 1H-15N SOFAST-HMQC (~ 90 분) 64 검사 필요합니다. 스캔 5mm NMR 튜브에 대 한 숫자를 절반 가까이 떨어졌다.</li>
	<li>처리 된 2D NMR 스펙트럼 분석 또는 사용자에 게 선택의 다른 소프트웨어에 대 한 카라 저장소34 에 추가할 수 있습니다.</li>
	<li>
각 단백질 상태에 대 한 3 개의 잘 분산 및 해결 피크에 대 한 2D NMR 공명 하 여 소프트웨어를 분석 합니다. NBB156 (그림 5A)를 포함 하는 각 버퍼 조건에 대 한 6 개의 봉우리의 각 피크 진폭을 기록 합니다.
	<ol>
<li>카라를 사용 하 여 일괄 통합 목록 준비 (클릭 메인 메뉴 제목 "스펙트럼 | 설치 일괄 처리 목록 "...) 모든 스펙트럼의 수집 하 고 단일 피크 할당 파일을 사용 하 여 분석 (클릭 메인 메뉴 제목 "봉우리 | Peaklist 가져오기".. 그리고 6 총 봉우리, 3 내에 정의 된 각 단백질 상태에 대 한 사용자 정의 된.peaks 파일을 선택).</li>
		<li>설정을 조정 ("통합 | 조정 피크 모델 "...) X-폭의 0.06 p p m과 Y-폭 0.30 p p m (클릭 메인 메뉴 제목 "통합 | 조정 피크 모델 "...) 두 메뉴 선택 (1에서에서 최종 출력을 기록 하기 전에. 메인 메뉴 제목 클릭 "통합 | 통합 배치 목록") (2. 메인 메뉴 제목 클릭 "봉우리 | 통합 테이블 내보내기") (그림 5B). 참고: 잔류물 M21, V53, 및 L105의 등뼈 아 미드 공명 NBB156 폐쇄 중괄호 상태에 대 한 할당 되었습니다. 오픈 중괄호 상태 G130 및 A141 잔류물의 등뼈 아 미드 공명과 엡실론 양성자 사이드 체인의 공명 W133 3D NMR 실험24를 사용 하 여에 할당 했다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 오픈 중괄호 진폭 참조 샘플의 평균 관련 된 두 개의 참조 정규화 요소를 계산 하 여 다른 자석 또는 샘플 조건에서 직접 비교를 위해 샘플을 정상화. NBB156 공명 정규화 요소 설정 부정적인 진폭을 사용 하 여 0 (표 2)에 대 한 확장 된 진폭을 계산 합니다. 예제: 1) 다른 자석에서 샘플 비교: 자석 A, NBB156DDM과 자석 B, NBB156+ DDM. 2) 세제 비교: 0.34 m DDM m 및 1.7 mM DDM.</li>
	<li>환산된 분수의 폐쇄-또는 오픈-중괄호 모든 스펙트럼의 최소 최대에 진폭의 범위와 함께 나누어 수집 무료 NBB156 와 완전히 오픈 중괄호 NBB156 에 적절 한 참조를 포함 하는 각 공명에 대 한 계산 세제입니다.</li>
	<li>지질 농도의 기능으로 정규화 NMR 진폭을 플롯 하 고 오픈 중괄호 NBB156 다른 조건 (그림. 5 C)에서 일부를 비교 합니다. 참고: 또는, 지질 농도 대 한 폐쇄 중괄호 구조의 분수의 분석 수행할 수 있습니다 NBB156에 지질 바인딩 비교 하. 우리는 때문에 더 빠른 더 나은 보고서는 분수에 완전히-약혼 지질에 의해 전 분석을 선호 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+blocks+early+postnatal+lethality+mediated+by+caspase-8+and+RIPK3.">RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3.</a> Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).</li><li>Rickard, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+regulates+RIPK3-MLKL-driven+systemic+inflammation+and+emergency+hematopoiesis.">RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis.</a> Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).</li><li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+3-mediated+necrosis+via+TRIF,+RIP3,+and+MLKL.">Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).</li><li>Upton, J. W., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAI+Another+Way:+Necroptotic+Control+of+Viral+Infection.">DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection.</a> Cell Host &amp; Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).</li><li>Tanzer, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brace+helices+of+MLKL+mediate+interdomain+communication+and+oligomerisation+to+regulate+cell+death+by+necroptosis.">The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plug+release+mechanism+for+membrane+permeation+by+MLKL.">A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL.</a> Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).</li><li>Dondelinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+compromises+plasma+membrane+integrity+by+binding+to+phosphatidylinositol+phosphates.">MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates.</a> Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).</li><li>Llambi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BOK+Is+a+Non-canonical+BCL-2+Family+Effector+of+Apoptosis+Regulated+by+ER-Associated+Degradation.">BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation.</a> Cell. 165 (2), 421-433 (2016).</li><li>Malkani, N., Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+secrets+of+fluorescent+proteins:+distinct+bleaching+in+various+mounting+fluids+and+photoactivation+of+cyan+fluorescent+proteins+at+YFP-excitation.">Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation.</a> PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).</li><li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+workflow+for+the+automatic+segmentation+of+organelles+in+electron+microscopy+image+stacks.">A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).</li><li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+aspartate,+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology.">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).</li><li>Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15N+and+13C-+SOFAST-HMQC+editing+enhances+3D-NOESY+sensitivity+in+highly+deuterated,+selectively+[1H,13C]-labeled+proteins.">15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).</li><li>Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+computer+aided+resonance+assignment+tutorial.">The computer aided resonance assignment tutorial.</a> Cantina Verlag. , (2004).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+sequence+determinants+control+human+and+mouse+receptor+interacting+protein+3+(RIP3)+and+mixed+lineage+kinase+domain-like+(MLKL)+interaction+in+necroptotic+signaling.">Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).</li><li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+the+necroptosis+effector+MLKL.">Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).</li></ol>

우리는 우리가 MLKL 플라즈마 막 파열24의 putative 사형 집행으로 연루 결합 기술에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. MLKL이 중재 necroptosis 규제 규제 네트워크 해독, 뿐만 아니라 이러한 기술은 사용할 수 있습니다 하지 독립적으로 다른 적당 한 생물 학적 시스템의 특성. 실질적으로 말하자면, 이러한 기술은 매체-낮은 처리량 검색 도구입니다.
우리는 정기적으로...

Necroptosis의 유전자 구성 요소를 식별 생리학과 질병1,2,3,,45necroptosis의 의미를 테스트 동물 모델의 사용을 촉진 했다. 녹아웃 쥐에 RIPK3 또는 MLKL의 제안 하는 necroptosis는 생활3,6에 대 한 필수적인 개발 및 성인 항상성에서 최소한의 의미를 했다. 또한, 특정 종 동물7,8necroptosis의 비 본질적인 역할을 지 원하는 RIPK3 또는 MLKL 유전자를 포함 하지 않습니다. 다른 한편으로, 염증, 타고 난 면제 및 바이러스 감염9,10, necroptosis의 중요 한 역할을 계시 했다 다양 한 병 리 실험실에서 유도 된 녹아웃 동물 모델 도전 11 , 12.
Necroptosis는 여러 가지 방법으로 다른 타고 난 면역 센서를 통해 신호에 의해 활성화 될 수 있다 RIPK31,,1314의 활성화에 결과의 모든. Active RIPK3에서 phosphorylates 및 MLKL3,,45,6,7,,89,10 를 활성화 11,12,13,14,15,,1617,18. 가장 공부 하 고 아마도 가장 복잡 한 방법, RIPK3의 활성화로 이어지는 죽음 수용 체 결 찰, 분기는 apoptosis 또는 necroptosis1을 유도 하거나 신호 복합물의 다운스트림 구성에 따라 포함 됩니다. Necroptosis 때 RIPK1를 통해 신호 선호 RIPK319,20의 교전에서 결과 인가요. 이 결과 쉽게 약리 억제 또는 caspase 8, 베이에서 necroptosis을 유지 하는 necroptosis의 상 상속 생 억제제의 유전 삭제 시 선호 합니다. RIPK1을 하 고 RIPK3를 활성화 합니다. 또 다른 방법은 necroptosis 활성화 하입니다 수용 체 통행세 같이 TLR3/TLR4 신호, 종사 하 고 유도 하는 어댑터 인터페론-β (TRIF) 사격 도메인 포함21를 통해 RIPK3를 활성화. 아직 necroptosis에 의해 죽고 또 다른 방법은 DNA 센서 다이, 직접 종사 하 고 활성화 하는 RIPK322의 활성화입니다.
MLKL는 N 맨끝 나선 번들 (NB) 도메인 및 규제 중괄호 지역3로 연결 단자 pseudokinase 도메인 (psKD)의 구성 cytosolic 단백질 이다. 정상 세포에서 MLKL RIPK314와 비활성 복잡 한에 생각 된다 cytosol에서 발견 된다. Necroptosis의 활성화는 psKD, 그리고 주의 중괄호3,,1523에 잠재적으로 추가 사이트의 활성화 루프에서 MLKL의 RIPK3 인 산화를 트리거합니다. 인 산화 MLKL RIPK314에서 분리 결과에 구조적 변화를 유도 합니다. 불완전 하 게 이해 구조적 변화 psKD24에서 중괄호를 놓습니다. 2 나선 포함, 중괄호, oligomerization MLKL의 C-터미널 나선25통해 putative 삼합체에 중재. 중괄호의 N 맨끝 나선 막 permeabilization24,26필수적 이다 NB 도메인 억제. 격리, NB 도메인은 원형질 막 permeabilization와 necroptosis16,,2427유도 충분 합니다. NB의 프로 necroptotic 활동은 마우스 미 발달 섬유 아 세포 MLKL (mlkl-/- MEFs)의 결핍에서 재구성 된다. NB는 우선적으로 종사 하는 인지질 phosphatidylinositol 4, 5 diphosphate (핍2) 지질 바인딩 도메인입니다. 우리는 어떤 점에서 중괄호 oligomerization 핍2 북극 머리 그룹24NB의 약한 상호 작용을 통해 플라즈마 막에 MLKL의 모집을 용이 하 게 MLKL의 활성화의 stepwise 메커니즘을 제안 했다. 막에서 주의 핍2는 중괄호 비활성 MLKL에 의해 마스크에 대 한 추가 높은 친 화력 바인딩 사이트의 규제 노출을 겪 습. 이러한 이벤트의 분자 메커니즘 해명 하지는 있지만 전반적으로, 핍2 NB의 여러 상호 작용 원형질 막의 파열으로 이어지는 불안정.
여기 우리 necroptosis24의 사형 집행으로 MLKL의 기능을 특성화 하는 데 사용 하는 특정 방법을 설명 합니다. 특히, 우리는 MLKL, NB (NBB), 중괄호는 중괄호 억제에 의해 규제 및 적용된 이합체 화 유도 플라즈마 막 파열 및 necroptosis를 통해 활성화 될 수 있다의 가장 최소한의 도메인에 초점. 우리는 우리의 유도할 수 있는 식 시스템 적용된 약물 유발 FKBP 중재 이합체 화 라이브 셀 이미징, 및 necroptosis를 받고 세포의 전자 현미경과 함께 설명 합니다. 또한, 우리 우리의 생체 외에서 NMR 분석을 phosphatidylinositols (PIPs)와 NBB의 상호 작용을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cloning and cell line generation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRetroX-TRE3G</td><td>Clontech</td><td>631188</td><td></td></tr><tr><td>Tet-On transactivator plasmid</td><td></td><td></td><td>Llambi &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2016</td></tr><tr><td>Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/-</td><td></td><td></td><td>Dillon &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2014</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell death quantification and live-cell microscopy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Clontech</td><td>631311 CAS# 24390-14-5</td><td></td></tr><tr><td>B/B Homodimerizer AP20187</td><td>Takara</td><td>635059 CAS# 195514-80-8</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NMR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 N Ammonium Chloride</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Deuterated DTT</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2622-1</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium Oxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&amp;beta;-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 CAS# 69227-93-6</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X CAS# 383907-42-4</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850143 CAS# 849412-67-5</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850149 CAS# 799268-53-4</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specialized Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte FLR or ZOOM</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td></td><td>Live-cell microscopy imaging</td></tr><tr><td>Helios NanoLab 660 DualBeam&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Electron microscope</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td>http://www.essenbioscience.com</td><td>Imaging analysis</td></tr><tr><td>FEI MAPS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>https://www.fei.com/software/maps/</td><td>EM analysis</td></tr><tr><td>TopSpin v3.2</td><td>Bruker BioSpin</td><td>http://www.bruker.com</td><td>NMR data collection</td></tr><tr><td>CARA v1.9.1.7</td><td></td><td>http://cara.nmr.ch/&amp;nbsp;</td><td>NMR data analysis</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i (Intelligent Imaging Innovations)</td><td>https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td><td>Confocal microscopy</td></tr></tbody></table>

characterization of mlkl-mediated plasma membrane rupture in necroptosis

Necroptosis는 단백질 키 니 아 제 3 (RIPK3), phosphorylates 및 혼합된 계보 니 같은 도메인 pseudokinase, MLKL, 파열 또는 permeabilize 원형질 막 활성화는 상호 작용 하는 수용 체의 활성화에 의해 트리거되는 프로그램된 한 세포 죽음 통로 . Necroptosis 면역, 감염 및 심장 혈관 질환, 뇌졸중, neurodegeneration, 그리고 암 등 여러 병 리와 관련 된 염증 통로 이다. 여기, 우리는 necroptosis에 플라즈마 막 파열의 사형 집행으로 MLKL 특성을 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 우리 전통과 공초점 형광 현미경 검사 법, 함께 라이브 셀 이미징 사용 하 여 셀에 함께 계시는 플라즈마는 cytosol에서 MLKL의 재배포 전자 현미경을 사용 하 여 고정된 셀에 necroptosis의 과정을 시각화 원형질 막에 큰 구멍의 유도 전에 막. 핵 자기 공명 (NMR) 분석 생체 외에서 지질을 사용 하 여 necroptosis MLKL 중재의 putative 변조기를 식별 하는 선물이. 이 방법에 따라, 우리 됨으로 양적 지질 바인딩 환경과 phosphatidyl-이노 시 톨 인산 염 (PIPs) MLKL의 원형질 막 지정 하 고 necroptosis에 permeabilization에 필요한 중요 한 바인더.

라이브 셀에서 레 귤 레이트 된 necroptosis 실행 시각화 하는 최소한의 잘린된 MLKL 구문, NBB140의 유도할 수 있는 표현을 통해 가능 했습니다-2xFV-금성. 이 구조 원형질 막 permeabilization 유도 하는 기능을 유지 하 고 FKBP 카세트 (2xFV)의 oligomerization Dim 유도 통해 활성화 됩니다. 우리는 관찰 하 고 라이브 셀 현미경 이미징, 모니터링 운동 (5 분 마다) 셀 스며들 지 않는 녹색...

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Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

우리는 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 및 NMR 기반 지질 바인딩 전통과 confocal 라이브 셀 현미경 이미징를 포함 하는 necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 방법 보고.

Necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 특성

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

characterization-mlkl-mediated-plasma-membrane-rupture

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K 조회수.  St. Jude Children's Research Hospital. 우리는 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 및 NMR 기반 지질 바인딩 전통과 confocal 라이브 셀 현미경 이미징를 포함 하는 necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 방법 보고.

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Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of nuclear apoptotic characteristics, including chromatin condensation and DNA breakage. Once the MMP collapses, cell apoptosis will initiate irreversibly. A series of lipophilic cationic dyes can pass through the cell membrane and aggregate inside the matrix of mitochondrion, and serve as fluorescence marker to evaluate MMP change. As one of the six members of the Cl- intracellular channel (CLIC) family, CLIC4 participates in the cell apoptotic process mainly through the mitochondrial pathway. Here we describe a detailed protocol to measure MMP via monitoring the fluorescence fluctuation of Rhodamine 123 (Rh123), through which we study apoptosis induced by CLIC4 knockdown. We discuss the advantages and limitations of the application of confocal laser scanning and normal fluorescence microscope in detail, and also compare it with other methods.

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Here we present a detailed protocol for the application of rhodamine 123 to identify the mitochondrial membrane potential (MMP) and study CLIC4 knockdown-induced HN4 cell apoptosis in vitro. Under common fluorescence microscope and confocal laser scanning fluorescence microscope, the real-time change of the MMP was recorded.

CLIC4 최저 유도 HN4 세포 Apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

연구

암 연구학

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

면역학 및 감염병학

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

신경과학

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical regulators of necroptosis, an inflammatory form of cell death with important antiviral functions. Autophosphorylation of RIPK3 induces phosphorylation and activation of the pore-forming executioner protein of necroptosis MLKL. Trafficking and oligomerization of phosphorylated MLKL at the cell membrane results in cell lysis, characteristic of necroptotic cell death. The nucleic acid sensor ZBP1 is activated by binding to left-handed Z-form double-stranded RNA (Z-RNA) after infection with RNA and DNA viruses. ZBP1 activation restricts virus infection by inducing regulated cell death, including necroptosis, of infected host cells. Immunofluorescence microscopy permits the visualization of different signaling steps downstream of ZBP1-mediated necroptosis on a per-cell basis. However, the sensitivity of standard fluorescence microscopy, using current commercially available phospho-specific antibodies against human RIPK3 and MLKL, precludes reproducible imaging of these markers. Here, we describe an optimized staining procedure for serine (S) phosphorylated RIPK3 (S227) and MLKL (S358) in human HT-29 cells infected with herpes simplex virus 1 (HSV-1). The inclusion of a tyramide signal amplification (TSA) step in the immunofluorescent staining protocol allows the specific detection of S227 phosphorylated RIPK3. Moreover, TSA greatly increases the sensitivity of the detection of S358 phosphorylated MLKL. Together, this method enables the visualization of these two critical signaling events during the induction of ZBP1-induced necroptosis.

Tyramide signal amplification during immunofluorescent staining enables the sensitive detection of phosphorylated RIPK3 and MLKL during ZBP1-induced necroptosis after HSV-1 infection.

인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

생물학

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous research indicated that multiple pathways could mediate the spontaneous death of neutrophils. A cocktail was developed by simultaneously targeting these pathways, caspases-lysosomal membrane permeabilization-oxidant-necroptosis inhibition plus granulocyte colony-stimulating factor (CLON-G), which prolonged the neutrophil lifespan to greater than 5 days without significantly compromising the neutrophil function. Concurrently, a reliable and stable protocol for assessing and evaluating neutrophil death was also developed. In this work, we show that CLON-G can prolong the neutrophil lifespan in vitro to more than 5 days, and we exhibit the lengthening of the neutrophil lifespan with FACS and confocal fluorescence microscopy. This report introduces procedures for the preparation of CLON-G and showcases an in vitro spontaneous death assay of neutrophils, which can be used for the study of neutrophils and for subsequently interrogating neutrophil death, thus providing a reliable resource for the neutrophil community.

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

This protocol details the preparation of CLON-G to extend the neutrophil lifespan to greater than 5 days and provides a reliable procedure for evaluating neutrophil death with flow cytometry and confocal fluorescence microscopy.

CLON-G 및 In Vitro Spontaneous Death Assay를 통한 호중구 수명 연장

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...

THP-1 세포에서 LPS/ATP 유발 세포 사멸 메커니즘 분석

LPS and ATP-induced Death of PMA-differentiated THP-1 Macrophages and its Validation

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)-differentiated lipid deposition in human monocyte (THP-1) macrophage model to observe cell death. LPS combined with ATP is a classic inflammatory induction method, often used to study pyroptosis, but apoptosis and necroptosis also respond to stimulation by LPS/ATP. Under normal circumstances, phosphatidylserine is only localized in the inner leaflet of the plasma membrane. However, in the early stages of pyroptosis, apoptosis, and necroptosis, the cell membrane remains intact and exposed to phosphatidylserine, and in the later stages, the cell membrane loses its integrity. Here, flow cytometry was used to analyze Annexin V and 7-Aminoactinomycin D (AAD) double staining to detect the cell death from the whole cells. The results show&#160;that substantial cells died after stimulation with LPS/ATP. Using scanning electron microscopy, we observe the possible forms of cell death in individual cells. The results indicate that cells may undergo pyroptosis, apoptosis, or necroptosis after stimulation with LPS/ATP. This protocol focuses on observing the death of macrophages after stimulation with LPS/ATP. The results showed that cell death after LPS and ATP stimulation is not limited to pyroptosis and that apoptosis and necrotic apoptosis can also occur, helping researchers better understand cell death after LPS and ATP stimulation and choose a better experimental method.

저자 스포트라이트: LPS/ATP에 대한 THP-1 대식세포 반응 — Pyroptosis, Apoptosis, and Necroptosis Spectrum 발표

This protocol is based on LPS and ATP-induced death of PMA-differentiated THP-1 macrophages. We use flow cytometry to analyze Annexin V and 7-AAD double staining to detect cell death, using the whole cell and employing scanning electron microscopy to observe the cell membrane morphology.

PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸 및 그 검증

Cell death is a fundamental process in all living organisms. The protocol establishes a lipopolysaccharide (LPS) and adenosine triphosphate (ATP)-induced ...

Necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 특성

요약

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이 비디오의 챕터

CLIC4 최저 유도 HN4 세포 Apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

인간 세포에서 HSV-1 감염 후 RIPK3 및 MLKL의 ZBP1 의존성 인산화의 면역형광염색을 위한 티라마이드 신호 증폭

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

CLON-G 및 In Vitro Spontaneous Death Assay를 통한 호중구 수명 연장

PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸 및 그 검증